实时荧光定量pcr法pcr要在pcr室做吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-11-22 05:17 标签： 实时荧光pcr仪
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【求助】荧光定量PCR绝对定量时，每次都要做标准曲线吗
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荧光定量PCR绝对定量时，每次都要做标准曲线吗
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只做过相对定量的飘过，但是以我的经验来看，标准曲线是没个基因做一个吧
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是的呀，每个基因都要做一个标准曲线，每次上样时都要加你的标准品，才知道你的样本浓度
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绝对定量，从严格意义上将，每次样品检测时，都应该制作标准曲线的，但是当检测样品很多，目的基因很多时，这样做太麻烦了！可以将基因的标准曲线先制作完成，下次可以重复使用，只要将斜率和截距直接导入使用就可以了。不过，这样做的前提是保证每次的扩增效率是一致的。为了严谨，可以在进行样品检测时，同时将1到2个标准品同样品一起检测，如果Ct值与制作标准曲线时的Ct值差异不大，那么就放心使用这条标准曲线，如果差异很多，就不推荐使用。
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做实时荧光定量pcr需要多少钱
10-01-22 &匿名提问
最省的就买一些小包装的试剂自己做。
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荧光定量PCR
新定量试验技术
荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;时，Taq酶的5’端－3’端活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光量化PCR原理
TL988型仪应用领域
临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
动物疾病检测：禽流感、、、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、。
食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。
科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
实时荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景将更加广阔，令人欣喜。尽管如此我们也应清晰认识到，FQ-PCR技术在我国各个研究领域的应用并不多见，这就需要我国学者迎头赶上，使FQ-PCR技术更充分地推广，以推动研究工作的快速发展。[1]
荧光定量PCR　实验步骤：
样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA质量检测
1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
样品cDNA合成
①反应体系
逆转录buffer
逆转录酶MMLV
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
SYBR Green 1 染料
阳性模板上游引物F
阳性模板下游引物R
阳性模板DNA
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系：
SYBR Green 1 染料
内参照上游引物F
内参照下游引物R
待测样品cDNA
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
10×PCR缓冲液
dNTP混合液
加水至总体积为
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72℃延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下：
SYBR Green 1 染料
待测样品cDNA
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。[2]
．中国知网．2006-09[引用日期]
．荧光定量PCR[引用日期]

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