论文发表t载体是什么么

T载体连接问题急求!

我要连接嘚基因2.6Kb左右,一直连不上T载体(TaKaRa PMD19-T)用的是Pfu扩的基因,转化菌长出的有不少白斑挑了十几个都是假阳性。请高手指点一下具体怎么操作连接效率高一些!!

  • Pfu扩增的PCR产物是没有A尾的,需要再加A才能连T载体或者PFU扩增结束再用普通Taq 72度延长半小时

  • 楼上说得没错,不过不用那么長时间
    在PCR反应后,补充一点dATP或者dNTP也行,再加入一点普通Taq酶72度10分钟就足够了。
    我一直这么做的效果挺好。最长连接过3.6Kb的插入片段

  • 有假阳性说明载体连接酶都没有问题,感受态也可以那问题就有可能是Puf酶的产物加A问题。
    Puf产物的回收一定干净不能有干扰Taq酶的东西,
    加A产物纯化后快速连接不要放置,A易掉
    大片段连接实在不行用超感。
    慢慢分析别着急问题会解决的。

  • pfu好想不能加A吧应该之后用个加A试剂盒在尾巴上加A再连接吧

  • 请问如何判断是假阳性的呢?酶切电泳还是PCR?

  • P完补加其他Taq保温加尾~

生物技术通报 201 ·研究报告· B10TECHNOLOGYBULLETlN 1年第3期 一种构建新型T载体的简便方法及应用 齐向辉1'2陈辉1 沈琦1 何晨曦1 刘学1 郭齐1 陈华友1 徐虹2 (1江苏大学食品与生物工程学院镇江212013;2南京工业大学材料化学工程国家重点实验室,南京210009) 造为通用的T栽体通过一步反向PCR方法在该载体中插入带有XcmI酶切位点的一段序列,在XcmI酶的切割下产生两端 舍有T核苷酸的线型核苷酸序列最终获得用于克隆PCR产物的T栽体。外源基因xdh克隆试验表明该栽体构建成功此栽 体完全可以用于PCR产物的基因克隆试验,为相关栽体的改造提供了思路 I Xcm 关键词:T栽体一步反向PCR

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