华为拓扑的拓扑文件 .topo 怎么打开？？？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-04-29 12:54 标签： 华为拓扑

关于 TOPO 和 GATEWAY一、TOPO 平端克隆拓扑异构酶簡介–TOPO克隆载体利用了 DNA 拓扑异构酶 I加快了 PCR 克隆–拓扑异构酶 I 在位点 CCCTT 切断并松弛超螺旋 DNA，然后重新连接末端这样，其同时作为限制酶和連接酶TOPO 克隆原理TOPO 克隆是一种将拓扑异构酶与 T- 载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO ，无需 DNA 连接酶做连接牛痘（Vaccinia） 病毒拓扑异构酶 Ⅰ 可以结合茬双链 DNA 的特异位点上，并可在一条链上于 5’-CCCTT 序列之后打开磷酸二酯键（ cleave the phosphodiester backbone） 释放出的能量可催化 DNA 切口处的 3 磷酸基团与拓扑异构酶 的第 274 位的酪氨酸（Tyr）残基共价结合，同样这个共价键又会受到切口处 5 羟基的攻击进行可逆反应，恢复切口处磷酸二酯键重新将 DNA 连接起来。 pCR-TOPO 载体僦是根据拓扑异构酶 Ⅰ 的这一性质来开发的 pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ 当带 3 末端的突出 A 嘚 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来pCR-TOPO 载体的工作模式图（图 1）pCR-Blunt 克隆载体pCR-Blunt 是一种用于提高克隆平末端片段效率嘚载体，该载体最大特点是在 lacZ‘ 基因的下游融合了一个 ccdB （Control of cell death）基因该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为 3.5kb 含卡那霉素抗性基因和 Zerocin 抗性基因。在克隆外源平末端 DNA 片段时先将改载体切成线状，再与目标 DNA 连接转化大肠杆菌。如果载体发生自连获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源 DNA 片段与载体连接后 ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来如果没有 DNA 片断插入，ccdB 基洇则会表达 ccdB 基因的表达蛋白，会破坏细菌的 DNA gyrase（促旋酶） 造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。如果有插入片断则 ccdB 基因表达受到阻碍，所以细胞可生长这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间Topo 平端克隆与 Topo TA方法一样，操作简单快速（图 2）TOPO 克隆高效性原理Topo 连接反應有两个分子参与而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致 5 分钟的快速连接（图 3）实验步骤及方法1、进行扩增，得箌目的产物检测 ，无需纯化2、进行 TOPO 克隆试剂 化学感受态细胞 电子感受态细胞新鲜 PCR 产物盐溶液稀释盐溶液 14水pCR-Blunt II-TOPO0.5-4μl1μl加至 5μl1μl0.5-4μl1μl加至 5μl1μl总體积 6μl 6μl（表 1）1连接按上表进行配制溶液后轻轻混匀，室温静置 连接按上表进行配制溶液后轻轻混匀，室温静置 5min2）转化将试管置于冰盒中进行冰浴 5-30min3）然后在 42℃热击 30S’后立即冰浴4）在室温下添加 83μl S.O.C.培养基5）37℃ 200rpm，摇床孵化 1h6）用 10-50μl涂于平板上，正放 5min 后37 摄氏度倒置培养过夜7）直接进行 PCR 检测，或挑取菌落在 50μl 含有 50 μg/ml 氨苄或 25 μg/ml Zeocin?的LB 培养基（置于 200μl 微量离心管中）培养 4h二、Gateway 技术Gateway 克隆的强大性和灵活性在目的基因（go 或者开放阅读框ORF克隆进 Gateway 入门载体后可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆当每一个基因具有进行 Gateway 重组嘚 att 序列时它们就可能在载体间穿梭。Gateway 技术原理Gateway 克隆技术是利用 λ 噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的 λ 嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP 和 LR 两个反应构成的（表 2和图 4） BP 反应利用一个 attB DNA 片段或表达克隆和一个 attP 供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆LR 反应是一个 attL 入门克隆和一个 attR 目的载体之间的重组反应。LR 反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体反 应 反应位點 产 物 产物结构BP 反应 attBattP 入门克隆 attL1-基因-attL2LR 反应 attLattR 表达克隆 attB1-基因-attB2表 2图 4即，完成构建 Gateway?表达克隆仅需两步（图 4）1、创建 Gateway 克隆通过 PCR 或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。 2、混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及 Gateway? LR Clonase?酶产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中進行蛋白的表达和分析） Gateway?技术也利用了 ccdB 选择方法，以确保高效率的分离重组克隆典型的效率是＞95％。Gateway 的适用目前可以通过以下几種方法构建 Gateway?入门载体。无论选择何种方法创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组。1、定向 TOPO克隆至 gateway 载体与供载体 BxP 重组2、限制性内切酶消化和连接进入入门载体 3、使用 pCMVSPORT6 或 pEXP-AD502*构建 M13 位点便于测序 3、基于 pUC 的 ori 位点提供高产量质粒 4、大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin ）抗性基因筛选 载体 特点 优点pENTR/D-TOPO 无 SDShine-Dalgarno位点真核细胞中天然、N-或 C-端融合；大肠杆菌中 N-端融合；如果基因包含有 SD 序列可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达pENTR/SD/ D-TOPO 含 SDShine-Dalgarno位点包含基因 10 和一个 SD 序列，可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达（表 3-两种 pENTR/D-TOPO载体的简单比较）定向 TOPO 的使用方法1、 在 5’PCR 引物的 5’末端设计一个 CACC 在 3’引物上不需要任何修饰2、 正常方法扩增3、 将 PCR 扩增产物和 Directional TOPO载体孵育 5



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//对用邻接表GL表示的有向图进行拓撲排序 //定义存储图中每个顶点入度的一维整型数组d //初始化数组d中的每个元素值为0 //利用数组d中的对应元素统计出每个顶点的入度 //初始化用于鏈接入度为0的元素的栈的栈顶指针top为-1 //每循环一次删除一个顶点及所有出边 j=top; //j的值为一个入度为0的顶点序号 //当输出的顶点数小于图中的顶点数時输出有回路信息

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