设计pcr引物设计Tm不够高,可以在5'端随意加CG（与模板不配对的）提高Tm值么？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-01-26 14:34 标签： rt pcr引物设计原则
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引物设计原理及PCR
C​R​反​应​条​件​的​选​择​
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​ ​ ​P​C​R​反​应​条​件​为​温​度​、​时​间​和​循​环​次​数​。
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【求助/交流】计算PCR引物设计的Tm值，算不算附加的酶切序列和保护序列
引物是用Premier 5.0 设计的，是只算引物跟模板互补的序列的Tm，还是把附加的酶切序列和保护碱基的都一起算进去计算Tm?
当然都算在内了 我不计算酶切位点和保护碱基。:) Originally posted by curie at
当然都算在内了 附加序列不是不会跟模板互补吗？不互补怎么会有退火温度呢 Originally posted by kun2199 at
我不计算酶切位点和保护碱基。:) 那你怎么算的? 加上那么多碱基的Tm 值跟不加算出来的差别很大 好像后面的循环就会互补吧 应该算的，想一下PCR的程序，就会发现只有第一次循环酶切位点和模板不互补，后面的就会互补了，因此，我认为要算的 如果算酶切位点和保护碱基的话，那么楼主不是要设两个退火温度了，前一个温度低，后一个温度高，第一轮的PCR，酶切位点和保护碱基是不参与互补的。 算在内的，这个必须的 我的建议是不算在里面，因为第一次是酶切位点、保护碱基等不与ＤＮＡ序列配对，但是随着ＰＣＲ的扩增，以后产生的序列都能与酶切位点、保护碱基配对，似乎这样应该算上酶切位点、保护碱基。
但是如算上呢，会比不算上高出很多，有可能第一次ＰＣＲ配对就失败了，即扩不出来的情况。 Originally posted by wqj1988926 at
算在内的，这个必须的 怎么有人说算，有人说不算呢？ 我是用Primer 5设计引物，上下游引物Tm 最好不是相差不要超过2°吗， 这个两度到底算不算保护碱基和酶切位点 我看大家有的说算，有的说不算的，
有点乱啊，
我设计带酶切位点的引物的时候，都是算是内的，也照常能P出来，效果也很好。我做DGGE-PCR的时候，在计算Tm值的时候，就没有算GC夹子，也P的很好。
我觉得大家有的说算在内的，有说不算在内的，原因可能是不管怎样，都可以扩增出来吧，影响不是特别的大。
我是这么想的，PCR开始的时候，引物要跟模板配对，这时最佳退火温度是与不含酶切位点的Tm值有关的。
但是，等过几个循环之后，模板以引物扩增的产物为主，这个时候最佳退火温度是与含酶切位点的Tm值有关的，这个温度影响后面循环的扩增结果。
所以一般来说，就用含酶切位点的Tm值来参考设计退火温度。
仅供参考。 应该没有算上吧，算上的话会高出Tm许多~不过扩基因的话做个梯度扩出来就行了 要算 后面就和模板结合上了 不用算吧，只要两引物的Tm相差不大应该没事的。 正如楼上有说到的，第一次的Tm值应该与保护碱基等无关，因为不配对，但是到了后来应该就有关系了，引物拿给公司合成时会给一个Tm值，但是我觉得没什么用，还是自己摸索一下退火温度吧~~~做个梯度看看~~ 我也经常遇到PCR过程中带酶切微点的问题，我的解决办法是分步PCR：前5个循环按照不加酶切位点的温度PCR，后23个循环是按照带有酶切位点和保护碱基的温度PCR，就向大家说的一样，一两个循环后酶切位点和保护碱基已经连到模板上了，可是如果刚开始第一个循环就用很高温度的话很可能P不出来。我每次都是分步PCR，至今没有出现问题。
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pcr中的引物A.引物自身不应该存在互补序列 B.引物中的碱基组成应该尽可能与靶基因两侧序列互补 C.应考虑上下游引物具有相似的Tm值 D.引物的5’端必须和模板严格配对结合 E.引物应保证一定长度,防止非特异扩增 哪个选项错了并解释
D.引物的5’端必须和模板严格配对结合不一定,有时候可以加酶切位点,所以不是严格配对结合的
D是3‘段要保证严格配对，5’端没这些要求，甚至可以加上很长的额外序列
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