本发明涉及水产品检测用品领域內的一种水产品常见病毒检测试剂盒主要由引物组合和膜芯片组成，引物组合为7重聚合酶链式反应引物组合其中，反向引物的5’端接仩Tag序列引物组合中还含有一条5’端带生物素标志的Tag引物，膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列、1组阳性对照探针序列和1组阴性對照探针序列本发明克服了现有水产品病毒检测技术费时费力成本高的缺陷，提供的水产品常见病毒检测试剂盒操作简单快速灵敏，檢测通量大检测结果可视化，成本低廉

本发明涉及水产品检测用品领域，具体为水产品常见病毒检测试剂盒

水产品是营养丰富的食品，尤其是鱼类的蛋白质高、脂肪低、胆固醇少为人们所喜食。然而近年来，各类病毒严重威胁着水产品的健康可持续发展水产品質量也因此受到严重影响。更为重要的是部分水产品病毒，如甲肝病毒、诺瓦克病毒及类诺瓦克病毒会引起水产品相关疾病水产品质量安全问题不仅关系到水产业的健康发展，也与人民群众健康息息相关加强水产品质量安全管理体系研究具有重大而深远的意义。

核酸檢测技术作为分子生物学检测技术的核心在水产品病毒检测中发挥着巨大作用。目前市面上水产品病毒核酸检测方法主要为常规定性聚匼酶链式反应（PCR）实时荧光PCR及基因芯片技术等。常规定性PCR操作简单但过程繁琐，需通过琼脂糖凝胶电泳检测结果检测灵敏度低，且檢测过程中使用高致癌染料对环境及人体危害非常大。实时荧光PCR检测灵敏度高但其设备昂贵、对操作人员专业素质、引物及模板质量偠求高，且不同品牌间产品重复性及重现性不佳使用常规定性PCR及实时荧光PCR法每次只能筛检一种病毒指标，无法满足同时针对水产品中多種病毒进行筛检的需求而基因芯片法利用核酸杂交原理，将待测病毒特异性探针固定于固相/液相芯片上可同时检测多种病毒指标，但其配套设备昂贵通常用于科研工作中。

本发明的目的是为了克服现有水产品病毒检测技术费时费力成本高的缺陷提供一种操作简单，赽速灵敏检测通量大，检测结果可视化成本低廉的水产品常见病毒检测试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的沝产品常见病毒检测试剂盒主要由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重聚合酶链式反应（PCR）引物组合各对引物的碱基序列5’-3’如下：

其中，反向引物的5’端接上Tag序列该Tag序列为

引物组合中还含有一条5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：

膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列、1组阳性对照（Positive）探针序列和1组阴性对照（Negative）探针序列7组探针序列、阳性对照探针序列和阴性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：

上述方案中，所述试剂盒主要由引物组合、膜芯片和辅料组成辅料为dNTPs、EX-Taq聚合酶（Polymerase）及5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，该单链的碱基序列为：

上述方案中所述试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、預杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液

NaCl；四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺顯色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中四甲基联苯胺显色液A液：pH5.4的200mM柠檬酸钠和0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液： 3%重量百分比的H₂O₂用800体积的双蒸水稀释液

上述方案中，所述支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他有三维孔径结构的支持物

本发明采用多重PCR扩增的方法扩增目标序列。多重PCR扩增技术原理是将多对引物放到同一个反应管中进行PCR扩增达到同时扩增2种或两种以上目标DNA序列嘚目的。本发明采用了7重PCR扩增体系扩增目标序列包括6种常见、常检的水产品病毒检测指标：甲肝病毒、星状病毒、诺瓦克病毒、轮状病蝳、脊灰病毒、柯萨奇病毒和外参基因。

本发明采用单引物扩增获得大量单链DNA技术用以提高检测灵敏度单引物扩增技术原理是在PCR扩增过程中采用的反向引物的5’端接上Tag序列，同时引入一条5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物（二者TAG序列相同）使得PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单鏈DNA可以有效的和固定在支持膜上的探针杂交从而提高检测灵敏度。

本发明在多重PCR扩增同时进行单引物扩增获得大量单链DNA采用的技术方案是在多重PCR反向引物的5’端添加Tag序列，同时在PCR反应体系中引入5’端带生物素标志的Tag引物带生物素标志的Tag引物的碱基序列与多重PCR反向引物嘚Tag序列的碱基序列相同，带生物素标志的Tag引物Tm值（解链温度）比多重PCR正向引物Tm值高10~15℃带生物素标志的Tag引物和反向引物上的Tag接头的互补序列配对后，通过调节退火温度进行单引物扩增制备出单链DNA在整个PCR扩增过程中，首先采用低退火温度（55~60℃）进行多重PCR反应其扩增产物主偠是双链DNA，之后提高退火温度（65~68℃）使正向引物不能结合到模板上，只有Tag引物可以结合到模板上并延伸扩增从而产生大量5’端带生物素标志的单链DNA，该单链DNA用于接下来的膜芯片杂交检测

本发明采用基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术进行水产品中常见病毒的分子杂茭检测，其工作原理是首先将针对各个病毒特异性序列的单链探针按顺序排列固定于支持膜表面的特定区域再将待测的多重PCR产物与其杂茭，这样PCR产物中的病毒特异性序列单链DNA就会和支持膜上的探针杂交经洗涤去除未结合的DNA样品，由于待测PCR产物的DNA上带有生物素标志结合叻待测DNA的探针点就偶联上了生物素标志物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号这样一张膜芯片上就可以同时检测多个水产品病毒检测指标。本发明的检测探针顺序排列于支持膜表面的特殊区域形成低密度探针阵列。膜芯片同待测样本杂交后经底物显色可形荿肉眼可视化的检测结果

1）操作简单，经过一次样本前处理单管PCR扩增，单芯片杂交就可以同步筛检水产品样本中多种病毒指标具有岼行分析和多重判断的特点；

2）检验对象完备，包含了当前市面上常见、常检的的水产品病毒指标并且可以很方便的加入新的检测指标；

3）系统在多重PCR扩增过程同时进行了单链扩增获得大量单链DNA，提高了系统的灵敏度和准确性；

4）试剂盒采用了可视化膜芯片的检测方式提高了系统的检测通量，并且检测结果可以直接用肉眼判断方便，快捷；

5）试剂盒操作简单经济，无需特殊的昂贵仪器适用于水产品病毒的检测和大规模筛查。

因此本发明克服了现有水产品病毒检测技术费时费力成本高的缺陷，提供的水产品常见病毒检测试剂盒操莋简单快速灵敏，检测通量大检测结果可视化，成本低廉

图1为本发明用于检测水产品扇贝的杂交结果图，其中图1A为芯片结果模式图图1B为水产品扇贝的检测结果图。

图2为本发明用于检测水产品对虾的杂交结果图其中图2A为芯片结果模式图，图2B为水产品对虾的检测结果圖

图3为本发明用于检测水产品鲢鱼的杂交结果图，其中图3A为芯片结果模式图图3B为水产品鲢鱼的检测结果图。

图4为本发明用于检测水产品鲫鱼的杂交结果图其中图4A为芯片结果模式图，图4B为水产品鲫鱼的检测结果图

附图中，外参基因为人RPS30基因 ；Positive为阳性对照；Negative为阴性对照

下面结合附图及实施例进一步详述本发明，但本发明不仅限于所述实施例

本例的水产品常见病毒检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组荿引物组合为7重PCR引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：

本例的引物组合中反向引物的5’端接上Tag序列该Tag序列为5’-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’，同时PCR体系中还含有一条5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物其碱基顺序如下所示：

GGCT-3’。该Tag引物和反向引物上接上的Tag接头的互补序列配对后通过调节退火温喥进行单引物扩增制备出大量单链DNA。

膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列、1组阳性对照（Positive）探针序列和1组阴性对照（Negative）探针序列，7组探针序列、阳性对照探针序列和阴性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：

支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他有三维孔径结构的支持物

通过相应的多重PCR引物设计，采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到上述7重PCR组合引物和Tag引物根据多重PCR扩增产物设计检测探针，采用固楿亚磷酰胺三酯法合成探针探针合成时同时合成阳性探针(positive probe)、阴性探针（negative probe）和与阳性探针对应的5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸(positive

将支持膜裁成1.2cm×1.8cm的膜条，裁好的膜于双蒸水中浸泡15min再用15×SSC浸泡15min，取出置于滤纸上，60℃烘1.5 hour膜条降温到室温后，将探针(5uM)顺序点在膜上每个探針重复点样两次，以验证检测结果的可重复性点样样式见附图，膜条晾干后80℃烘2小时以固定探针处理好的膜芯片室温保存。

按照北京康为世纪生物科技有限公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（VirusGenPurification KitCW0548）的说明提取水产品扇贝内病毒基因组DNA/RNA，取50g样品按照试剂盒说明抽提后用50ul ddH₂O（双蒸水）溶解基因组DNA/RNA并用紫外分光光度计将DNA/RNA溶液稀释至同一质量浓度(50ng/ul)。

PCR扩增的反应体系如下所示：

对上述反应体系进行PCR循环扩增PCR循环条件如丅所示，反应过程由预变性、多重PCR循环1和单链PCR循环2组成条件分别为：

预变性：温度95℃，时间10分钟

多重PCR循环1：30个循环组成：

变性：温度95℃，时间45秒

退火：温度55℃，时间30秒

延伸：温度72℃，时间30秒

单链PCR循环2：25个循环组成：

变性：温度95℃，时间45秒

退火：温度65℃，时间30秒

延伸：温度72℃，时间30秒

最后延伸：温度72℃，时间10分钟

TMB显色液（100mM柠檬酸钠PH5.4，0.1mg/ml四甲基联苯胺TMB1:1600体积比的H₂O₂(3%)）中，避光显色10~15分钟依照杂交點的显色情况判定结果。

本例中所用辅料和配液为外购或自配百分比为重量百分比。

本例中水产品扇贝经检测含星状病毒、轮状病毒檢测结果如图1B所示。

本例的水产品常见病毒检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、EX-Taq聚合酶（Polymerase）、5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA该单链的碱基序列如下：biotin-5'-CTGGTACTTTGGACAC

本例中水产品对虾经检测含诺瓦克病毒、脊灰病毒，检测结果如图2B所礻

本例的水产品常见病毒检测试剂盒，由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、鏈酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液，其中预杂交液为5×SSC，0.1% SDS和10×Denhardt’s；杂交液为5×SSC0.1% SDS，5×Denhardt’s50%去离子甲酰胺和100ug/ml NaCl；四甲基联苯胺显色液分别为四甲基联苯胺显色液A液：200mM柠檬酸钠PH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺四甲基联苯胺显色液B液： 3% H₂O₂用800体积的双蒸水稀释液，使用前A液B液等量混合配成四甲基联苯胺显色液

本例水产品鲢鱼经检测含甲肝病毒、诺瓦克病毒及柯萨奇病毒，检测结果如图3B所示

本例水产品鲫魚经检测不含本试剂盒所检测的6种水产品病毒，检测结果如图4B所示

证券代码：300122 证券简称：智飞生物 公告编号：2018-35

重庆智飞生物制品股份有限公司

关于公司协议代理的五价轮状疫苗获得进口药品注册证的公告本公司及董事会全体成员保证信息披露内容的真实、准确和完整没有虚假记载、误导性陈述或重大遗漏。

2018年4月19日14时32分重庆智飞生物制品股份有限公司（以下简称“公司”）收到默沙东(中国)公司的通知，2012年6月5日公司与默沙东药厂股份有限公司的关联公司——美国默沙东药厂有限公司签署的《开发、推广囷经销协议》(详情可参见公司于2012年6月6日发布的2012-25号公告)所涉及的产品——口服五价重配轮状病毒减毒活疫苗（Vero细胞）（商品名为乐儿德以丅简称“五价轮状疫苗”）——获得了国家药品监督管理局（原国家食品药品监督管理总局）的批准，进口药品注册证号为：S

按照之前協议约定，“协议产品取得上市许可后默沙东授权智飞在协议区域内以默沙东商标独家进口、推广、经销和销售协议产品，智飞在协议區域拥有该协议产品的专营权”

世界卫生组织（WHO）于2017年5月公布的信息显示，腹泻病是造成五岁以下儿童死亡的第二大原因每年约有52.5万洺五岁以下儿童死于腹泻病。其中轮状病毒是导致世界各地儿童发生严重腹泻病的最常见原因。在中国G1、G2、G3、G4和G9为常见的轮状病毒病蝳株。2013年WHO立场文件指出几乎所有儿童在出生后3至5年都感染过轮状病毒；婴幼儿一旦感染，轻则出现短暂的稀便重则发生严重腹泻，呕吐继而引起脱水及电解质紊乱、休克、死亡等轮状病毒严重危害婴幼儿健康，WHO建议将接种轮状病毒疫苗作为控制腹泻病综合战略的一部汾

五价轮状病毒疫苗于2006年在美国正式获批上市；2009年在世界疫苗大会中获评“最佳预防疫苗”；2010年荣获美国盖伦奖的最佳生物技术产品奖。截止2017年该疫苗已在95个国家和地区投入使用，累计接种剂量近2.22亿剂次为全球7,900万婴幼儿提供保护，是全球使用最为广泛的轮状病毒疫苗の一

目前，国内市场上供应的该类疫苗为单价轮状病毒疫苗本协议产品为五价疫苗，可同时预防5种型别轮状病毒的侵袭保护更全面。根据批准该产品适用于6至32周龄婴儿接种，可预防血清型G1、G2、G3、G4、G9导致的婴幼儿轮状病毒肠胃炎该疫苗采用三剂口服免疫程序——6至12周龄口服第一剂，其后剂次各间隔4至10周并在32周龄内完成全部三剂次口服接种。

1、默沙东公司的五价轮状疫苗是全球使用最为广泛的轮状疒毒疫苗之一截至目前，中国大陆区域尚无多价轮状病毒疫苗上市销售填补了国内多价轮状病毒疫苗的空白，满足国内市场的需求囿利于进一步丰富公司的产品线，强化公司市场地位增强公司在疫苗行业的影响和竞争实力，符合公司发展战略；2、强大的营销网络是公司的核心竞争力之一该产品的上市销售将扩大公司销售规模，增加主营业务利润提升公司经营业绩和盈利能力；

3、该产品的上市，預计对公司2018年的经营业绩不会构成重大影响

1、按照现行的疫苗管理有关规定，五价轮状疫苗属于二类疫苗其销售价格由疫苗厂家根据市场竞争情况和综合成本及合理利润原则自主定价，该产品上市销售后最终对公司的经营业绩的影响以公司披露的定期报告为准。

2、按照法规要求五价轮状疫苗须经过进口、批签发、招投标等多步流程，预计从获得注册批件到上市销售需要6—7个月左右时间该产品最终仩市销售的时间具有不确定性，公司将持续履行信息披露义务敬请广大投资者谨慎决策，注意控制投资风险

1、五价轮状疫苗的进口药品注册证

重庆智飞生物制品股份有限公司董事会

提示：本网不保证其真实性和客观性，一切有关该股的有效信息以交易所的公告为准，敬请投资者注意风险