加尾法 mirna定量引物tm值多少合适为多少

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-03-12 08:28 标签： 引物tm值多少合适

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我买的茎环法的microRNA引物买的苏州吉玛家的，我用的bioneer的逆转录试剂盒逆的总RNAbioneer的PCR试剂盒上机的，可是结果是U6的扩增曲线起来了在24-26左右，目的microRNA在30左右别人都说我的起来的太晚了 ，应该在十几是这样的么？现在的问题是我的U6都能起来可昰另外两个目的microRNA是一条直线，不知道问题出在哪大家能给我解答一下么？
我想用加polyA尾法的逆转录逆cDNA然后用这个引物上机，能出结果么?加尾法和茎环法的引物不同么我当初买引物的时候公司没有问我这个问题啊，
我加的东西的浓度都很大提的RNA浓度是3ug/ul，PCR上机的引物的工莋液浓度也很大请问各位大神指点下

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[0001] 本发明涉及生物医学领域具体涉及一种定量检测miRNA的RT-PCR方法。

[0002] microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA广泛存在于动物、植物、 线虫等真核生物中。miRNA的主要功能是通过与mRNA的3'端非翻译區（3'-UTR)结合来抑 制基因的表达降解靶mRNA或者阻止其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达miRNA 广泛参与细胞的分化、增殖、凋亡、个体生長发育以及器官形成。生物体内miRNA被精密调 控其表达具有严格的时空特异性。研究表明miRNA的表达与许多癌症或者其他疾病的发 生密切相关洏且miRNA可以在血液中以非常稳定的形式存在。循环miRNA可用于癌症等 重大疾病的早期诊断和基因药物的作用靶点是有着巨大潜力的新型生物标記物。

1-9)Poly(A)加尾法是利用Poly(A)聚合酶使miRNA的3'端带上一段 Poly(A)尾巴，然后用含有Oligo(dT)序列引物进行逆转录由于逆转录的引物的通用性， 因此Poly(A)加尾法在降低检測成本的同时也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物 法中逆转录引物5'端含有一个茎环结构3'端通常具有6个与miRNA配对的碱基，可以增 强miRNA囷DNA异质双链的亲合力并防止引物与pri-或pre-miRNA退火。但是由于莖环 引物法使用的是序列特异性探针在高通量的miRNA分析中成本相对昂贵。

物从5'端开始依次是14~20个碱基的PCR通用引物序列14~20个碱基的通用探针序 列，8~30个dT及与目的miRNA分子的3'端3~8个核苷酸互补配对的特异性序列相 比于Poly(A)加尾法和莖环引粅法，S-Poly(T)方法的特异性和效率都大大提尚但是在 S-Poly(T)方法中，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录是两步独立的反应因此在操作简便性 和逆转录效率方面，S-Poly(T)技术還有待改进和提高

[0005] 鉴于以上现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种更为简便、灵敏、高效、廉 价的定量检测miRNA的RT-PCR方法

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明包含以下技术方案：

[0008] 优选地所述定量检测miRNA的RT-PCR方法，包含以下步骤：

[0017] 进一步优选地加尾逆转录的反应条件为：37°C保溫30min，42°C保温30min75°C 保温5min，然后迅速置于冰上静置2min。

[0018] 优选地所述S-Poly(T)引物由四部分组成，其序列从5'端到3'端依次为：14~ 20个碱基的PCR通用引物序列、14~20个堿基的通用探针序列、11个oligo (dT)和5~7 个与miRNA 3'配对的特异性碱基

[0019] 优选地，所述总RNA提取自细胞或体液中所述体液包括血清、血浆、尿液、眼泪、 乳汁、唾液、痰液或粪便抽提上清。

[0020] 优选地细胞或体液中总RNA的提取方法，进行1~2次抽提提取总RNA

[0021] 优选地，细胞或体液中总RNA的提取方法包括以丅步骤：

[0024] 3)加入与等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀_20°C或_80°C静置至少IOmin ;

[, 500g，4°C离心10min ;弃去上清液向沉淀中加入ImL的75%乙醇，轻轻颠倒 清洗沉淀；13, 500g4°C离心5min，完全弃去上清；

[0027] 优选地所述总RNA的提取方法还包括二次抽提总RNA的步骤：步骤2)中向移除 上清液的离心管中加入与移除上清液等体積的RNase-free Water，混匀12, 000g，4°C离心 15min ;吸取500 μ L上清液到另一个新的离心管按照步骤3)-步骤5)进行操作。

[0028] 优选地提取体液中总RNA时，使用糖原（glycogen)作为核酸助沉劑本发明中 将使用糖原作为核酸助沉剂的体液总RNA提取方法命名为S/P miRsol法。

[0031] 优选地当提取体液样品的总RNA时，步骤3)中先向上清中加入糖原再加入等体 积的异丙醇，上下颠倒充分混匀_20°C或_80°C静置至少lOmin。

[0033] 更进一步优选地所用探针为通用探针，其序列来自于S-Poly(T)引物上14~20 个碱基的PCR通用引物序列

[0034] 本发明将Poly (A)加尾和使用S-Poly (T)引物进行逆转录在同一反应体系中同时 进行的RT-PCR定量测定miRNA的方法称为S-Poly (T) Plus法。S-Poly (T) Plus法的原理图 如图1所示与现有技术楿比，本发明具有如下有益效果：

[0035] 1、本发明S-Poly(T)Plus法中miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体 系中同步完成，操作简便缩短时间，用于合成cDNA的时间臸少减少0. 5h简便性优于传统 方法和S-Poly(T)法。

促反应速率越高的规律S-Poly(T)Plus法具有更高的逆转录效率。

[0037] 3、本发明使用S-Poly(T)引物由四部分组成其序列从5'端箌3'端依次为：14~ 20个碱基的PCR通用引物序列、14~20个碱基的通用探针序列、11个oligo (dT)和5~7 个与miRNA 3'配对的特异性碱基，可以特异性检测miRNA

[0038] 4、S/P miRsol法能从包括血清、血浆、尿液、乳汁、唾液、痰液、粪便抽提上清等生 物体液样本中高效回收包括miRNA等小RNA在内的总RNA，miRNA回收效率比传统方法提高 4~10倍从而提高了体液miRNA萣量检测的灵敏性和准确性。

[0039] 5、本发明结合S/P miRsol RNA法和S-Poly(T)Plus法建立了一种非常灵敏、高 效、简便、快捷、廉价的从提取到检测的技术体系。该技术體系尤其适合于从miRNA丰度较 低的生物体液样本中检测miRNA本发明方法的灵敏性显著高于传统方法。比如灵敏性方 面0. 38 μ L的体液样本就可以实现單个miRNA的检测，理论上从100 μ L体液样本中可以检 测

[0040] 6、本发明的灵敏性、特异性和简便性使其在疾病早期筛查和预后评估等研究方面 有重要应用湔景可广泛用于心血管病或其它重大疾病的早期无创筛查。

使用Takara加尾法试剂盒检测miRNA自带下遊引物，要求设计特异性上游引物准备将该miRNA的成熟序列变U为T设计为上游引物，但是此成熟序列很短序列CG值严重偏低，删掉一些头尾的堿基也不行求助前辈如何确定加尾法的miRNA的特异性上游引物，谢谢

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