反相色谱法，正相色谱法，HILIC色谱法等名词解释-仪表展览网
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上海谱生分析仪器有限公司色谱柱专卖反相色谱法，正相色谱法，HILIC色谱法等名词解释反相液相色谱是目前为止实验室中使用最普遍的液相色谱分离技术，谱生分析仪器销售多种广受用户喜爱的色谱柱产品。最通用的色谱模式是反相色谱,它由极性流动相和非极性的固定相组成，典型的极性流动相是水或含极性溶剂的缓冲液，如甲醇，乙腈或四氢呋喃，非极性固定相是键合在硅胶或杂化颗粒上的烷基键。最近几年，科学家门在色谱分离介质的研究开发和应用方面投入很多，以改变色谱柱分离效果，增加其pH稳定性并提供互补的分离选择性。在反相键合相推出之前，正相色谱是最流行的分离技术。它依赖于待分析物和固定相表面极性官能团的相互作用，当使用非极性溶剂作流动相时，这种相互作用最大。正相色谱是一种非常强大的分离方法，因为有大范围的溶剂选择来调节分离选择性。然而，由于正相色谱比较复杂，其应用范围也受到了限制。在某些情况下，平衡时间较长，重现性也不好，如流动相中低浓度的极性污染物会影响分析的灵敏度。如果这些问题得到控制，相比反相方法，正相色谱由于经常使用低粘度溶剂，可得到更好的谱图。亲水相互作用色谱长期被人们使用，但是HILIC这个名词仅仅是最近才被使用。分析物通常是极性化合物，如极性代谢物，碳水化合物或肽。HILIC 可以被看作正相色谱向水性流动相领域的延续。流动相是水相缓冲液(& 40%)及有机溶剂。固定相是强亲水性的极性吸附剂，如硅胶键合相，极性聚合物填料或离子交换吸附剂。这些固定相的共同特点是它们和水的作用力很强，因此属于&亲水性&。HILIC模式使用的梯度和反相模式相反。初始条件包括高比例有机相，典型的浓度是95%有机相如乙腈，逐步降低到水相。因此，HILIC色谱又被称为反反相色谱（reversed-reversed-phase）。离子交换色谱分离中，蛋白质表面分布的净电荷决定了蛋白与填料表面带电官能团的相互作用。蛋白质表面的电荷必须与填料的电荷性质相反才能发生相互作用。可以控制的变量有缓冲液pH值，缓冲液浓度，梯度斜率和盐浓度梯度，为优化分离提供了一系列选择。生物分子在溶液中的实际大小和形状不同是分子排阻色谱法的基础，其分离机理是根据生物分子的尺寸不同在填料中的保留时间不同得以分离。分子排阻色谱常用的填料有大颗粒的葡聚糖凝胶、聚合物填料以及高效耐压的小颗粒刚性填料等。分子排阻色谱法在蛋白分离领域有广泛的应用，操作简单。同时，也可用分子排阻色谱来做缓冲液交换，因为低质量的盐分子很容易同蛋白质分开。亲和色谱的原理是基于生物分子（例如，单克隆抗体或重组蛋白）与固定相配体的生物特异性相互作用而实现的。生物分子能得到生物活性的高回收率和较好的纯度。现代亲和色谱填料将坚固的耐碱填料，与增强的柱床稳定性相结合，达到将粗提样品从毫克至克级的高通量制备纯化分离。疏水相互作用色谱法是常用的蛋白分离模式，其分离机理是蛋白在高离子强度缓冲溶液条件下，蛋白质溶解度降低，与中等疏水性的填料表面发生作用，然后将蛋白质用降低离子强度的梯度进行洗脱。该法分离度高，并能保持蛋白质生物活性。疏水相互作用色谱使用水相缓冲液系统，缓冲液的盐浓度和种类，缓冲液pH值，表面活性剂，改性剂，色谱柱温度和填料都会影响分离度。由于蛋白质在高离子强度下彼此也会发生相互作用，当待分离原料已有部分纯化时，可获得更高的分离度。而且高离子强度下也不方便大体积样品上样，如在疏水色谱分离前用硫酸铵沉淀，则是很好的选择。因此，疏水作用色谱是蛋白质纯化方案中很好的后续步骤。&疏水和反相色谱指南_百度文库
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疏水和反相色谱指南
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正相色谱是指采用极性物质作为..
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正相色谱与反相色谱——高等生物分离技术
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3秒自动关闭窗口谁能告诉我一下反向液相色谱的工作原理吗?它与正向的有什么区别吗?
██小雨交██
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法.1．液固色谱法 使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离.分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程.常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm.适用于分离分子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾.常用于分离同分异构体.2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离.分离过程是一个分配平衡过程.
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化.由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很少采用.现在多采用的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱.液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC).正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷）,常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间.常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）.
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间.适用于分离非极性和极性较弱的化合物.RPC在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右.
随着柱填料的快速发展,反相色谱法的应用范围逐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析.为控制样品在分析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值.但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8）,太高的pH值会使硅胶溶解,太低的pH值会使键合的烷基脱落.有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作.正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出
从上表可看出,当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）.3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂,常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架,在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）.被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换,根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离.
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相.被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外,它还受流动相的pH值和离子强度影响.pH值可改变化合物的解离程度,进而影响其与固定相的作用.流动相的盐浓度大,则离子强度高,不利于样品的解离,导致样品较快流出.
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸.4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法,是液液色谱法的分支.它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相中溶解度增大,从而使其分离效果改善.主要用于分析离子强度大的酸碱物质.
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐,如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等.另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对.
分析酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐.
离子对色谱法常用ODS柱（即C18）,流动相为甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂,在一定的pH值范围内进行分离.被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关.5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料,流动相是可以溶解样品的溶剂.小分子量的化合物可以进入孔中,滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出.它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离.常用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等.色谱法的基本原理利用样品混合物中各组分理、化性质的差异,各组分程度不同的分配到互不相溶的两相中.当两相相对运动时,各组分在两相中反复多次重新分配,结果使混合物得到分离.两相中,固定不动的一相称固定相；移动的一相称流动相.分类：根据流动相分—以气体作流动相—气相色谱——固定相为液体 气-液色谱
固定相为固体 气-固色谱
—以液体作流动相—液相色谱——固定相为液体 液-液色谱
固定相为固体 液-固色谱
—当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时——超临界色谱 根据固定相的附着方式
—固定相装在圆柱管中—柱色谱
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄膜色谱（平板色谱）
—液体固定相涂在纸上—纸色谱（平板色谱）根据分离机理
—分配色谱—样品组分的分配系数不同
—吸附色谱— 样品组分对固定相表面吸附力不同
—体积排阻色谱—利用固定相孔径不同,把样品组分按分子大小分开
—离子交换色谱—不同离子与固定相商相反电荷间的作用力大小不同根据极性
—流动相极性＞固定相极性-反相色谱
—流动相极性＜固定相极性-正相色谱
气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物,而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质,如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质.所以,HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱.
一、吸附色谱（adsorption chromatography）又叫液固色谱法：流动相是液体,固定相是固体.分离原理：固定相是固体吸附剂,吸附剂是多孔性微粒物质表面有吸附中心.样品组分与流动相竞争吸附中
心.各组分的吸附能力不同,使组分在固定相中产生保留时间不同和实现分离.固定相： 固定相通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂.活性硅胶最常用.流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物,如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲
烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等. 应用： 对于极性,结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法,如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的
分离. 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象.二、分配色谱原理： 固定液机械的吸附在惰性载体上,样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同,分别进入两相分配而实现分离.固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上.如全多孔微粒硅胶吸附剂.根据极性不同分类：正相分配色谱—固定相载体上涂布的是极性固定液；
流动相是非极性溶剂；
可分立极性较强的水溶性样品；
弱极性组分先洗脱出来.
反相分配色谱—固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液；
流动相是极性溶剂；
强极性组分先洗脱出来.
液-液分配色谱固定相中的固定液体往往容易溶解到流动相中去,所以重现性很差,且不能进行梯度洗脱,已经不大为人们所采用.三、键合相色谱
考虑分配色谱法中固定液的缺点,因此将各种不同的有机关能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上,固定相就不会溶解到流动相中去了.键合固定相优点：○ 对极性有机溶剂有良好的化学稳定性
○使色谱柱的柱效高、寿命长
○实验重现性好
○几乎适于各种类相的有机化合物的分离,尤其是k’宽范围的样品
○可以梯度洗脱根据极性不同分类：正相键合相色谱—固定相极性＞流动相极性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子.
适于分离脂荣、水溶性的极性、强极性化合物
反相键合相色谱—固定相极性＜流动相极性
固定相：烷基、苯基等非极性有机分子.如最常用的ODS柱或C18柱就
是最典型的代表,其极性很小.
适于分离非机性、弱极性离子型样品,
是当今液相色谱的最主要分离模式.正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系.其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等,代表性的流动相是正己烷.吸附色谱也属正相HPLC. 反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系,与正相HPLC体系正好相反.其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱,Octa Decyltrichloro Silane),代表性的流动相是甲醇和乙腈.四、体积排阻色谱（SEC,size exclusion chromatograghy）（又称凝胶色谱和分子筛色谱） 原理： 以多孔凝胶（如葡萄糖,琼脂糖,硅胶,聚丙烯酰胺等）作固定相,依据样品分子量大小达到分离目
的.大分子不进入凝胶孔洞,沿多孔凝胶胶粒间隙流出,先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞,
在柱中被强滞留,后被洗脱.根据样品性质分类：凝胶过滤（GFC）—用于分析水溶性样品,如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核
苷酸、多糖.
凝胶渗透（GPC）—用于分析脂溶性样品,如测定高聚物的分子量.
SEC主要依据分子量大小进行分离,因此与样品、流动相间的相互作用无关.因此不采用改变流动相的组成来改善分离度. 五、离子交换色谱（ion exchange chromatography, IEC）分离原理：使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相.带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离.不同离子与交换基的作用力大小不同,在树脂中的保留时间长短不同,从而被相互分离.
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