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HIV病毒检测方法及其检测试剂盒
(54)发明名称HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒(57)摘要本发明公开了一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法。该检测方法是根据GenBank公布的HIV病毒序列的保守区域设计HIV RT-LAMP-LFD反应系统所需引物与探针;采用本发明人配制的RNA提取试剂提取HIV病毒RNA，使用本发明建立的RT-LAMP反应体系进行检测，依据反应体系加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果。同现在HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测时间，是HIV诊断方法持续发展的主要方向。1.一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括如下步骤:（HIV病毒）RNA的提取:(1)取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500u L裂解液匀浆，离心;(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻 璃纤维素膜结合; (3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;(5)配制预反应液，所述预反应液体积为15-20 u L，包括:1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.
pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 5-15U BstDNA聚合酶大片段 引物HIV-FIP序列见SEQ
N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ
NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5(6)在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25u L然后在温度为60-65°C，反应15-65min；LFD试纸检测:(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上60-100 uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。2.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6 的Tris-HCl，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol /L.EDTA.3.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl，浓度为0. 4-0. 6mol /L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。4.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。5.根据权利要求1或2或3或4所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针MIV-FITC-PROBE为5'端FITC标记探针:6. 一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT- LAMP扩增反应液，16-20u L的RT- LAMP扩增反应液包括: 1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针
HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.
pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 5-15U BstDNA聚合酶大片段，其余为RNase firee water.引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :57.根据权利要求6所述的HIV RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于: 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :58.根据权利要求6所述的HIV RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于:HIV病毒LAMP-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1xTAE缓冲液，阳性对照样品为HIV基因组病毒RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase firee water
HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒
技术领域[000l] 本发明涉及哺乳动物病毒检测领域，特别涉及一种人体HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒。背景技术 [0002] HIV即人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）[0003]研究表明，人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大致呈球形。病毒外膜是类脂包膜，来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质（Matrix），以及蛋白p24形成的半锥形衣壳（Capsid），衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶（逆转录酶、整合酶、蛋白酶）以及其他来自宿主细胞的成分。其序列已测定并在GenBank上登录(登录号分别为AY222839, AY222840)。目前该病毒的检测方法有电镜法、RT-PCR检测法、TAS-FLTSA检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题:一是灵敏度小，无法检测到潜伏感毒样品;二是容易产生假阳性，对模板质量要求高;三是操作繁琐，对实验条件要求高。[0004] RT-LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶和AMV逆转录酶的同时作用下，使RT和LAMP反应在同管中同时进行，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。[0005]侧向流层析试纸(lateral flow dipstick, LFD)是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题.LFD检测相对于其他检测手段，有操作简便且安全的特点。LAMP-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带
和检测带，两条带都显色表示阳性，只有质控带而检测带未显色表明检测结果为阴性。该方法具有安个、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目前，该技术在艾滋病病毒(HIV)的检测中未见报道。发明内容[0006]本发明的目的在于是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸 来检测艾滋病病毒(HIV)的方法，特异性强，敏感率高。[0007]本发明另一目的在于提供一种用于上述方法的检测试剂盒，该试剂盒特异性强， 敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在检查中直接应用的问题，适合艾滋病病毒(HIV)的筛查与预防。[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种艾滋病病毒(HIV)RT-LAMP-LFD检测方法，包括如下步骤:病毒RNA的提取:(1)取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500裂解液匀浆，离心;(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻 璃纤维素膜结合;(3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;所述预反应液体积为15-20 u L，包括:1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.
pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 5-15U BstDNA聚合酶大片段 引物HIV-FIP序列见SEQ
N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ
NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5(6)在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25u L然后在温度为60-65°C，反应15-65min；LFD试纸检测:(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上60-100 uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。[0009]本发明的检测方法是根据GenHank公布的艾滋病病毒(HIV)序列的保守区域设计了HIV病毒RT-LAMP-LFD反应系统所需引物与探针;病毒RNA提取病毒RNA，使用本发明建立的RT-LAMP-LFD反应体系进行检测，依据反应体系中加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果，结果显示在61℃ 30min, HIV病毒RNA获得了高效特异性扩增。同现在HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测时间，是HIV诊断方法持续发展的主要方向。[0010]作为优选，所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6 的Tris-HCl，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol /L.EDTA.[0011]作为优选，所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl，浓度为0. 4-0. 6mol /L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。[0012]作为优选，所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。[0013]作为优选，引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针HIV-FTIC-PROBE为5' 端FTIC标记探针。
[0014]一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT- LAMP扩增反应液，16-20u L的RT- LAMP扩增反应液包括: 1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.
pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 5-15U BstDNA聚合酶大片段，其余为RNase firee watero引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5[0015]作为优选，引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针HIV-FTIC-PROBE为5'端FTIC标记探针。[0016]作为优选，HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1 x TAE缓冲液，阳性对照样品为HIV病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase firee water[0017]本发明的有益效果是:1、本发明所采用引物组是根据HIV衣壳蛋白基因的六个不同区域设计的，又有RNA的特异性探针相结合，特异性比常规PCR强。[0018]
2、本发明的检测试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的102-103倍。[0019]
3、本发明的检测试剂盒检测时间短，可以在30-60min内获得检测结果，比常规 PCR节约3.5-4.5小时。[0020]
4、本发明的检测试剂盒对仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统。[0021]
5、本发明中的病毒RNA提取方法简单快捷，而且不用到氯仿、巯基乙醇等有害物质。[0022]
6、本发明的检测试剂盒操作步骤简单，结果直观易判定。[0023]
7、本发明的检测试剂盒对人和环境较安，整个过程不使用有毒物质。[0024]
附图说明[0025] 图1为扩增温度对RT-LAMP反应的影响图。M:100bp DNA Ladder Marker(TaKaRa 公司);泳道1:61℃恒温条件下扩增结果;泳道2 :63℃温度条件下扩增结果;泳道3:65℃温度条件下扩增结果。[0026] 图2为MrNV RT-LAMP特异性实验结果。M:l00bp DNA Ladder Marker(TaKaRa 公.d);泳道1:罗氏沼虾野田村病毒;泳道2:南美白对虾白斑综合症病毒（WSSV);泳道3:草鱼呼肠孤病毒（GORV};泳道4:对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV};泳道5:对 虾桃拉病毒(TSV);泳道6:阴性对照。[0027] 图3为本发明的检测方法检测感染MrNV样品实验结果图。M :100bp DNA ladder Marker(TaKaRa公司);左侧泳道1：MrNV样品RT-LAMP反应:30min。检测结果;左侧泳道2:MrNV样品RT-LAMP反应45min检测结果;NT:为阴性对照样品检测结果:右侧为LFD试纸检测显色结果。[0028]
图4为本发明的检测方法检测MrNV的灵敏度比较图和LFD试纸显色对比图。M： 100bp DNA ladder Marker(TaKaRa公司);左侧泳道1-6:模板分别为10-1,10-2,10-3,10-4,105,106倍稀释的基因组RNA;泳道7:无模板;右侧1-7:为左侧实验结果的LFD试纸检测图。 具体实施方式[0029] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。[0030] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。[0031]本发明实施如下:一种艾滋病病毒HIV-RT-LAMP-LFD检测方法，包括如下步骤:病毒RNA的提取:(1) 取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500u L裂解液匀浆，离心; (12000rpm离心1-2min)[0032] 所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6 的Tris-HCl，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol /L.EDTA.其余为RNase free water。[0033]
(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液 与玻璃纤维素膜结合;将混合液与玻璃纤维素膜结合具体操作为:将混合液转入带有玻璃 纤维素膜的吸附柱中，12000rpm离心1-2min,弃掉废液，这样混合液与玻璃纤维素膜就结 合。[0034]
（3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜。[0035]
去蛋白液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为:向吸附柱中加入400-600 u L去蛋白液， 室温静1-2min,12000rpm离心30-60s，弃掉废液。[0036]
所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl，浓度为0. 4-0. 6mol /L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。[0037]
漂洗液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为:向吸附柱中加入400-600 u L漂洗液，12000rpm离心30-60s，弃掉废液，重复该步骤一次。[0038]
所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。[0039]
(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA，具体操作为:在吸附柱 中加入30-50u L RNase free water(市售)，室温放置1-2min,12000rpm离心1-2min重复该步骤一次，增加RNA洗脱量。[0040]
RT- LAMP扩增反应:(5)配制预反应液，所述预反应液体积为15-20 u L，包括:1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.
pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 5-15U BstDNA聚合酶大片段[0041] 引物HIV-FIP序列见SEQ
N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ
NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5[0042] HIV-RT-LAMP引物、探针设计与筛选本发明所述的引物是根据GenBank公布的RNA2序列，由在线软件PrimerExplorer V4 (http: primerexplorer.jp/e/)设计和手工修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出两对引物和一条探针。[0043]引物HIV-F3（SEQ ID N0:3):GATACAACAACTATTCCATTGATTG[0044]引物HIV-B3（SEQ ID N0:4)TGTAGGATTAATTTGTGGCATG[0045]引物HIV-FIP（SEQ ID NO :1):GCAAGAGGTAAAATACACCCTGTT-TACTATACTGGTCAAGATAAAGAGA[0046]引物HIV-BIP（SEQ ID NO :2):AGTGGTGAAGCCATTACAAATGA-GAAAATCCACAGACCCAATC[0047]探针HIV-FITC-PROBE (SEQ ID N0 :5):
CTCTTGCAAGTGACTACACTACTTAA[0048]其中HIV-FIP为5'端生物素(biotin)标记引物;HIV-FITC-PROBE为5'端FITC标记探针。[0049]
(6) 在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25u L然后在温度为60-65°C，反应15-65min；[0050]
LFD试纸检测:(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上60-100 uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。当仅出现质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明反应结果为阳性。[0051] 一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT- LAMP扩增反应液，16-20u L的RT- LAMP扩增反应液包括: 1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.
pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 5-15U BstDNA聚合酶大片段，其余为RNase firee water.[0052] 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5[0053]
RT- LAMP扩增反应液装于RT-LAMP核酸反应管中，RT-LAMP核酸反应管中添加有稳定液，稳定液为液体石蜡油。稳定液滴加在RT-LAMP核酸反应管中，用于液封，稳定液用量在5-10 u L 。[0054]
检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD 试纸用的缓冲液为1x TAE缓冲液，阳性对照样品为HIV病毒基因组RNA,阴性对照样品为无核酸的RNase free water[0055]本发明的上述方案在其范围内都是可以实施的，以下以一个典型实施方案来具体 说明本发明的具体操作步骤。[0056]典型实施方案:1、材料被感染的人体HIV病毒细胞采集自宁波第一医院;所用引物与探针由上海生工生物公司合成;Bst DNA聚合酶大片段购自New England BIPolabs公司:;逆转录酶AMV, dNTP购自takara公司;甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。[0057] 2、罗氏沼虾样品病毒RNA的提取:(1）取20mg被感染的人体HIV病毒细胞组织，加入500 u L裂解液后用一次性研磨棒研磨，等彻底匀浆后,12000rpm离心2min，吸取上清液至新的离心管;(2）向装有上清液的新的离心管中加入等体积(与上清液等体积)的70%无水乙醇后， 混合均匀;（3）将混合液体转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中，吸附柱置于收集管中，12000rpm离心l min，弃掉废液;（4）向吸附柱中加入550 u L去蛋白液，室温静置1min,12000rpm离心30s，弃掉废液;（5）加入600 u L漂洗液,12000rpm离心30s，弃掉废液;重复该步骤一次。[0058]（6）将吸附柱置于新的无RNase的离心管中，在吸附柱中加入50 u L RNase free water，室温放置1min,12000rpm离心lmin。使用第一次的洗脱液重复该步骤一次，增加RNA 洗脱量。
[0059]（7）取5 u L RNA洗脱液进行10-1一10-7的逐步梯度稀释，-80℃保存备用。[0060]
3、HIV病毒RT-LAMP恒温扩增:(1)根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测的预反应液:1.5mmol/L引物HIV-FIP, 1. 5mmol /L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/L引物HIV-B3, 0.05 u mol /L探针HIV-FITC-PROBE,14mmol/l, pH8.0-9.0的Tris-HCl，l0mmol/1氯化钾，13 mmol/L硫酸铵，6mmo1/L 硫酸镁，0.1% TritonX-100,0. 6mol /L甜菜碱，7.4mmol/L dNTP,1U逆转录酶AMV, 8U Bst DNA聚合酶大片段，其余为RNase free water每管检测预反应液体积为26 uL。[0061]
(2)分别吸取5u L小同浓度的待检样品RNA加入核酸检测反应管中，混合均匀。[0062]
(3)标记清楚后，将检测反应管置于61℃水浴锅中，反应30min[0063]
4、HIV病毒RT-LAMP扩增产物进行凝胶电泳:(1)配置2%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入5uL的反应产物;(2)电泳30分钟后凝胶成像，结果见图3和图4左侧图。[0064]
5、RT-LAMP扩增产物的LFD试纸检测:(1)取HIV病毒RT-LAMP扩增产物5u L,置于LFD试纸加样孔;（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加50uL缓冲液(1xTAE缓冲液)，待缓冲液移动基本结 束，判断RT-LAMP-LFD检测结果，见图3与图4右侧图。[0065]利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测人体HIV病毒，经过凝胶电泳，由图3左侧图可见阶梯状的扩增条带;再利用LFD检测试纸条检验扩增产物，由图3右 侧图可见与电泳结果吻合。而图2特异性实验结果和图4灵敏度检测结果表明本检测方法 具有较好的特异性和灵敏度。其中图1为筛选本体系最佳的反应温度，如图所示温度61℃ 较佳。[0066]根据以上实验结果表明，HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒和检测方法可以为艾滋病病毒HIV提供快速、简便、灵敏的现场检测。[0067]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的 限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
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逆转录一环介导等温扩增技术检测急性_图文
导读：逆转录一环介导等温扩增技术检测急性呼吸道感染儿童中的呼吸道合胞病毒，目的利用逆转录一环介导等温扩增技术（ｒｅｖｅｒｓｅｌｏｏｐ―ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓ，建立一种快速且敏感、特异的从急性呼吸道感染儿童的呼吸道标本中检测呼吸道合胞病毒（，对ＲＳＶ５株分离株及经直接免疫荧光法（ＤＦＡ）呼吸道病毒多病原检测过的急性呼吸道，６０ｍｉｎ扩增反应时间内每个反应可检测到１个拷贝的ＲＳＶ（Ａ或Ｂ亚型）ＲＮＡ，４株
史堡』Ｌ型苤查垫！！生！旦筮！！鲞筮！塑堡蔓！』旦！ｉ堕！：△Ｐ巫！！Ｑ！！：∑！！：ｉ！：堕！：兰
．感染性疾病
逆转录一环介导等温扩增技术检测急性呼吸道感染儿童中的呼吸道合胞病毒
李凡赵林清钱渊
朱汝南孙宇刘立颖
目的利用逆转录一环介导等温扩增技术（ｒｅｖｅｒｓｅｌｏｏｐ―ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，
ＲＴ―ＬＡＭＰ），建立一种快速且敏感、特异的从急性呼吸道感染儿童的呼吸道标本中检测呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）的方法。方法设计特异性ＲＴ．ＬＡＭＰ扩增引物，对引物进行特异性与灵敏度评估后，应用ＬＡ一３２０Ｃ实时浊度仪，对ＲＳＶ５株分离株及经直接免疫荧光法（ＤＦＡ）呼吸道病毒多病原检测过的急性呼吸道感染患儿的呼吸道标本１０１例进行ＲＴ－ＬＡＭＰ检测，并以本研究室已建立的ＲＴ一巢式ＰＣＲ为对照方法。结果所建立的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法敏感度好，６０ｍｉｎ扩增反应时间内每个反应可检测到１个拷贝的ＲＳＶ（Ａ或Ｂ亚型）ＲＮＡ；且方法特异性好，与其他病毒间无交叉反应；４株Ａ亚型及１株Ｂ亚型ＲＳＶ分离株ＲＴ―ＬＡＭＰ方法检测均为阳性；在１０１例经ＤＦＡ检测的呼吸道标本中，所建立的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法与ＤＦＡ方法在ＲＳＶＡ、Ｂ亚型检测的总符合率为９５．０％，且两种方法的相关系数为０．８９５；与ＲＴ．巢式ＰＣＲ的总符合率为９４．１％，两种方法的相关系数为０．８７１。结论
本研究所建立
的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法耗时短、操作简便、灵敏且特异，适用于儿科临床＿丁．作中疑似ＲＳＶ感染的呼吸道标本的快速、特异的病原学检测。
【关键词】
呼吸道合胞病毒；
呼吸道感染；
逆转录环介导等温扩增技术（ＲＴ－ＬＡＭＰ）
Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓｉｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈａｃｕｔｅ
ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｂｙ
ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｌ／Ｆａｎ，
Ｌｉｎ―ｑｉｎｇ，ＱＩＡＮ
Ｙｕａｎ，ＤＥＮＧｆｉｅ，ｚＨＵＲｕ―ｎａｎ，ｓＵＮＹｕ，ｕＵＬｉ―ｙｉｎｇ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，
ＣａｐｉｔａｆＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃｓ，Ｂｅｑｉ，理１０００２０，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ａｕｔｈｏｒ：ＱＩＡＮＹｕａｎ（Ｅｍａｉｌ：ｙｑｉａｎｂｊｃ＠２６王ｎｅｔ）
ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｉｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ―ｌｏｏｐ―
ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ．ＬＡＭＰ）ａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）
ｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｎｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈ
ａｃｕｔｅ
ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄ
Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ
ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｍａｔｒｉｘ
ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓｓｕｂｔｙｐｅｓＡａｎｄＢｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋ．ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ
ｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄＲＴ―ＬＡＭＰａｓｓａｙｄｅｔｅｃｔＲＮＡｏｆＲＳＶｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅＲＴ－ＬＡＭＰ
ｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｅｎ―ｆｏｌｄｓｅｒｉａｌｌｙｄｉｌｕｔｅｄｉｎｖｉｔｒｏ．ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｍａｔｒｉｘＲＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍＲＳＶａｎｄＲＳＶＢ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＲＴ．ＬＡＭＰｍｅｔｈｏｄｗａｓｔｅｓｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｃｒｏｓｓ―ｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｏｔｈｅｒＲＮＡａｎｄＤＮＡｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｈｅｎ５ＲＳＶｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｔｉｎｉｃａＩｓｐｅｃｉｍｅｎｓｕｓｉｎｇｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄ
ｂｙＲＴ―ＬＡＭＰａｓｓａｙ．Ａｔｏｔａｌｏｆ１０１ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌａｓｐｉｒａｔｅｓｆｒｏｍｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｗｈｉｃｈｈａｄｂｅｅｎｔｅｓｔｅｄｂｙｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ（ＤＦＡ），ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ４０ｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＲＳＶａｎｄ６１
ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｆｏｒＲＳＶ．ｗｅｒｅ
ｔｅｓｔｅｄｂｙＲＴ．ＬＡＭＰ
ａｓｓａｙ
ａｎｄｂｙＲＴ―ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔ
Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ａｂｌｅｔｏｄｅｔｅｃｔ１ｃｏｐｙ／斗ｌｏｆＲＳＶＡａｎｄＲＳＶＢＲＮＡ，ｎｏａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｉｓＲＴ―ＬＡＭＰｍｅｔｈｏｄ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓｓｈｏｗｎｉｎＲＴ．ＬＡＭＰｗｉｔｈＤＮＡｏｒｃＤＮＡｆｒｏｍｏｔｈｅｒｖｉｒｕｓｅｓｉｎ６０ｍｉｎ．ｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅ
ＲＴ―ＬＡＭＰａｓｓａｙｉｓｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ．ＦｉｖｅＲＳＶｉｓｏｌａｔｅｓ
ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ
４ＲＳＶＡａｎｄ１
ＲＳＶＢｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ―ＬＡＭＰｍｅｔｈｏｄ
ｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎ
３０ｍｉｎ．Ｆｏｒｔｈｏｓｅ１０１
ｓｐｅｃｉｍｅｎｓｔｅｓｔｅｄ．３７ｗｅｒｅＲＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＲＴ．ＬＡＭＰａｓｓａｙ．ａｓｗｅｌｌＲＴ―ＬＡＭＰａｓｓａｙｗｉｔｈＤＦＡａｎｄ０．８９５
ａｓｓａｙ
３５ＲＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙＲＴ―ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ．Ｔｈｅｔｏｔａｌｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
ＲＴ．ｎｅｓｔｅｄＰＣＲｉｎｄｅｔｅｃｔｉｎｇＲＳＶｉＳ９５．０％．９４．１％ｗｉｔｈＫａｐｐａｖａｌｕｅ
ａｎｄ０．８７１．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｎｅｗ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄ，ＲＴ－ＬＡＭＰ
ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓｅｓｆｒｏｍｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌａｓｐｉｒａｔｅｓｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ｗｈｉｃｈ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５７８－１３１０．２０１３．０４．００７
基金项目：北京市科技计划（ｚｌｌｌｌ０７０５６８１１０４１）；Ｊｋ京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划（２０１ｌ－３－０６８）作者单位：１０００２０北京，首都儿科研究所病毒研究室通信作者：钱渊（Ｅｍａｉｌ：ｙｑｉａｎｂｊｃ＠２６３．ｎｅｔ）
主堡』Ｌ型苤查！Ｑ！！生兰旦筮！！鲞筮生塑些ｉ！』堡尘坐：垒Ｐ巫！！Ｑ！！：！！！：ｉ！：盟！：兰
ｓｈｏｕｌｄｂｅｈｅｌｐｆｕｌｉｎｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＲＳＶｆｒｏｍｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｔｒａｃｔｓａｍｐｌｅｓｏｆｃｈｉｌｄｒｅｎ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】
Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌ
ｖｉｒｕｓｅｓ；
Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｔｒａｃｔ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；Ｃｈｉｌｄ；
Ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ―ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ―ＬＡＭＰ）
人呼吸道合胞病毒（ｈｕｍａｎ
ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌ
ｖｉｒｕｓ，ＨＲＳＶ）是一种单股负链ＲＮＡ病毒（ｎｅｇａｔｉｖｅ－
ｓｅｎｓｅ
ｓｓＲＮＡ
Ｖｉｒｕｓ），属副黏液病毒科，是引起急性
下呼吸道感染最常见的病毒病原，尤其以婴幼儿及儿童多见。２０世纪９０年代以来，ＲＳＶ感染性肺炎已经超过腺病毒感染性肺炎，在我国ＩＪ＇，ＪＬ病毒性肺
炎中占第一位’１Ｊ。ＲＳＶ感染是引起婴幼儿毛细支
气管炎和肺炎最常见的病因，到２岁时几乎都曾感
染过ＲＳＶ【２Ｊ。在ＲＳＶ流行季节，６岁以下急性下呼
吸道感染的住院患儿中ＲＳＶ阳性检出率可达３６．５４％【３。。在大龄儿童中ＲＳＶ感染引起的临床症状通常较轻。但近年来发现ＲＳＶ感染所导致的严
重的临床症状越来越多见，国外报道８．３％～１１．６％的ＲＳＶ感染住院患儿曾人住ＩＣＵ接受治
疗Ｈ引。有研究表明，新生儿期ＲＳＶ感染与呼吸道的高反应性及哮喘的发生有关∞Ｊ，在其成年期患复发性哮喘的几率要明显高于普通人群一ｊ。
ＲＳＶ检测的实验室常用方法包括直接免疫荧
光法（ＤＦＡ）、免疫层析法（ＩＣＰ）、逆转录巢式聚合酶
链反应（ＲＴ―ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）、酶联免疫吸附测定
（ＥＬＩＳＡ）等。病毒分离方法虽然是金标准，但因其
耗时长，且需要特殊的实验室设备和人员，医疗机构不将其作为ＲＳＶ的实验室常规检测方法。逆转录一环介导等温扩增技术（１００ｐ―ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＴ．ＬＡＭＰ）是近年来国外报道一种新方法，可用来进行ＲＳＶＡ、Ｂ亚型分型检测呻驯，与
ＲＴ．巢式ＰＣＲ相比较，该方法省去了ＲＳＶＲＮＡ逆转录成ｅＤＮＡ的过程，大大节省了操作时间，从ＲＮＡ加样到扩增结束整个过程６０ｍｉｎ即可完成，且灵敏
度和特异性均较高，有望用于ＲＳＶ的快速检测。我
们从临床快速病原检测需求及成本考虑，拟建立一种可检测ＲＳＶ的ＲＴ．ＬＡＭＰ方法，并拟在一个反应管内同时进行ＲＳＶＡ、Ｂ亚型的快速检测。
材料与方法
一、毒株及标本来源
收集ＲＳＶ分离株５株，均由首都儿科研究所病毒研究室于２０１１年３月至２０１２年３月从急性呼吸道感染患儿标本中分离，经基因序列分析确定４株为ＲＳＶＡ亚型、ｌ株为ＲＳＶＢ亚型；收集首都儿科
研究所附属儿童医院２０１１年３月至２０１２年３月间急性呼吸道感染住院患儿鼻咽分泌物１０１例。标本冷藏运送至实验室，经常规处理后应用美国
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
Ｈｙｂｒｉｄｓ公司生产的Ｄ３＠ＵｌｔｒａⅢＤＦＡ
ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＶｉｒｕｓＳｃｒｅｅｎｉｎｇ＆ＩＤ
Ｋｉｔ直接免疫荧光
检测（ＤＦＡ）试剂盒进行包括ＲＳＶ在内的７种常见
呼吸道病毒抗原快速检测，部分标本同时接种人喉鳞癌细胞株（Ｈｅｐ．２）细胞进行ＲＳＶ病毒分离，剩余部分一８０℃保存备用。
二、引物设计
参考ＧｅｎＢａｎｋ中ＲＳＶＡ亚型（Ｕ６３６４４）的基因序列，应用ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ
ＬＡＭＰ引物在线设计
软件，根据ＲＳＶＡ、Ｂ亚型的Ｍ蛋白（Ｍａｔｒｉｘ）基因高
度保守区设计ＲＴ―ＬＡＭＰ引物，扩增靶基因片段长度
为２３８ｂｐ。引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ北京分公司合成（表
１），经聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）纯化。
三、ＲＮＡ提取
每份标本或毒株取１５０ｔｘｌ，加人含有５００
ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）的离心管中，混匀１５～２０
Ｓ，室温放置５ｍｉｎ。后加人１００斗ｌ氯仿，置
于旋涡混合器上充分混匀，室温放置１０
１２０００
ｇ离心１５ｍｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ
ＦＲＥＳＣＯ
２１，最大离
心半径为８．６ｃｍ），吸取上清５００斗ｌ置于新的离心
管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置１０ｍｉｎ，后
１２０００
ｇ离心１５ｍｉｎ（离心半径８．６ｃｍ），弃上清。
加入５００
７５％乙醇后再７５００ｇ离心５ｍｉｎ（离心
半径８．６ｃｍ），弃上清，干燥后加人２０仙ｌ焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）处理过的去离子水溶解ＲＮＡ。提取的
病毒ＲＮＡ置于一８０℃保存。
四、ＲＳＶ
Ａ、Ｂ亚型阳性质粒的制备及体外ＲＮＡ
以ＲＳＶＡ亚型原型株Ｌｏｎｇ株和ＲＳＶＢ亚型分
离株Ｈ６３５４的ＲＮＡ分别作为模板进行逆转录，各取ＲＮＡ
２．５斗ｌ，逆转录酶Ｍ．ＭＬＶ
Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ１５０
Ｕ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），按照说明书操
作进行ｃＤＮＡ的合成。随后以ｃＤＮＡ为模板，以ＲＴ―ＬＡＭＰ外侧引物ＲＳＶＦ３及ＲＳＶＢ３进行普通ＰＣＲ，预期扩增片段为２３８ｂｐ。所用ＤＮＡ聚合酶为
ＴＲＡＮＳ＠ＥａｓｙＴａｑＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｒａｎｓＧｅｎ公司），
反应条件为９４℃３０Ｓ，５２ｏＣ３０Ｓ，７２ｏＣ３５
里坐』Ｌ型盘查垫！！生！旦箜！！鲞箜！塑坠ｉ！』堕尘型！：垒四！！Ｑ！！：∑！！：！！：盟！：垒
ＲＳＶ检测的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法引物名称、基因区域及序列
４０个循环，７２℃延伸７ｒａｉｎ。得到预期ＤＮＡ片段后，按照ＱＩＡＧＥＮ＠试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ公司）说明书进
行片段回收纯化。将纯化的ＤＮＡ与ｐＧＥＭ＠－Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）连接后转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞，经蓝白斑筛选出阳性克隆，经序列测定确证后
进行质粒ＤＮＡ提取，得到含有目的片段的ＲＳＶＡ―ｐＧＥＭ－Ｔ质粒和ＲＳＶＢ―ｐＧＥＭ―Ｔ质粒。将质粒ＤＮＡ用限制性内切酶ＳａｌＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）线性化后回收，并将回收的ＤＮＡ应用Ｔ７
ＲｉｂｏＭＡＸｌＭＥｘｐｒｅｓｓ
ＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）
进行体外转录，操作按照说明书进行。转录产物经酚氯仿纯化后，通过丘比特双链ＲＮＡ检测试剂
盒（Ｑｕａｎｔｉ－ｉＴＹＭ
ｄｓＲＮＡＡｓｓａｙ
ｋｉｔ）及丘比特荧光检
测仪（ｔｈｅＱｕｂｉｔＴＭ
ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ，２―１００
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｏｔ：５５３１８Ａ）进行ＲＮＡ定量，操作按照
说明书进行。
五、ＲＳＶ毒株的ＲＴ－ＬＡＭＰ方法检测
采用日本荣研公司生产的Ｌｏｏｐａｍｐ＠ＲＮＡ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ试剂盒进行ＲＴ．ＬＡＭＰ扩增反应，反应体系如下：每管反应体积为２５斗ｌ，其中２×
Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｍｉｘ（ＲＭ）１２．５仙ｌ，ＲＳＶＦ３（１０ｐ。ｍｏｌ／Ｌ）
０．５¨ｌ，ＲＳＶ
Ｂ３（１０¨ｍｏｌ／Ｌ）０．５斗ｌ，ＲＳＶ
（８０ｐ。ｍｏｌ／Ｌ）０．５斗ｌ，ＲＳＶＢＩＰ（８０ｔｘｍｏｌ／Ｌ）０．５斗ｌ，
ＲＳＶＬｏｏｐ
Ｆ（４０ｉｘｍｏＬ／Ｌ）０．５恤ｌ，ＲＳＶ
Ｂ（４０斗ｍｏｌ／Ｌ）０．５¨ｌ，ＤｉｓｔｉｌｌｅｄＷａｔｅｒ（ＤＷ）３．５
ｔｘｌ，Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｘ（ＥＭ）１．０ｌｘｌ，ＲＳＶ毒株模板ＲＮＡ５．０“ｌ。将上
述试剂添加完毕后，使用涡旋仪混合３次，每次１
混匀后将反应管离心数秒，置于Ｌｏｏｐａｍｐ＠ＬＡ－３２０Ｃ
实时浊度仪（日本荣研化学株式会社）上检测并记
录结果。反应条件为６３℃恒温６０ｍｉｎ后升温至８５℃持续５ｍｉｎ。ＲＴ―ＬＡＭＰ结果判别方法：采用
ＬＡ一３２０Ｃ软件结果判别和肉眼观察结果判别两种方
法进行综合判断：ＬＡ一３２０Ｃ软件的Ｒｅｓｕｌｔ界面中，出现红色则代表结果为阳性，出现绿色则代表结果为
阴性，蓝色部分代表扩增量；Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ界面为与Ｒｅｓｕｌｔ界面相对应的ＲＴ―ＬＡＭＰ实时扩增曲线，当出
现上升的实时扩增曲线则表示出现阳性扩增反应，否则为阴性。采用肉眼观察进行结果的判别，当反
应管内的混合液变为白色浑浊，或反应管底部出现白色沉淀则为ＲＴ―ＬＡＭＰ扩增阳性，无色透明且未见白色沉淀者为阴性。本实验的阳性对照采用ＲＳＶＡ．ｐＧＥＭ―Ｔ质粒，阴性对照使用双蒸水（ｄｄＨ：Ｏ）。
六、ＲＴ―ＬＡＭＰ方法灵敏度检测
分别对ＲＳＶＡ亚型和ＲＳＶＢ亚型体外转录
ＲＮＡ进行１０倍梯度稀释，选取８个浓度（１拷贝／批ｌ
至１０７拷贝／斗１）ＲＮＡ各１斗ｌ，采用Ｌｏｏｐａｍｐ＠ＲＮＡ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ试剂盒（日本荣研化学株式会社），
应用所建立的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法进行检测并记录曲线。
七、ＲＴ．ＬＡＭＰ方法特异性检测
采用ＲＳＶＡ亚型标本（编号３０９６０）、ＲＳＶＢ亚型标本（编号２３５４０），以及其他呼吸道常见病毒，包括ＤＮＡ病毒，如腺病毒ｌ、２、３、７、１ｌ型（ＡＤＶｌ、ＡＤＶ２、ＡＤＶ３、ＡＤＶ７、ＡＤＶｌｌ）、巨细胞病毒（ＣＭＶ）、
ＥＢ病毒（ＥＢＶ）、单纯疱疹病毒１、２型（ＨＳＶＩ、
Ⅱ）、细小病毒、人博卡病毒（ＨＢｏＶ）的ＤＮＡ，以及
ＲＮＡ病毒，如流感病毒Ａ１、Ａ３、Ｂ型（Ｉｎｆ
Ａ１、Ａ３、
Ｂ）、副流感病毒１、２、３、４型（ＰＩＶ１～４）、鼻病毒
（ＨＲＶｌ４）的ＲＮＡ进行方法特异性检测，其中ＡＤＶ３、７型为分离株，ＨＳＶＩ、Ⅱ型为标准株，其余均为
首都儿科研究所附属儿童医院患儿鼻咽分泌物标
本。ＡＤＶ３、７型为首都儿科研究所病毒研究室分离
的病毒株；ＨＳＶＩ为标准病毒株ＳＭ４４株，ＨＳＶ１１为
标准病毒株ＳＡＶ株，由中国药品生物制品检定所提供。特异性检测采用Ｌｏｏｐａｍｐ＠ＲＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ试剂盒（日本荣研化学株式会社）。
八、ＲＴ一巢式ＰＣＲ方法检测临床标本
参照本实验室先前建立的ＲＴ．巢式ＰＣＲ的ＲＳＶ分型检测方法【ｌ０｜，对１０１例急性呼吸道感染患
儿的呼吸道标本进行ＲＳＶ检测，并通过２％琼脂糖
凝胶电泳区分Ａ、Ｂ亚型。其中ＲＳＶＡ亚型预期扩增片段为２５０
ｂｐ，ＲＳＶ
Ｂ亚型预期扩增片段为
３４１ｂｐ。
一、灵敏度检测结果体外转录ＲＮＡ（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ―ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｅｄ
ＲＮＡ）丘比
特荧光检测仪定量结果显示ＲＳＶＡ亚型ＲＮＡ浓度
为７７．３斗ｇ／ＩＩｌｌ（５．７５×１０１４拷贝／１１１１），ＲＳＶＢ亚型ＲＮＡ浓度为３４．２仙ｇ／ｍｌ（２．５４
１０１４拷贝／ｍ１）。
灵敏度检测结果显示，在６０ｍｉｎ内，ＲＳＶＡ及
Ｂ各１拷贝／灿ｌ至１０７拷男２／ｐｄ共８个ＲＮＡ稀
释梯度均呈阳性扩增，提示ＲＴ―ＬＡＭＰ方法在检测ＲＳＶＡ、Ｂ亚型时每反应均可检出１个拷贝ＲＮＡ
（图１）。
Ｏ６Ｏ５０４０３
Ｏ２０１０００１
扩增时间（ｍｉｎ）
二、ＲＴ―ＬＡＭＰ方法的特异性检测结果
同时对已确定为ＲＳＶＡ、Ｂ亚型的ｌ临床标本以
及其他常见的ＤＮＡ或ＲＮＡ病毒应用所建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ方法进行检测，结果显示只有已确定为ＲＳＶＡ、Ｂ亚型的临床标本出现典型的阳性扩增，未见其他病毒的特异性扩增，提示所建立的方法的特异性好，与其他病毒见无交叉反应（图２）。
三、ＲＳＶ病毒株的ＲＴ．ＬＡＭＰ法检测
５株经基因序列分析测定的ＲＳＶ分离株应用所
建立的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法进行ＲＳＶ检测，同时应用
ＤＥＰＣ处理过的去离子水作为空白对照，结果显示４株ＲＳＶＡ型和１株ＲＳＶＢ型分离株均出现典型的ＲＴ．ＬＡＭＰ阳性扩增曲线，最早出峰时间约为
ｍｉｎ，最晚出峰时间约为２８ｍｉｎ，而空白对照无扩
增（表２、图３）。
图Ａ为结果界面：样品顺序为ｌ：呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ａ型，２：ＲＳＶＢ，３：腺病毒（ＡＤＶ）１型，４：ＡＤＶ２，５：ＡＤＶ３，６：ＡＤＶ７，７：ＡＤＶＩｌ，８：ＥＢ病毒；图Ｂ为扩增曲线界面，样品顺序与结果界面图相对应。图中可见只有１、２道（ＲＳＶＡ、Ｂ亚型）出现阳性扩增，其他道（其他病毒）未见阳性扩增
ＲＴ－ＬＡＭＰ方法特异性检测扩增结果及曲线
表２５株呼吸道合胞病毒分离株的ＲＴ―ＬＡＭＰ
方法检测结果
四、ＲＴ―ＬＡＭＰ方法检测临床标本
１０１例急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本经ＤＦＡ检测确定为ＲＳＶ阳性的４０例，阴性的６１例。
根据ＲＴ－ＬＡＭＰ方法检测ＲＳＶ分离株的出峰时间，将扩增反应时间设定为６０ｍｉｎ，单个样本从加样
至扩增完毕整个操作过程所需时间６５～７０ｍｉｎ。对上述１０１例标本应用ＲＴ－ＬＡＭＰ方法进行ＲＳＶ检测，共检出ＲＳＶ阳性标本３７例，阳性检出率为
３６．６％（３７／１０１）。
９４．１％，两种方法的一致性好（Ｋａｐｐａ＝０．８７１）。
应用巢式ＰＣＲ方法对上述１０１例标本进行检
测，共检出ＲＳＶ阳性３５例，其中包括ＲＳＶＡ亚型讨
３２例，Ｂ亚型３例，总阳性检出率为３４．７％（３５／
呼吸道感染是引起世界范围内５岁以下儿童死
１０１）。
亡的首位原因，儿童呼吸道感染绝大多数由病毒引将ＲＴ―ＬＡＭＰ方法分别与ＤＦＡ及ＲＴ一巢式ＰＣＲ起，而ＲＳＶ又是儿童急性呼吸道感染中最重要的病方法进行比较（表３）。在４０例ＤＦＡ检测为ＲＳＶ阳毒病原体之一¨１｜，常引起儿童下呼吸道感染。病毒性的标本中，ＲＴ―ＬＡＭＰ法共检出ＲＳＶ阳性３６例；６ｌ核酸检测技术由于快速、特异、敏感等特点，与病毒例ＤＦＡ检测为阴性的标本中，ＲＴ．ＬＡＭＰ法检出分离法比较，耗时短且灵敏度高，更适合用于临床和
ＲＳＶ阳性１例。３５例ＲＴ．巢式ＰＣＲ检测为ＲＳＶ阳实验室快速诊断。
性的标本中（ＲＳＶＡ亚型３２例，ＲＳＶＢ亚型３例），ＲＴ―ＬＡＭＰ方法作为检测ＲＮＡ病毒核酸的新方
ＲＴ―ＬＡＭＰ方法检测ＲＳＶ阳性３３例，其中有２例巢法，在国外已经有文献报道应用其对ＲＳＶ进行检
式ＰＣＲ确定为ＲＳＶＡ亚型的标本ＲＴ．ＬＡＭＰ方法检测旧圳，但由于ＬＡＭＰ方法中需要针对ＲＳＶ靶基因
测为阴性；６６例巢式ＰＣＲ检测为阴性的标本中，有
的６―８个不同区域设计出４～６条引物，因此引物４例ＲＴ．ＬＡＭＰ法检测为ＲＳＶ阳性。
设计对靶基因的保守性要求较高，而ＲＳＶＡ、Ｂ亚型问在基因序列上存在较大的差异，很难设计出能同时扩增两个亚型的引物对，文献［８－９］设计了分别针
对ＲＳＶＡ、Ｂ亚型的两套ＲＴ．ＬＡＭＰ引物对，分别加入到两个不同的反应管内才能完成同一份标本的
ＲＳＶ检测，增加了临床检测的成本，这种方法并不适用于我国基层医院的ＲＳＶ快速检测。
本研究拟建立一种可以同时检测ＲＳＶＡ、Ｂ亚
型的ＲＴ．ＬＡＭＰ方法。研究之初分别针对基因序列
相对保守的Ｎ蛋白基因、Ｆ蛋白基因和Ｍ蛋白基因
从左至右，１：呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ａ型，２：ＲＳＶ
设计了引物对，虽然Ｎ蛋白和Ｆ蛋白基因序列的保
ＲＳＶＡ．ＰＧＥＭ－Ｔ质粒，４、５：ＤＥＰＣ去离子水。图中可见ｌ一３反应管出现白色浑浊，为ＲＴ―ＬＡＭＰ扩增阳性，４、５管呈无色守性较Ｍ蛋白高，但所设计出的ＲＴ．ＬＡＭＰ引物在
透明，ＲＴ．ＬＡＭＰ检测为阴性
实际扩增ＲＳＶ分离株时效果并不理想，平均出峰时
ＲＳＶ分离株的ＲＴ．ＬＡＭＰ扩增肉眼观察结果
间为５０―６０ｍｉｎ。经过重复设计试验及反复筛选
后，最终确定以Ｍ蛋白基因保守区设计的ＲＴ―ＬＡＭＰ
ＲＴ．ＬＡＭＰ方法与ＤＦＡ及ＲＴ－巢式ＰＣＲ在检测
引物在扩增ＲＳＶＲＮＡ时较为理想，４株ＲＳＶＡ亚型
呼吸道合胞病毒中的比较（例）
和１株ＲＳＶ
Ｂ亚型分离株经ＲＴ―ＬＡＭＰ方法检测均
为阳性，出峰时间均在３０ｍｉｎ以内。
灵敏度和特异性检测结果显示，所建立的
ＲＴ―ＬＡＭＰ方法在检测ＲＳＶＡ或Ｂ亚型时每个反应
均可检出１个拷贝的ＲＮＡ，由此说明所建立的方法灵敏度高；交叉反应实验表明与其他病毒间无交叉
反应，表明所建立的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法特异性好。１０１
例因急性呼吸道感染的住院患儿鼻咽分泌物标本
中，ＲＴ―ＬＡＭＰ总阳性检出率略高于ＲＴ－巢式ＰＣＲ。
所建立的检测ＲＳＶ的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法与ＤＦＡ
所建立的ＲＴ．ＬＡＭＰ方法与ＤＦＡ、ＲＴ．巢式ＰＣＲ符合相比较阳性符合率为９０．ｏ％，阴性符合率为率高，一致性好。
９８．４％，总符合率为９５．０％，两种方法的一致性好
在实际扩增临床标本的过程中发现，我们建立
（Ｋａｐｐａ＝０．８９５）；与ＲＴ一巢式ＰＣＲ相比较阳性符合
的ＲＴ―ＬＡＭＰ方法在检测ＲＳＶ标本的灵敏度虽高于
率为９４．３％，阴性符合率为９３．９％，总符合率为传统的ＲＴ一巢式ＰＣＲ，却尚不及ＤＦＡ敏感，初步分
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