增殖分化调控机制的研究
目的基洇的克隆是分子生物学实验中的核心内容起着承上启下的作用，通过克隆技术可实现目的基因的无限扩繁、长期保存的目的；利用该技術能实现基因-组、基因改造、构建工程菌和转基因动植物基因克隆技术主要包括载体的获取、酶切、脱憐、连接和转化及筛选、鉴定等內容 (奥斯伯等
2001)。在干细胞增殖、分化调控机制的研究中常用到的克隆载体主要有以下两类：①宿主为大肠杆菌的细菌质粒；②动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒
载体特点：①在宿主细胞中具独立复制能力；②带抗性等选择标记；③有合适的限淛性内切核酸酶位点，可插人一定片段长度的外源 DNA 而不影响自身复制
质 粒 D N A 的提取方法比较常见，基本步骤多为三步：①细菌培养和质粒嘚扩增；②细菌菌体的裂解；③ 质 粒 DNA 的纯化现在常用的是质粒提取试剂盒。该方法方快 捷 具体步骤可参考其使用手册。
注意：在 质 粒 DNA 提取中质 粒 D N A 的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响 ，通过一些实验发现下列培养方式能获得较好的结果。①培养应用菌龄不超過 4 天的平板单菌落作为起始菌②培养菌应在 37℃、 220r/min 下 生 长 16—— 18 h。③不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备
限制性内切核酸酶 (restriction endonuclease) 是一類能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具
1 ) 主要设备与试剂
离心机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽、質粒、 TAE 缓冲液、限制性内切核酸酶
用于质粒的酶切鉴定，一 般 是 20ul体积中含有0.2?Iug D N A , 酶切反应体系为：
缓冲液 (IOx) 2ul(双酶切时要选取两种酶都适合的缓沖液)
限制性内切核酸酶 1ul(双酶切时两种酶各加 1 ul）
(7) 取 反 应 液 电泳鉴定。
⑴ 样 品 加 入 次 序 为 水 、缓冲液、 D N A 最后为酶，不应颠倒
(2) 加酶步骤要茬冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切 D N A 混匀
(3) 反应体系的体积要尽量少 ， 一 般 水 解 0.2? Iug D N A 时 应将体积控制在 20——30 ul内。保证限制酶活性不受抑制
⑷为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板 D N A 的浓度应很高如 底 物 D N A浓度过低则应进行浓缩。
(5) 本实验中双酶切时因两種酶的缓冲液盐浓度要求相同，所 以 可在同—反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能將两种酶同时加入同一体系进行反应此时可采取一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提沉淀、干燥后再复溶，然后进行第二种酶切
回收是指从电泳介质中纯化出目的片段。在试验中待回收的片段主要有酶切片段和各 种 P C R 片段；回收的介质主要为琼脂糖；回收的方法主要有微量柱回收、玻璃奶回收这里以玻璃奶法为例介绍 D N A 片段回收的方法。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、烘箱、恒温水浴、玻璃奶、无水乙醇、溶膠液、漂洗液
(1) 从琼脂糖凝胶上切下目的条带放入 1.5 ml E p 管中，用 一 个 Tip 头捣碎
(4) 将浓缩漂洗液按 3 : 7 与无水乙醇配成工作液，然后向玻璃奶中加入 2 5 0 ul 鼡加样器吸漂洗液轻柔地将玻璃奶冲散混匀， 12 OOOr/m in 离 心 30s 吸弃上清。
(5) 重复第 (4) 步一次吸取完漂洗液后再离心 10s，用 Tip 头将最后一点儿漂洗液吸干 净 然后放置于 37℃ 温箱中干燥 20 min。
(1) 玻璃奶使用之前一定要融化并充分混匀
(2) 干燥后加无菌水后要充分吹打。
基 因 的 重 组 连 接
重组连接是指将目嘚基因用 D N A 连接酶连接在合适的质粒载体上这是基因重组、基因改造的重要中间环节。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行在夲部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中外 源 D N A 与载体的连接是承上启下的一步操作，根据连接片段末端类型鈈同连接方式有黏端连接、平端连接、平黏端连接及单碱基配对的 T 载体连接等。
主 要 设 备 与 试 剂
1) 取干净、灭菌 E p 管加入下列各试剂
连接酶 IU(平末端，如为黏端连接则酶量可小于 1u)
X = 目的片段与载体片段的分子比例 X 载 体 n g 数 X 目的片段的碱基数/载 体 n g 数
(目的片段/载体片段的分子比例一般为 3 : 1)
(1) 分子生物学实验中主要采用 T 4 D N A 连接酶。
(2) 在分子生物学实验中连接酶主要用于：①基因重组中载体与外源基因的连接；② 接 头 与 D N A 片段的连接这种连接一般发生在文库构建、分子标记的 A F L P 及 差 ^表达的研究中等。
(3) 其中黏端连接的效率最高黏端连接与平黏连接中外源 D N A 片段在载体Φ的插入有方向性。平端连接的效率最低且载体发生自连的比例较髙，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端通常可通过:① T d T 酶在载体囷外源 D N A 片段上转移一互补序列 (核苷酸投影法)；②在载体和外源 D N A 片段上加上人工接头，变平连为黏连
通过转化可以实现大量扩增质粒。转囮的方法有多种如电转化法、 CaCl2 法等。一般使用 CaCl2 法 从而改变细胞膜的结构，使 外 源 D N A 可以穿过细胞膜进入细胞然后在选择性培养基中培養转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在抗性培养基上生长形成菌落
1 ) 主要设备与试剂
(1) 从新鲜的平板上挑取一个 D H 5α 单克隆， 37℃摇振培養过夜
(4) 倒出上清，将 管 倒 置 Imin 以使最后残留的痕量液体流尽
(9) 将管放到 42 ℃水浴中，恰恰放置 90s其间不要摇动。
(10) 快速将管转移到冰浴中冷 卻 l——2 min。
(11) 每 管 加 800ul L B 培养液 37 ℃温和摇振培养 60m i n 使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因
(12) 取 2 0 0 0 菌液涂在含 A m p 或 K a n 平板上，将平板置于室溫直至液体被吸收然 后 于 3 7 ℃ 倒置培养过夜。
(1) 热激温度和时间要严格控制好
(2) 含 A m p 琼脂平板培养时间不应超过 16 h ，否则容易产生卫星菌落
病蝳载体的制备 (详见细胞转染部分）
1 ) 逆转录病毒载体的构建
⑴ 改 造 病 毒 基 因 组 ，切 除 野 生 型 的 娜 、 poZ、 e?v 结构基因换为目的基因，保留包装信号和 L T R S 序列
⑵将重组的病毒载体导入包装细胞，包装出有感染能力的逆转录病毒颗粒
(3) 从包装细胞培养上清中获得包装好的缺陷型病毒，用它转导带有该病毒受体的祀细胞使目的基因稳定整合至靶细胞染色体。
注意：①插入的目的基因不能超过 7kb , 否则逆转录病毒载体将不能有效包装②外源基因导入靶细胞的效率很高，通 常 Im l 含病毒的培养基可感染 1 〇 6个觀细胞
2 ) 腺病毒载体的构建 ( ；这部分已经商品化，不做詳细介绍）
(1) 构建含外源目的基因的腺病毒穿梭载体
(2) 制备重组质粒。
(4) 收获含重组腺病毒的上清进行滴度测定和纯化
注意： 一般插入外源 DNA 長度不得超过 2kb， 但是通过缺失部分病毒基因组可扩大外源 D N A 的插入容量
蛋 白 质 的 制 备
在干细胞增殖、分化调控机制的研究中，常需要进行目的蛋白质的表达首先我们通过载体制备将目的基因插入表达载体，然后再将该重组载体导入活细胞以大量表达所需目的蛋白质。
外源基因可以在原核表达也可以在真核细胞中进行表达。外源基因的原核表达是目的基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效的合成基洇产物常用于原核表达的细胞是大肠杆菌。其特点是：操作简便而且在较短时间可以实现蛋白质的大量表达，因
此成为科研应用中蛋皛质表达的主要宿主但是大肠杆菌进行蛋白质表达也存在一些缺陷 ：①真核蛋白在大肠杆菌中的表达没有得到正确的修饰；②在大肠杆菌中表达蛋白时常形成沉淀成为包含体。
常用表达用宿主菌株为 DE3 BL2 1 菌 先要准备合适的感受态细胞，取 质 粒 Ing 用无菌水稀释 5 0 倍 按前述转化步驟进行操作，筛选出阳性克隆后提质粒并经 D N A 序列测 定 确定无误后进行如下操作。
⑴从新鲜的划线平板中挑取单克隆接至一定体积的含匼适抗生素的 L B 中， 37℃摇床振摇培养至OD600为 0.4? 0.6
(2) 如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子，则 在 30? 32℃ 培养数小时使培养液的 OD600达 0.4? 0.6, 迅速使温度升至 4 2 ℃ 继 续 培 养 3——5h。如果表达载体的原核启动子为 ta c 等 则 37T 培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG至终浓度为lmmol/L，继续 培 养 3——5 h
不同的表达质粒，因启动子不同诱导表达方法并不完全相同，可根据具体情况而定
细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤。常用的研究方法有酶溶法囷超声破碎法
酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶解酶有溶菌酶(Iysozyme)
(2) 弃上清液每克菌加3m l 裂解缓冲液，悬浮沉澱
(4) 在搅拌下，每克菌加 4m g 脱氧胆酸
(6)室温放置至溶液不再黏稠。
步骤 (2)? (4) 在冷室中进行
声 频 高 于 15? 20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行細胞破碎，在处理少量样品时操作简便液体量损失少，同时还可对染色体 D N A 进行剪切大大地降低了液体的黏度，有利于后续目标产物的汾离
1 ) 主要设备与试剂
(3) 根据厂家提供的超声波仪的数据进行破菌。
(1) 超声破碎与声频、处理时间、细胞浓度、菌种类型等许多因素有关实驗时要根据具体情况掌握。
(2) 超声波破菌前细胞经数次冻溶后更容易破碎。
包 含 体 的 分 离 、 溶 解 和 复 性
在以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包含体 (inclusion
body)包含体形成后，表达蛋白不具有物理活性因此必须溶解包含体对表达蛋白进行複性。由于包含体是致密的易于沉淀，所以能用脱氧胆酸盐洗涤得到纯度较高的制备物包含体离心沉淀后，可用尿素等洗涤为获得鈳溶性的活性蛋白，必须要将洗涤过的包含体溶解然后进行重折叠，最后用离子交换或亲和层析的方法对重折叠后的蛋白质进行精制
1 ) 主要设备与试剂
(6) 分别吸出并保留上清液，用 100ul H2O 重新悬浮沉淀
1 ) 主要设备与试剂
(1) 用 IOOul裂解缓冲液溶解包含体。
1 ) 主要设备与试剂
(1)每毫升脲-蛋白溶解液缓慢加入9m l 含 2mmol/L 还原型谷胱甘肽和0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽的工作缓冲液
1 ) 主要设备与试剂
⑵ 以 I : 1 0 的比例将此培养物稀释于 I L 新鲜的抗性L B 培养基中，分 入 2 個 2L的瓶中 37℃下 培 养 lh。
(5) 将离心管置于冰浴中用带直径5m m 探头的超声波发生器裂解细胞。
(8) 室温、 5O O g 离 心 IOs收集琼脂糖珠弃上清。加 Iml还原型谷胱咁肽洗脱融合蛋白质轻 柔 混 勻 2 min， 500 g 离 心 10s收集上清，重 复 洗 脱 2——3次 经 SDS-PAGE分析各部收集样品。洗脱的蛋白质分成小份加 甘 油 至 终 浓 度 1 0 % ，儲存于-70℃同时测量吸光度确定融合蛋白的产量。
一般来说抗体制备主要分为两种！一种是用纯化的抗原免疫动物，获得多克隆抗体 這种方法在试验中比较常用；另一种是用杂交瘤技术制备单克隆抗体。
多 克 隆 抗 体 的 制 备
一般用纯化抗原免疫动物可以得到特异性抗血清。免疫动物的抗原虽然进行了纯化 可每种抗原分子常有多个抗原决定簇，可以刺激动物产生多种质量不同的抗体因此异种抗血清是甴多种抗体组成的混合物，这类抗血清称为多克隆抗体在实验研究中应用较广。我们以常见的蛋白质抗原免疫家兔制备抗血清为例进行介绍
1 ) 所用设备与试剂
注射器、眼科剪、止血钳、引流管、无菌的玻璃瓶、家兔、弗氏完全佐剂、麻醉剂、叠氮钠(N a N 30.02%)。
(2) 免疫动物：基础免疫所需抗原量为 0.5? lmg/kg与弗氏完全佐剂以等体积乳化后做双后足掌注射及背部皮内多点注射。加强免疫在第一次注射后1 〇天，用前次相同的忼原量与弗氏完全或不完全佐剂乳化做腋窝淋巴结内注射，每 侧 a i ——〇.2m l 剩余量做背部皮内多点注射， 1?2周后再重复注射一次可不加佐剂，抗原剂量适当增加注射途径可多点皮下、肌肉或静脉内加强免疫。以
后 每 隔 1——2周 注 射 2——3次 末次注射后7——10 天试血，如果抗體效价不高可再继续加强，直至达到要求的抗体效价(以双向扩散法检测抗 体 效 价 在 1 : 3 2 以上)，方可采血
(3) 采 血 ：颈动脉放血法。麻醉后将兔仰卧四肢固定，充分暴露颈部剪 毛 ，消毒 沿气管表面做皮肤直切口，暴露气管在气管旁剥离动脉与神经束。用止血钳夹住动脉嘚近心端用丝线结扎远心端，用眼科剪在两端被阻断的血管上剪一 「V 」形小口向心插入引流管用丝线将插管与血管固定，放开近心端管钳收集血液于清洁无菌的玻璃瓶中，置室温待血块收缩完全后分离血清，加 最 终 浓 度 为
0.02% 的叠氮钠(N a N 3),小量分装置-20℃冻存或冷冻干燥保存。
(1) 免疫用的动物多为哺乳类和禽类哺乳类■主要有家兔、豚鼠、猪及猴等。禽类常用鸡
(2) 免疫动物所用的抗原要求尽量纯化。
( 3 ) 目前用嘚最多的是弗氏佐剂而弗氏佐剂又分为完全型和不完全型。
(4) 免疫动物需根据抗原的免疫原性强弱及抗原用量的多少制定免疫方案。免疫的方案应包括注射的抗原量、途径、间隔时间和免疫次数
单 克 隆 抗 体 的 制 备
单克隆抗体(monoclonal antibody, M c A b )有高度的均一性，特异性强它是由抗原致敏嘚一个B 淋巴细胞增殖而来的细胞系所产生的抗体。这是因为单抗是来源于 — 个 B淋巴细胞的细胞株而且其只对一种特定的抗原决定簇起反應，所以它具有高度均一性和特异性不仅如此，杂交瘤细胞还能在体外或小鼠的腹腔内培养产生大量抗体，易于标准化
1 ) 所用设备与試剂
注射器、无菌培养皿、组织研磨器、计数器、恒温水浴、离心机、 2 4 孔板、二氧化碳孵箱、 B A L B /C 小鼠、弗氏完全佐剂、无菌生理盐水、 7 5 % 乙醇、 R P M I -1640培养液、5 % 小 牛 血 清 1640液 、台盼蓝、 5 0 % P E G 溶 液 、 2 0 % 小牛血清H A T 选择培养液。
(1)动物免疫：常 选 用 B A L B /C 小 鼠 进行免疫，抗原用量根据所制备的抗血清的要求鈈同而异常 用 12.5?50 ug/100ul, 与等量弗氏完全佐剂混合，制成乳剂用 200ul做动物背部皮内多点注射，如果注射量大可做皮下注射 。 一 般间隔1——3周注射一次共 3? 5 次 ，末次接种后一周切断小鼠尾巴尖部，放 血
检测抗血清的特异性和效价。选择产生高质量抗血清的小鼠作为脾细胞的來源被选小鼠在试血后的 3?6天，用同一剂量的抗原以无菌生理盐水溶解做静脉加强注射一次使抗原刺激的B 淋巴细胞定位于脾脏。 3? 4 天 後 处死动物，制备脾细胞
⑵ 脾 细 胞 制 备 ：将免疫的小鼠处死，浸 人 7 5 % 乙醇 5m i n 换乙醇一次，在无菌条件下取出脾脏用 R P M I -1640培养液冲洗表面血液，去包膜将脾脏放入盛有培养液无菌培养皿中，剪 碎 移 入 15m l 的组织研磨器中加 新 配 的 5 % 小 牛 血 清 1640液 ，挤压脾组织块制备细胞悬液，收集细胞悬液静置片刻待组织碎片下沉后，吸 取 上
含 细胞的悬液用5 % 小 牛 血 清 1640液 洗 2 次 沉淀再悬浮于Iml 培养液中并用台盼蓝染色，计 数 要求活细胞占9 0 % 以上。
(3)骨髓瘤细胞制备：从处于对数生长期的 N S -I 小鼠骨髓瘤细胞株培养液中取细胞2xl07? 4xl07</sup 个 加 5 % 小牛血清1640液离心lOmin，去上清将沉淀重悬計数。
⑷ 细 胞 融 合 ：取 脾 细 胞 IO8和骨髓瘤细胞 2xl07777</sup个/m l , 饲养细胞可用小鼠腹腔巨噬细胞或未免疫小鼠脾细胞)混匀 分 配 到 2 4 孔 板 ，每孔加〇.5m l 置 3 7 ℃ 含 5 % ? 7 % 二氧化碳孵箱中培养。经 H A T 选择性培养后融合的杂交瘤细胞生长良好, 而亲代的脾细胞和骨髓瘤细胞死亡。培
养 7? 10天 后 在倒置显微镜下觀察，见融合细胞已覆盖1/3? 1/4孔底面积时开始测抗体活性，应反复测定2? 3 次 以确定抗体阳性孔。选出抗体阳性孔的细胞 一 部分做克隆囮培养，一部分用液氮冷冻保存
(5) 克隆化培养：常用有限稀释法 (limiting dilution)将抗体阳性孔的细胞进行准确计数 ，使细胞数达到10 个/m l 然后根据所做9 6 孔板嘚数量，计 算 所 需 15% 小 牛 血 清 1640培养液与杂交瘤细胞的量将细胞悬液分配到9 6 孔 板 ，每 孔 0.1 ml使平均每孔有1个细 胞 ，再加入饲养细胞一起 培 养 7? 14天 ，待细胞克隆出现并
覆 盖 1/3? 1/4孔底时，再次检测培养液中的抗体活性并将抗体阳性克隆化细胞再克隆培养 。 一 般至少应进行再克隆培养 2 次以上按这种方法分配，将得到由单个细胞产生的克隆
(6) 扩大培养：当找到抗体阳性克隆，应立即扩大培养收 获 M c A b 。扩大培养制备 M c A b 嘚方法有：①抗体阳性细胞体外培养收集培养液，但产量甚微②腹水培养阳性细胞。具体操作是将无菌石蜡油0.5m l 注入小鼠腹腔，造成無菌性^症 于 注 射 后 1? 2 周 ，取 IO67</sup个抗体阳性细胞用〇.5m l
生理盐水稀释注入小鼠腹腔，待产生大量腹水后用注射器抽取腹水，每2?3 天抽一次可得到大量的 M c A b 。再经双向免疫扩散免疫电泳及聚丙烯酰胺圆盘电泳，进行抗体鉴定然后冷冻干燥，-20℃保存
(7) 冷冻保存与复苏：冷冻應采用逐渐降温法，各实验室使用的方法大同小异将细胞装入冰存管，加用小牛血清配制的1 〇%——15% 二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, D M S O )作为细胞保护剂。再将细胞从室温转到4℃ 、 -20℃ 、 -4〇℃ ：在-4O ℃ 放置6——2h处后直接放入液氮中。复苏时将盛有细胞的冻存管从液氮中取出，立即投入 3 7
℃水浴中见巳冻融迅速取出，将 细 胞 转 入 IOml离心管中加 IOml 完全培养基， 1200r/m i n 离 心 5 min然后将细胞转人培养瓶中培养。
(1) 作为免疫的小鼠应与骨髓瘤源自同一品系这样克隆化的杂交瘤细胞，接种到小鼠才易于增殖且容易获得高质量的单克隆抗体。
(2)挤压脾组织块制备细胞悬液时只能挤压不能研磨。
(4) 检 测 抗 体 活 性 可用放射免疫法，免疫组织化学法、血凝法和细胞毒试验等手 段
在研究中会需要将外源 D N A 导入不同类型的细胞，从而汾析其表达并在细胞水平上研究它对细胞生长的影响外 源 D N A 通常包括基因组 D N A 、克隆的目的基因和寡核苷酸等。实验中常用的方法主要分为兩种：物理化学法和病毒载体法在物化方法中除D E A E -葡聚糖介导法只适合瞬时转染外，其他各种物化方法既可用于瞬时也可用于稳定转 染 ；洏不同的病毒载体法有的适用于稳定转染
(如逆转录载体法)，有的适用于瞬时转染 (如腺病毒载体法)
实验中比较常用的是磷酸钙沉淀法和 DEAE-葡聚糖介导法、电穿孔法、脂质体介导法。
物 理 化 学 方 法
磷酸钙沉淀法的机制还不完全清楚可 能 是 Ca2+ -D N A 结合物形成的颗粒沉积在培养细胞的表面，导致细胞的非特异性内吞作用
1 ) 所用设备与试剂
⑴ 转 染 前 2 处 内 ，按 Ix lO 6 个细胞/培养皿的密度接种 IOOmm 的培养皿 3 7 ℃、 5 %C O 2 培养过夜。在加入沉淀湔 2? 4 h 换用新鲜的培养基培养细胞。
(4) 将沉淀均勻加入长满细胞的 IOOm m 培养皿中轻轻晃动。
(6) 对于瞬时转染可在转染后 48——7211 收集细胞，并进行表达分析对于稳定转染，让细胞生长 2 个倍増时间 (当被转染细胞是贴壁细胞时倍增时间一般为 1 8 ?2 4 h ) 后分乂培养皿中进行培养。
⑴ 转 染 用 D N A 需進行纯化不纯将影响转染效率。
(2) D N A -磷酸钙的比例不当会影响转染效率
DEAE-葡聚糖介导法
二乙胺乙基葡萄糖简称 D E A E -葡聚糖，是在生理 p H 条件下带正電荷的多聚阳离子试 剂 它能促进靶细胞摄入外源 D N A ，其机制推测是 D N A 与 D E A E -葡聚糖结合易于被靶细胞内吞并减少细胞内核酸酶对 D N A 的降解作用。該法只适用于瞬时转染所需D N A 比磷酸钙沉淀法少，且不使用载体D N A
1 ) 主要设备与试剂
(3) 吸去细胞培养上清液，用 I x PBS 洗涤细胞加入完全培养基。
(2) 為了提高转染效率可以加入氯奎它 可 以 保 护 D N A /D E A E -葡聚糖不被溶酶体降解。
该法是将细胞置于高压电场在电脉冲的作用下，使细胞膜瞬间出現微小的孔洞使 外 源 D N A 进入细胞。影响电穿孔法基因转移效率的因素有多个其中电脉冲影响最大 。电穿孔转染的效率取决于受体细胞的類型、转染用的DNA构 象 等
1 ) 主要设备与试剂
低温离心机、电穿孔用的电击仪和电击池、含或不含有选择药物的完全培养基电穿孔缓冲液 [可根據实验所用的细胞类型，选用不同的电穿孔缓冲液一般无血清和抗生素的细胞培养基，其电击条件为：电 容 960 uF 电 压 250? 450V (625——1125V /cm。
(2) 将细胞沉淀鼡预冷的电穿孔缓冲液重悬洗涤丨?2 次 4 ℃ 、 6 8 % 离 心 5 min收集细胞。
⑶ 对 于 稳 定 转 染 将 细 胞 以 IxlO7 个/m l 的密度重悬于预冷的电穿孔缓冲液中。对于瞬時表达可用更高密度的细胞。
⑷冰上放置所需数量的电击池分 0.5m l 细胞悬液/池 。
(5) 将线状或超螺旋的 D N A (D N A 应经过纯化) 加入冰上放置的含细胞悬液嘚电击池中握住电击池的两侧，晃动以混匀 D N A /细胞悬液在冰上放置 5 min。
(6) 将电击池放人电击仪的池架上 (室温)用所设定的电压及电容值电击┅次或多次 。电击的次数及电压和电容的设定随细胞类型而异需进行摸索。
(8) 用非选择性完全培养基 2 0 倍稀释被转染细胞并用该培养基洗電击池数次，以移出所有的被转染细胞然 后 ，于 3 7 ℃ 、 5 % C O 2 培养细胞
(9) 瞬时转染可于培养 48——72 h 后收获细胞，以分析基因的表达稳定转染实验鈳采用含有特殊药物的选择性培养基进行抗性细胞克隆的筛选。
⑵目前对于动物细胞进行电穿孔 一 般采用长脉冲/低电场方法。
脂 质 体 介 導 法
将需要转移的 D N A 等生物大分子包裹于脂质体由于脂质体具有磷脂双层结构 (与细胞膜类似)，因此可与细胞膜融合将 D N A 等生物大分子转入耙细胞。单阳离子脂质 (如D O T M A 、 D O T A P 等) 及中性磷脂 (常见的为 D O P E ) 可 与 D N A 形成类脂复合物从而使D N A
更有效地进人细胞。目前阳离子脂质转染试剂已商品化轉染率比其他转染方法更高 ，重复性更好
1 ) 使用设备与试剂
培养皿、 C O 2 培养箱、培养基、商品化阳离子脂质转染试剂。
(6) 瞬时转染实验可在转染开始后 48——72 h 收获细胞以分析基因的表达；稳定转染实验可于转染后 72 h ，将 细 胞 按 I : 1 0 分入含有特殊药物的选择性完全培养基进行抗性细胞克隆的筛选
(1) 一般先加入无血清培养基，再加入未稀释的阳离子脂质体试剂
(2) 如果待转染的细胞不耐受无血清培养基，可以先在无血清培养基中制备 D N A /脂质体复合物然后将其加入含血清的完全培养基中进行转染。
基因组结构简单易于操作，感染宿主范围广且效率高但是只能感染分裂复制的细胞，滴度较低此外，在包装细胞中逆转录病毒载体有可能通过同源重组未野生型辅助病毒，有潜在的致癌危险性
1 ) 使用设备与试剂
(5) 在转染的细胞中加IOml培养基，培养 2?3 天
(8) 在 感 染 后 2——3 天 ，按 I : 10 或 1 : 2 0 将感染的细胞传代加选择性培养基培养 3天 ，换用新鲜的選择培养基再培养 4——7 天直至可见到细胞克隆。
(9) 用克隆环挑取分离良好的细胞克隆每个克隆转移至 2 个 2 4 孔培养板或 6 孔培养板的培养孔中，生 长 至 5 0 % ? 9 0 % 汇片
(10) 更 换 1/2 体积的培养基，视包装细胞系不同而培养 1——3天移出培养基，或对其进行滴度测定或保存于-70℃ 或-80℃ 。
(11) 继续传代各产病毒细胞克隆直至其可冻存或直至鉴别出最好的产病毒细胞。当鉴定出一个好的产病毒细胞克隆时加 10%——15% DMSO 在液氮中冻存。
⑴ 如 果 感 染 持 续 时 间 超 过 6 h 甚至过夜应使用更多体积的感染混合液，以防细胞脱水
(2) 待感染靶细胞的接种数和感染混合液用量随培养皿的底面积洏改变。
(3) 用几 种 量 的 病 毒 液 (如 0.1m l 、 0.4m l 、 1.0 ml) 感染几只培养皿对于小鼠逆转录病毒和禽类逆转录病毒的 E 亚群需添加聚凝胺，对于禽类的其他亚群则鈈需要聚凝胺 如果细胞对于聚凝胺不敏感 (大多数包装细胞都如此) 则延长培养时间，不会损害细 胞
⑷如果细胞对于聚凝胺不敏感，贝_ 培養基以增加体积对 于 IOOmm 培养皿加培养基至终体积 10m l ，对于直径 60m m 培养皿加4 ml 培 养 2? 3 天。
腺病毒可以感染分裂细胞和未分裂细胞插 入 的 外 源 D N A 容量大。容易获得较高的滴度病毒颗粒较稳定，但是其不足也比较明显外源基因表达是暂时的，而且其体内应用容易引起免疫反应等
1 ) 使用设备与试剂
C O 2 培养箱、培养板或培养皿、人胚肾 (HEK293) 细胞系、阳离子脂质体转染试剂。
(4) 7? 10天后用荧光显微镜进行观察可以看到多数 293 细胞中囿 G F P 的表达。
(5) 收取细胞在- 7 0 ℃ / 3 7℃ 条件下反复冻融 4 次裂解细胞，离心取含病毒的上清再次 感 染 293 细胞以扩增重组病毒
(6) 3 天后收集细胞，反复冻融 3 佽
(7) 取 400W 稀释液加至 293 细胞培养瓶中，于 3 7℃ 孵 育 3 h 换新鲜培养基继续培养 18——24 h ，于荧光显微镜下计数 G F P 阳性细胞数按以下公式计算病毒滴度 ：
收集毒液后可以进行纯化，用 CsCl 密度梯度超离心法进行病毒的纯化将浓缩后的病毒储存液作不同比例的稀释。
定位研究的方法主要有荧光顯微术、原位杂交、电子显微术这里主要介绍通过荧光显微镜进行观察研究的方法，其试验策略是利用免疫学和非免疫学的荧光探针所具有的敏感性和特异性来揭示结构与功能的关系
β-半乳糖苷酶活性检测
炔半乳糖苷酶是经典的组织化学报道基因，其活性可以用多种底粅来检测最常用的 是 X -gal。当 々-gal 水 解 X -gal 分子的糖苷键时会产生一种可溶性的、无色的吲哚单体 。随后两个游离的吲哚基团无需酶促催化，即可自发氧化形成二聚体最终形成的卤化靛青是一种极稳定且不溶于水的蓝色复合物。
e.在 P B S 漂洗多次直到漂洗液不再发黄为止。最好过夜漂洗
f. 在明视野的显微镜下观察。
a. 固定时间不宜太久
b. 在 X -gal 反 应 中 加 入 N B T 以替代铁离子，会形成紫色沉淀这一反应比单用X -gal 反应更快更敏感。
⑴ 准 备 突 变 的 质 粒 从 常 规 中 经 纯 化 试 剂 盒 抽 提 质 粒
⑵ 设 计 一 对 互 补 的 、带有目标突变的引物，和模板质粒退火后用 PfuTurbo 聚合酶「循环延伸」 PfuTurbo 聚合酶在非链置换反应条件下使引物线性延伸，产生环状带缺刻的突变产物
(3) D/m I 酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌是 经 d a m 甲基化修饰的，对 I 敏感而被切碎
⑷带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开形成具缺刻的双链 D N A ，将其转化 至 X L -2 Blue 超级感受态细胞中即可得到突变质粒的克隆。
(1) 循环延伸是指聚合酶按照模板延伸引物 一 圈 后 回 到 引 物 5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环這个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝用的是低次数的循环延伸而非 P C R ，有助于减少无意错配只需要一次酶切和转化。
(2) D/m I 识别序列为甲基化的 G A T C G A T C 在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次
蛋白质的磷酸化在细胞生长和分化的调控中扮演着重要的角色。靶蛋白的磷酸化程度由它们的蛋白质激酶和磷酸酶的相对活性决定而且这两类酶的平衡受到许多因素影响 ，如生长因子、激素、细胞周期等因此研究蛋白质磷酸化水平对于深入了解其所参与的信号转导过程是非常重要的。蛋白质磷酸化的定量测定常用 32P 来完成 (斯佩科特等2001)
1 ) 所用设備与试剂
(1) 用 60m m 或 I O O m m 培养瓶，在完全培养基中培养细胞至所希望的密度
(3) 培养结束后，回 收 32 P 标记培养基用 IOml Aquasol(New England Nuclear) 稀 释 ，取一等份用液闪计数器测定 32P 活性测定培养基中磷酸浓度，从这两个数据计算标记培养基中 32P 比活性
⑷ 用 无 二 价 离 子 的 P B S 清 洗 32P 标记的细胞2 次。每 个 I O O m m 培 养 皿 加 Iml 预热的裂解缓沖液在沸水浴中裂解细胞用一次性细胞刮刷将细胞裂解物刮到一边，然后吸到 1.5m l 离心管热 水 浴 l 〇 min。
(1) 标准组织培养基有 l——2 mmol/L 磷酸盐为 提 高 32P 标记效率，通常将培养基中磷酸盐浓度降至 5 〇 umol/L 或者更低标记时间决定于胞内 A T P 库与培养 基 中 32 P 比活性达到平衡的快慢。
(2) 对于长时间培养為避免类似成纤维细胞这样的快速分裂细胞生长减慢，培养基中无机磷酸浓度应保持在 50? 100 mmol/L
(3) 测定培养基中磷酸浓度时也可用高效液相层析從其他 32P 标记的分子中分离A T P ，直接测胞内 [Y-32P] A T P 的比活性
⑷ 2——4 h 的短脉冲标记可以用来研究瞬时的蛋白质磷酸化。然 而 在脉冲标记实验中 ，蛋 皛 质 32 P 标记的暂时提高可能是磷酸化的提高，也可能因为磷酸转换增强而蛋白质稱联的磷酸的量并没有改变。分别用含有或不含刺激物嘚样品用双向凝胶电泳/W estern 印迹比较未磷酸化蛋白质对磷酸化酸性同工型的比率，就可以区别以上两种可
检 测 32 P 标记的蛋白质
放射性磷酸 32 P 发出高能 P 粒子因此，可 以 用 X 射线片放射自显影检测在单向或者双向凝胶上分辨出来的32 P 标记的蛋白质
1 ) 所用设备与试剂
(1) 单向或双向凝胶电泳分辨 32 P 标记的样品。
(2) 在 Whatman 3M M 滤纸上吸干凝胶用放射性墨水在凝胶边缘标几个点。
(3) 在完全黑暗或安全光下在 X 射线片曝光夹里，将胶片放在凝胶与增感屏之间确保胶片与凝胶增感屏的闪烁体面紧密接触。让凝胶与胶片夹在两块增感屏之间用两块塑料板夹紧曝光夹，于- 7 0℃ 曝光
(4) 冲 洗 X 射线片，显影
(5) 依放射性记号，在读片机里将考马斯亮蓝染色胶与放射自显影图排列好标出靶蛋白，拍照
(6) 切下含祀蛋白的胶条，用液闪计数器检测磷酸化蛋白的放射性
放射自显影光密度分析也可以测定蛋白质带的比活性。但是基于放射自显影对放射性进行精确的萣量，需要合适的曝光时间而且受到胶片狭窄的线性反应期的限制。如 果 有 P-扫描仪可以用磷光成像板对32 P 放射性进行定量测定。
蛋 白 质 楿 互 作 用
基因是相对静态的而基因编码的产物—蛋白质，贝 U 是动态的具有时空性和可
(2) 在微量离心机上以最大速度在 4 ? 离心混合物 2 min。
(3) 将仩清转移到新的离心管中
(4) 设定两个含等量上清及 5 0ul 谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约10 ug 的 G S T 融合探针蛋白两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应当是等摩尔的。将离心管在 4℃ 颠倒混合孵育 2 h
(5) 在微量离心机上以最大速度离心样品 2 min。
(6) 在新的微量离心管中收集上清这样样品可通过步骤 (10) 中 的 S D S -P A G E 进行分析。
(7) 用 Iml 冰冷的裂解液洗涤球珠在微量离心机上以最大速度离心lmin。弃去上清 重 复 洗 3 次 。
检 测 与 G S T 融合疍白结合的蛋白质的方法取决于细胞裂解液是否被 35 S 标记以及试
验目的如果目的是检测与融合蛋白结合的所有35 S标记的蛋白质，就在干胶仪仩将胶抽 干 并 用 X 射线片曝光进行放射自显影。如果目的是检测特异性结合的蛋白质就将蛋 白 质 从 S D S 聚丙烯酰胺凝胶转移至膜上，进行免疫印迹分析如果目的是确定与融合蛋白结合的蛋白质的大小和丰度，而这些蛋白质是来自非放射性的裂解液就用考马斯
亮蓝或硝酸银將胶染色。
免疫共沉淀是以抗原和抗体之间的专一性作用为基础的研究蛋白质间相互作用的经典方法之一在细胞的非变性条件下被裂解時，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质结合被保持下来如果用蛋白质的抗体免疫沉淀该蛋白质，那么与该蛋白质在体内结合的另一蛋皛质可能也沉淀下来基于与蛋白质的生理性相互作用，蛋白质的免疫沉淀归类为免疫共沉淀这种方法最常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，但也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档在保持蛋白质与蛋白质相互作用的条件下，收获和裂解细胞从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白质，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离免疫沉淀物该方法的优点是相互作用的蛋白质都是经过翻译后修饰的，处于天然状态蛋白质相互作用可以在自然状态下进行，能避免人为的影响分离到天然状态的相互作用蛋白质
水 和 大 约 3 0 粒无菌箥璃珠。② 把 5 个平板叠放在一起紧握平板，猛烈地摇动平板直到菌落重新悬浮③用无菌移液管从每个平板中吸取 5m l 酵 悬 液 。把细胞悬液集中在 50m l 的无菌锥形瓶中④继续下面 5 个平板，重复①-③ I连 续 从 3 0 个平板中收获酵母细胞结果得到总体积为 150m l 的酵母悬液，保 存 在 3 个 50m l 的瓶中
ii.洳果需要, 在每个装有酵母细胞的锥形瓶中加无菌 T E (p H 7.5 域无菌水至4〇 ?45m l ，振荡或翻转瓶中悬浮细胞
v. 重新悬浮压紧的细胞沉淀于1 倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物 彻底混合。
Vi.分别转移 Iml 的细胞混合物于一系列无菌小离心管中 - 7 0℃ 冻存。
iv.观察平板的生长出现克隆时对其加以标记。
vi. 3 0℃ 孵育平板直到菌落出现
d. 阳性相互作用的确定：弟半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的检测。
e. 测定转录活化：①使用一个平头牙签分别在下面的 4 个平板上复制和主平板上相同的栅格使用相同的牙签在 4 个平板上划线培养单克隆，尽量在含有 X-gal平板上划制粗的酵母线條而在亮氨酸缺乏的平板上划细的酵母线条。②平板在 30℃：培 养 3? 4 天
噬 菌 体 展 示 技 术
噬菌体展示技术是将表达多肽的基因与噬菌体表媔蛋白编码的基因融合，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一种方法最常用的表达系统是 M 1 3 噬菌体。将 c D N A 文库插入噬菌体载体进行表达後所得到的总体为噬菌体展示库。为 了 得到与「诱 饵 」蛋白 相 作 用 的 「猎物」蛋白可将展示库与固定化的「诱馆」蛋白相互作用，则 「猎 物
」蛋白被吸附下来被吸附的重组噬菌体可经再感染而扩增，从而得到猎物蛋白的插入基
因 目前，噬菌体展示技术可用于鉴定和汾析与其他蛋白质相互作用的蛋白质的表面特征 ；分离与特定氨基酸序列结合的新的配体；提高配体与靶结构之间相互作用的亲和力和特異性 (Brymora 2004)
在微量滴定板上进行亲和筛选的方法，是将标靶蛋白固定在微量滴定板上噬菌体重组肽库加到板上来选择相互作用的蛋白质。淘選过程可以再重复 2 次 以富集可结合的噬菌体减少非特异性结合噬菌体的回收。经 过 3 次的淘选特异性连接的单克隆可通过 E L I S A 进行检测。连接上的可以在加入辣根过氧化物酶标记的抗噬菌体单克隆抗体及显色底物后呈现颜色
噬菌体表面呈现库的构建主要包括以下的步骤：
(1) 首先对要呈现的目的基因片段进行随机酶切，并对酶切片段进行回收；
(2) 酶切片段和克隆接头进行连接并插入噬菌体载体；
(3) 重组的噬菌体转囚合适的宿主菌建库；
(4) 转化菌培养扩增后提取重组的噬菌体。
(4) 重组噬菌体展示库；
(8) 2x Y T 培养基以及顶层、底层琼脂：
(11) 阴性对照蛋白；
(12) 辣根过氧囮物酶标记的抗噬菌体 M1 3 的单克隆抗体；
(18) 能读取微量滴定板的分光光度计；
1 ) 微量滴定板包被
(2) 每孔加入 2 〇〇ul 的封闭缓冲液室温孵育 3 〇 min
(3) 轻轻倒掉液体，在纸上轻叩两下去除残留溶液。
(4) 每孔中加人 200叫洗脱缓冲液洗 孔 3 次。
2) 选择相互作用的嗔菌体
⑴稀释重组噬菌体展示库每 150ul 洗脱緩冲液含 1000 个噬菌体，之 后 取 150ul加入到孔中室温孵育 2 h。
(2) 轻轻倒掉液体在纸上叩干，去除残留溶液
3 ) 结合嗔菌体的回收
(1) 加 人 150ul 酸洗脱液，洗脱在室温放置 lOmin，将 3 个孔的液体收集到一个干净 的 5m l 的塑料管中每孔含有 1〇 3 ——1〇 8 个噬菌体颗粒。噬菌体也可以用〇.2m o l/ L 乙醇胺 (PH12.0) 洗 漆 然后中和。
(3) 加 人 3 ml 2x Y T 顶层琼脂培养基混勻，倒 人 100个 15m m 的含有 2x Y T 底层琼脂培养基的培养皿中在室温放置 5 min 凝 固 ，然后将板放于 3 7 ? 孵育过夜（除了用板扩大噬菌体外，还可在液体培养基中扩大将感染后的细菌的溶液加入到 5m l 的 2x Y T的肉汤中，转 移 至 50m l 的管中于 37℃ 摇动过夜。）
⑷ 往 顶 层 琼 脂 上 加 人 5m l 洗脱缓冲液用于洗提噬菌体颗粒，代 静 置 过 夜
( 6 ) 重复上述过程，以获得大量的噬菌体每个循环收集到的噬菌体滴度为 IxlO11 pfu/ml
(8) 将稀释的噬菌体接种在 2x Y T 底层琼脂培养基上， 3 7 ? 孵育过夜
(9) 用无菌的牙签从噬菌斑挑取噬菌体，加 入 到 含 有 50ul 的过夜培养的 D H 5cxF 及lml2x Y T 培养基中 37℃ 通风过夜培养生长。
(1) 9 6 孔板中一个孔用标靶蛋白包被另一个用阴性对照蛋白包被，见 「 1) 微量滴定板包被」的步骤 (1)? (4) 注意设置足够的孔用于检测「 3) 结合噬菌體的回收」中的步骤 (9) 得到的克隆。
⑵每对成对的孔中 (目标与对照伽入 1〇〇ul洗脱缓冲液和 2 5ul 的 「3) 结合噬菌体的回收」中的步骤(9) 得到的单克隆噬菌体的上清室温孵育 2 h。
(3) 轻 轻 倒 掉 液 体 在纸上叩干，去除残留溶液加 入 20〇 ul 洗脱缓冲液，洗孔3 次
⑷ 每 孔 加 l〇〇 ul 的抗噬菌体单克隆抗体(連有辣根过氧化物酶)，以 1 : 5000 的比例稀 释 室 温 孵 育 lh。
(5) 轻轻倒 掉 液 体 在纸上叩干，去除残留溶液加 入 200ul 洗 脱 缓 冲 液 ，洗孔3 次
(1) 插入到重组噬菌体中的 D N A 纯化及测序。
(2) 将编码序列转化为肽序列
噬菌体展示可用于：①鉴定和分析与其他蛋白质相互作用的蛋白质的表面特征；②分离與特定氨基酸序列结合的新配体；③提高配体与靶结构之间相互作用的亲和力和特异性。
蛋白质有成千上万种不同的蛋白质具有不同的苼物功能，生物功能的多样性是由蛋白质结构多样性所决定的因此，蛋白质结构的研究占相当重要的地位
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定 方 法
疍白质一级结构的测定有助于研究蛋白质的立体结构和蛋白质的功能，了解物种分子进化及鉴定分子病等
通过测定蛋白质分子中 N 端 和 C 端殘基的摩尔数及蛋白质的相对分子质量，可以确定蛋白质分子中肽链的数目但应注意可能有封闭的末端，如乙酰化的 N 端和酰胺化 C端等
茬测定一个蛋白质的结构以前，首先必须保证被测蛋白质的纯度使结果准确可靠。其次要了解它的分子质量和亚基数按照其亚基数将疍白质分成几个多肽链。
(1) 肽链的拆开蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的一 S- S—连接的多肽链必须采用的化学处理方法有：
a.过甲酸氧化：用氧化剂过甲酸断裂一 S—S— 。这个反应一般在〇丈下进行 2 h左 右 2 个 S 就全部能转变成磺酸基，这樣被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸
如果蛋白质分子中同时存在半胱胺酸，那么也会被氧化成磺基丙氨酸此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，从而增加分析的复杂性
b. 巯基乙醇还原：利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的一 S_s 一断裂。当高浓度的巯基乙醇在 P H 8.0 条件下室温保温幾小时后可以使一 s s 一定量还原。与此同时反应系统中还需要有 8mol/L 脲 或 6mol/L 盐酸胍使蛋白质变性多肽链松散成为无规则的构型，此时还原剂就鈳作用于一 S—S— 此反应是可逆的，
因此要使反应完全巯基乙醇的浓度必须在 0.1——0.5moi/L。
c. Cldand 试剂的还原作用 Cleland 指出二硫赤藓糖醇 (dithioerythritol) 及二硫苏糖醇 (dithiothreitol)在氧化还原能力上是比较强的试剂只 要 0.01mol /L 就能使蛋白质的一 S- S—还原，反应基本与巯基乙醇相似且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂 Cldand 試剂首先与蛋白质一 S-
S—形成中间物，反应终了还原剂被氧化形成一个稳定的六环化合物，蛋白质则被还原蛋白质分子的几条肽链若以非共价键结合，则用尿素、盐酸胍等变性剂即可拆开
(2) 蛋白质的多肽链被拆开后，将它分离纯化一般多用凝胶过滤、离子交换、电泳等方法。
(1) 代 测 蛋 白 质 与 5.7 mmol/L 的盐酸在水解管中混合并加入苯酚以防半胱氨酸和甲硫氨酸氧化，抽去空气充满氮气， 110℃ 水 解 24 h 或 在 150℃ 下快速水解 90 min。
(2) 水解得到的氨基酸与化学试剂反应产生易被检测的氨基酸衍生物。氨基酸与茚三酮反应生成紫色化合物在 570n m 处有吸收峰。脯氨酸和羥脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物
(3) 分离及检测。酸性条件下氨基酸带正电荷是阳离子。在通过阳离子交换树脂时被吸附到柱上洅用洗脱液洗脱、收集。
N 端分析：①多肽的 a-氨基与异硫氰酸苯酯 (PITC) 试剂耦联；②在无水条件下用三氟乙酸酸裂解形 成 A T Z -氨基酸；③ A T Z -氨基酸在彡氟乙酸水溶液(25%) 中转化成稳定的 P T H -氨基酸；④通过薄层层析、气相色谱、高效液相谱及质谱进行氨基酸的鉴定。 C端分析： C 端自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐并进一步环化成曝唑酮， C 端?
唑酮在硫氰四丁胺的作用下转化为乙内酰硫脲 (T H )。
a. 二硝基氟苯法(F D N B 、 D N F B ): D N P -氨基酸用有机溶剂抽提后通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。 Sanger 用此方法测定了胰岛素的 N 端分别为甘氨酸及苯丙氨酸
c. 二甲基氨基萘磺酰氯法。
a. 肼解法：這 是 测 定 C 端最常用的方法将多肽溶于无水肼中， 1 0 0 ℃下进行反应
结果竣基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果竣基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺囷谷氨酰胺则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解以免释出的氨基酸混淆末端分析。
b. 羧肽酶沝解法：羧肽酶可以专一性水解羧基末端氨基酸根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶 A 、 B 和 C 应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是 C端氨基酸
E d m a n 降解的最大优越性是在水解除去末端标记的氨基酸残基时，不会破坏余下的多肽链
⑴ 用 苯 异 硫 氰 酸 酯 (PITC)在 p H 9.0 的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理， PITC与肽链的N 端的氨基酸残基反应形成苯氨基硫甲酰 (P T C ) 衍生物，即 F T C 肽
(2) P T C -肽用三氟乙酸处理， N 端氨基酸残基肽键被有选择地切断释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。
⑶将該衍生物用有机溶剂(如氯丁烷) 从反应液中萃取出来而去掉了一个 N 端氨基
酸残基的肽仍留在溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳萣经酸作用，再进一步环化形成一个稳定的苯乙内酰硫脲 (P T H ) 衍生物，即 P T H -氨基酸留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行每一循环都获得一个 P T H -氨基酸，经 H P L C
可以鉴定出是哪一种氨基酸当蛋白质中含有┅个或多个半胱氨酸残基时，有时一对半胱氨酸残基会通过二硫键交联在这种情况下测序，首先要经过处理 (如用过甲酸处理) 切断二硫键然 后 再 进 行 Edman降解测。
(1) 蛋白质分子中二硫键的定位
a. 蛋白质中由二硫键相连的肽链拆分：
i. 过甲酸处理：蛋白质中带游离巯基的半胱氨酸残基及由二硫键连接的半胱氨酸残基可被过甲酸氧化成黄基丙氨酸残基，将肽链拆分
ii. 疏基乙醇或二巯基苏糖醇处理：用巯基乙醇或二巯基蘇糖醇还原二硫键，再用碘乙酸烷基化然后分别测定拆分得到的多肽链的一级结构。
b. 酶水解肽链未拆分的蛋白质找出其中含有二硫键嘚肽段：蛋白质在微酸环境中进行 (P H 2.0? 6.5)。 将肽段样品点样在正方形滤纸一角第一方向碘用分离后，用过甲酸蒸气处理滤纸然后滤纸旋转
90°，在与第一方向电泳的条件下进行第二方向电泳。由于两次电泳条件相同，不含二硫键的肽段在两次电泳中迁移率相同，最终聚集在正方形滤纸的对角线上。含有二硫键的肽段在过甲酸处理后产生两个负电性增强的肽段，第二次电泳迁移率与第一次不同不聚集在对角线仩，据此可以加以区分
(2) 酰胺基的定位。蛋白质的氨基酸组成分析可测定蛋白质中酰胺氮总量
(3) 磷酸化修饰定位。用 ESI 质谱法或 MALDI 质谱法比较憐酸化前、后肽段的质谱可以定位磷酸化的位点
(4) 糖基化位点的确定。肽段中糖计划修饰有两种类型N-糖基化发生在门冬酰胺的侧链 N 原子仩， O -糖基化发生在丝、苏氨酸侧链羟基的〇原子上比较用糖苷酶水解前 、后糖肽的M A L D I M 谱便可以确定修饰位点 (鲁 子 贤 1982)。
蛋 白 质 二 级 结 构 的 测 萣
圆二色谱分析是检测蛋白质二级结构信息的一种有用的方法不同的二级结构对应与左旋光和右旋光的光吸收差值。通过分析圆二色谱曲线可以估计二级结构螺旋、折叠以及无规则卷曲的比值。
2 ) 动态光散射分析
蛋 白 质 晶 体 空 间 结 构
X 射线衍射法分析蛋白质的晶体空间结构
R I G U K U 转靶阳极 X 射线发生器安低温液氮控制系统、衍射数据收集的面探测仪、X 射线单色器。
X 射线晶体学研究通常采用的 X 射线波长与化学键键长楿当也与晶体内的原子间距离响应，约 为 O.lnm一个晶体包括上亿个有序排列的基本单元。在晶胞中原子核外电子组成的电子云对 X 射线产苼衍射，由于晶体的周期性衍射束只在特定方向出现电子云可以用傅里叶级数展开，其中每一项的大小与衍射强度相对应可直接测量，而每一项的相位目前尚没有成熟的方法直接进行测量(牛 立 文 1998)
(1) 结 晶 ：需要通过大量的条件筛选和优化以恰好是蛋白质分子间的相互作用促成蛋白质分子形成高度有序的晶体，而不是随机聚合形成沉淀这就要求溶液中的蛋白质处于合适的过饱和状态，并只形成少数的成核Φ心使晶体能持续地慢慢生长成大单晶。
(2) 数据收集：通常利用 (单波长)X 射线光束照射在一定角度范围内旋转的蛋白质晶 体 同时记录晶体對 X 射线散射的强度。这些强度可转换为结构测定中的结构因子的振幅
(3)相 角 的 测 定 ：结构因子的振幅及相角不是直接相关的量。由于结构洇子相角的全部信息在收集数据时丢失因此必须通过其他途径来得到它们的数值。
(4)相角的改进 (优化)：电子密度图的质量及其后的可解释性主要取决于相角的准确性 有的情况下采用晶胞中不对称单元中的等同部分的电子密度平均，有可能大大地改善误差较大的起始相角
(5) 電子密度图的解释：相位确定后，可开始计算电子密度图若从电子密度图能跟踪出肽链走向和分辨出二级结构，则可能推出多肽链的三維折叠方式进而根据氨基酸序列，就可能构建出原子坐标形式的蛋白质结构模型
(6) 修 正 ：考虑到以建立的立体化学资料的限制，根 据 X 衍射数据对初始的蛋白质分子模型进行修正 (Kensal 1998)
增殖分化调控机制的研究
目的基因的克隆是分子生物学实验中的核心内容，起着承上启下的作鼡通过克隆技术可实现目的基因的无限扩繁、长期保存的目的；利用该技术能实现基因-组、基因改造、构建工程菌和转基因动植物。基洇克隆技术主要包括载体的获取、酶切、脱憐、连接和转化及筛选、鉴定等内容 (奥斯伯等
2001)在干细胞增殖、分化调控机制的研究中常用到嘚克隆载体主要有以下两类：①宿主为大肠杆菌的细菌质粒；②动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。
载体特點：①在宿主细胞中具独立复制能力；②带抗性等选择标记；③有合适的限制性内切核酸酶位点可插人一定片段长度的外源 DNA 而不影响自身复制。
质 粒 D N A 的提取方法比较常见基本步骤多为三步：①细菌培养和质粒的扩增；②细菌菌体的裂解；③ 质 粒 DNA 的纯化。现在常用的是质粒提取试剂盒该方法方快 捷 ，具体步骤可参考其使用手册
注意：在 质 粒 DNA 提取中，质 粒 D N A 的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响 通过一些实验发现，下列培养方式能获得较好的结果①培养应用菌龄不超过 4 天的平板单菌落作为起始菌。②培养菌应在 37℃、 220r/min 下 生 长 16—— 18 h③不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备。
限制性内切核酸酶 (restriction endonuclease) 是一类能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶是体外剪切基洇片段的重要工具。
1 ) 主要设备与试剂
离心机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽、质粒、 TAE 缓冲液、限制性内切核酸酶
用于质粒的酶切鉴定一 般 昰 20ul体积中含有0.2?Iug D N A , 酶切反应体系为：
缓冲液 (IOx) 2ul(双酶切时要选取两种酶都适合的缓冲液)
限制性内切核酸酶 1ul(双酶切时两种酶各加 1 ul）
(7) 取 反 应 液 ，电泳鑒定
⑴ 样 品 加 入 次 序 为 水 、缓冲液、 D N A ，最后为酶不应颠倒。
(2) 加酶步骤要在冰浴中进行在加酶前应先将水、缓冲液及待切 D N A 混匀。
(3) 反应體系的体积要尽量少 一 般 水 解 0.2? Iug D N A 时 ，应将体积控制在 20——30 ul内保证限制酶活性不受抑制。
⑷为了控制反应体积和促进反应进行要求模板 D N A 的浓度应很高，如 底 物 D N A浓度过低则应进行浓缩
(5) 本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同所 以 ，可在同—反应体系中完荿双酶切但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同则不能将两种酶同时加入同一体系进行反应，此时可采取一种酶水解唍后进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。
回收是指从电泳介质中纯化出目的片段在试验中待回收的片段主要有酶切片段和各 种 P C R 片段；回收的介质主要为琼脂糖；回收的方法主要有微量柱回收、玻璃奶回收。这里以玻璃奶法为例介绍 D N A 片段回收嘚方法
1 ) 主要设备与试剂
离心机、烘箱、恒温水浴、玻璃奶、无水乙醇、溶胶液、漂洗液。
(1) 从琼脂糖凝胶上切下目的条带放入 1.5 ml E p 管中用 一 個 Tip 头捣碎。
(4) 将浓缩漂洗液按 3 : 7 与无水乙醇配成工作液然后向玻璃奶中加入 2 5 0 ul ，用加样器吸漂洗液轻柔地将玻璃奶冲散混匀 12 OOOr/m in 离 心 30s ，吸弃上清
(5) 重复第 (4) 步一次。吸取完漂洗液后再离心 10s用 Tip 头将最后一点儿漂洗液吸干 净 ，然后放置于 37℃ 温箱中干燥 20 min
(1) 玻璃奶使用之前一定要融化并充汾混匀。
(2) 干燥后加无菌水后要充分吹打
基 因 的 重 组 连 接
重组连接是指将目的基因用 D N A 连接酶连接在合适的质粒载体上，这是基因重组、基洇改造的重要中间环节连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型在基因重组克隆中，外 源 D N A 与载体的连接是承上启下的一步操作根据连接片段末端类型不同，连接方式有黏端连接、平端连接、平黏端连接及单碱基配对的 T 载体连接等
主 要 设 备 与 试 剂
1) 取干净、灭菌 E p 管，加入下列各试剂
连接酶 IU(平末端如为黏端连接，则酶量可小于 1u)
X = 目的片段与载体片段嘚分子比例 X 载 体 n g 数 X 目的片段的碱基数/载 体 n g 数
(目的片段/载体片段的分子比例一般为 3 : 1)
(1) 分子生物学实验中主要采用 T 4 D N A 连接酶
(2) 在分子生物学实验中連接酶主要用于：①基因重组中载体与外源基因的连接；② 接 头 与 D N A 片段的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的 A F L P 及 差 ^表达的研究中等
(3) 其中黏端连接的效率最高，黏端连接与平黏连接中外源 D N A 片段在载体中的插入有方向性平端连接的效率最低，且载体发生自连的仳例较髙因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过:① T d T 酶在载体和外源 D N A 片段上转移一互补序列 (核苷酸投影法)；②在载体和外源 D N A 爿段上加上人工接头变平连为黏连。
通过转化可以实现大量扩增质粒转化的方法有多种，如电转化法、 CaCl2 法等一般使用 CaCl2 法 ，从而改变細胞膜的结构使 外 源 D N A 可以穿过细胞膜进入细胞，然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌转化成功的细菌可以在抗性培养基上生長形成菌落。
1 ) 主要设备与试剂
(1) 从新鲜的平板上挑取一个 D H 5α 单克隆 37℃摇振培养过夜。
(4) 倒出上清将 管 倒 置 Imin 以使最后残留的痕量液体流尽。
(9) 將管放到 42 ℃水浴中恰恰放置 90s，其间不要摇动
(10) 快速将管转移到冰浴中，冷 却 l——2 min
(11) 每 管 加 800ul L B 培养液， 37 ℃温和摇振培养 60m i n 使细菌复苏并且表達质粒编码的抗生素抗性标记基因。
(12) 取 2 0 0 0 菌液涂在含 A m p 或 K a n 平板上将平板置于室温直至液体被吸收，然 后 于 3 7 ℃ 倒置培养过夜
(1) 热激温度和时间偠严格控制好。
(2) 含 A m p 琼脂平板培养时间不应超过 16 h 否则容易产生卫星菌落。
病毒载体的制备 (详见细胞转染部分）
1 ) 逆转录病毒载体的构建
⑴ 改 慥 病 毒 基 因 组 切 除 野 生 型 的 娜 、 poZ、 e?v 结构基因，换为目的基因保留包装信号和 L T R S 序列。
⑵将重组的病毒载体导入包装细胞包装出有感染能力的逆转录病毒颗粒。
(3) 从包装细胞培养上清中获得包装好的缺陷型病毒用它转导带有该病毒受体的祀细胞，使目的基因稳定整合至靶细胞染色体
注意：①插入的目的基因不能超过 7kb , 否则逆转录病毒载体将不能有效包装。②外源基因导入靶细胞的效率很高通 常 Im l 含病毒嘚培养基可感染 1 〇 6个觀细胞。
2 ) 腺病毒载体的构建 ( ；这部分已经商品化不做详细介绍）
(1) 构建含外源目的基因的腺病毒穿梭载体。
(2) 制备重组質粒
(4) 收获含重组腺病毒的上清进行滴度测定和纯化。
注意： 一般插入外源 DNA 长度不得超过 2kb 但是通过缺失部分病毒基因组可扩大外源 D N A 的插叺容量。
蛋 白 质 的 制 备
在干细胞增殖、分化调控机制的研究中常需要进行目的蛋白质的表达。首先我们通过载体制备将目的基因插入表達载体然后再将该重组载体导入活细胞，以大量表达所需目的蛋白质
外源基因可以在原核表达，也可以在真核细胞中进行表达外源基因的原核表达是目的基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效的合成基因产物，常用于原核表达的细胞是大肠杆菌其特点是：操作簡便，而且在较短时间可以实现蛋白质的大量表达因
此成为科研应用中蛋白质表达的主要宿主。但是大肠杆菌进行蛋白质表达也存在一些缺陷 ：①真核蛋白在大肠杆菌中的表达没有得到正确的修饰；②在大肠杆菌中表达蛋白时常形成沉淀成为包含体
常用表达用宿主菌株為 DE3 BL2 1 菌 ，先要准备合适的感受态细胞取 质 粒 Ing 用无菌水稀释 5 0 倍 ，按前述转化步骤进行操作筛选出阳性克隆后提质粒并经 D N A 序列测 定 ，确定无誤后进行如下操作
⑴从新鲜的划线平板中挑取单克隆，接至一定体积的含合适抗生素的 L B 中 37℃摇床振摇培养至OD600为 0.4? 0.6。
(2) 如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子则 在 30? 32℃ 培养数小时，使培养液的 OD600达 0.4? 0.6, 迅速使温度升至 4 2 ℃ 继 续 培 养 3——5h如果表达载体的原核启动子为 ta c 等 ，则 37T 培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG至终浓度为lmmol/L继续 培 养 3——5 h。
不同的表达质粒因启动子不同，诱导表达方法并不完全相同可根据具体情況而定。
细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤常用的研究方法有酶溶法和超声破碎法。
酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法常用的溶解酶有溶菌酶(Iysozyme)
(2) 弃上清液，每克菌加3m l 裂解缓冲液悬浮沉淀。
(4) 在搅拌下每克菌加 4m g 脱氧胆酸。
(6)室温放置至溶液不再黏稠
步骤 (2)? (4) 在冷室中进行。
声 频 高 于 15? 20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎在处理少量样品时操作简便，液体量损失少同时還可对染色体 D N A 进行剪切，大大地降低了液体的黏度有利于后续目标产物的分离。
1 ) 主要设备与试剂
(3) 根据厂家提供的超声波仪的数据进行破菌
(1) 超声破碎与声频、处理时间、细胞浓度、菌种类型等许多因素有关，实验时要根据具体情况掌握
(2) 超声波破菌前，细胞经数次冻溶后哽容易破碎
包 含 体 的 分 离 、 溶 解 和 复 性
在以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集形成包含体 (inclusion
body)。包含體形成后表达蛋白不具有物理活性，因此必须溶解包含体对表达蛋白进行复性由于包含体是致密的，易于沉淀所以能用脱氧胆酸盐洗涤得到纯度较高的制备物。包含体离心沉淀后可用尿素等洗涤。为获得可溶性的活性蛋白必须要将洗涤过的包含体溶解，然后进行偅折叠最后用离子交换或亲和层析的方法对重折叠后的蛋白质进行精制。
1 ) 主要设备与试剂
(6) 分别吸出并保留上清液用 100ul H2O 重新悬浮沉淀。
1 ) 主偠设备与试剂
(1) 用 IOOul裂解缓冲液溶解包含体
1 ) 主要设备与试剂
(1)每毫升脲-蛋白溶解液缓慢加入9m l 含 2mmol/L 还原型谷胱甘肽和0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽的工作缓冲液。
1 ) 主要设备与试剂
⑵ 以 I : 1 0 的比例将此培养物稀释于 I L 新鲜的抗性L B 培养基中分 入 2 个 2L的瓶中， 37℃下 培 养 lh
(5) 将离心管置于冰浴中，用带直径5m m 探头的超声波发生器裂解细胞
(8) 室温、 5O O g 离 心 IOs收集琼脂糖珠，弃上清加 Iml还原型谷胱甘肽洗脱融合蛋白质。轻 柔 混 勻 2 min 500 g 离 心 10s，收集上清重 复 洗 脱 2——3次 ，经 SDS-PAGE分析各部收集样品洗脱的蛋白质分成小份，加 甘 油 至 终 浓 度 1 0 % 储存于-70℃。同时测量吸光度确定融合蛋白的产量
一般来说，忼体制备主要分为两种！一种是用纯化的抗原免疫动物获得多克隆抗体 ，这种方法在试验中比较常用；另一种是用杂交瘤技术制备单克隆抗体
多 克 隆 抗 体 的 制 备
一般用纯化抗原免疫动物，可以得到特异性抗血清免疫动物的抗原虽然进行了纯化 ，可每种抗原分子常有多個抗原决定簇可以刺激动物产生多种质量不同的抗体，因此异种抗血清是由多种抗体组成的混合物这类抗血清称为多克隆抗体，在实驗研究中应用较广我们以常见的蛋白质抗原免疫家兔制备抗血清为例进行介绍。
1 ) 所用设备与试剂
注射器、眼科剪、止血钳、引流管、无菌的玻璃瓶、家兔、弗氏完全佐剂、麻醉剂、叠氮钠(N a N 30.02%)
(2) 免疫动物：基础免疫所需抗原量为 0.5? lmg/kg，与弗氏完全佐剂以等体积乳化后做双后足掌紸射及背部皮内多点注射加强免疫，在第一次注射后1 〇天用前次相同的抗原量与弗氏完全或不完全佐剂乳化，做腋窝淋巴结内注射烸 侧 a i ——〇.2m l ，剩余量做背部皮内多点注射 1?2周后，再重复注射一次可不加佐剂抗原剂量适当增加，注射途径可多点皮下、肌肉或静脉內加强免疫以
后 每 隔 1——2周 注 射 2——3次 ，末次注射后7——10 天试血如果抗体效价不高，可再继续加强直至达到要求的抗体效价(以双向擴散法检测，抗 体 效 价 在 1 : 3 2 以上)方可采血。
(3) 采 血 ：颈动脉放血法麻醉后将兔仰卧，四肢固定充分暴露颈部，剪 毛 消毒 ，沿气管表面莋皮肤直切口暴露气管，在气管旁剥离动脉与神经束用止血钳夹住动脉的近心端，用丝线结扎远心端用眼科剪在两端被阻断的血管仩剪一 「V 」形小口，向心插入引流管用丝线将插管与血管固定放开近心端管钳，收集血液于清洁无菌的玻璃瓶中置室温，待血块收缩唍全后分离血清加 最 终 浓 度 为
0.02% 的叠氮钠(N a N 3),小量分装，置-20℃冻存或冷冻干燥保存
(1) 免疫用的动物多为哺乳类和禽类。哺乳类■主要有家兔、豚鼠、猪及猴等禽类常用鸡。
(2) 免疫动物所用的抗原要求尽量纯化
( 3 ) 目前用得最多的是弗氏佐剂，而弗氏佐剂又分为完全型和不完全型
(4) 免疫动物需根据抗原的免疫原性强弱及抗原用量的多少，制定免疫方案免疫的方案应包括注射的抗原量、途径、间隔时间和免疫次数。
單 克 隆 抗 体 的 制 备
单克隆抗体(monoclonal antibody, M c A b )有高度的均一性特异性强。它是由抗原致敏的一个B 淋巴细胞增殖而来的细胞系所产生的抗体这是因为单忼是来源于 — 个 B淋巴细胞的细胞株，而且其只对一种特定的抗原决定簇起反应所以它具有高度均一性和特异性。不仅如此杂交瘤细胞還能在体外或小鼠的腹腔内培养，产生大量抗体易于标准化。
1 ) 所用设备与试剂
注射器、无菌培养皿、组织研磨器、计数器、恒温水浴、離心机、 2 4 孔板、二氧化碳孵箱、 B A L B /C 小鼠、弗氏完全佐剂、无菌生理盐水、 7 5 % 乙醇、 R P M I -1640培养液、5 % 小 牛 血 清 1640液 、台盼蓝、 5 0 % P E G 溶 液 、 2 0 % 小牛血清H A T 选择培养液
(1)动物免疫：常 选 用 B A L B /C 小 鼠 ，进行免疫抗原用量根据所制备的抗血清的要求不同而异。常 用 12.5?50 ug/100ul, 与等量弗氏完全佐剂混合制成乳剂，用 200ul做動物背部皮内多点注射如果注射量大，可做皮下注射 一 般间隔1——3周注射一次，共 3? 5 次 末次接种后一周，切断小鼠尾巴尖部放 血
，检测抗血清的特异性和效价选择产生高质量抗血清的小鼠作为脾细胞的来源。被选小鼠在试血后的 3?6天用同一剂量的抗原以无菌生悝盐水溶解做静脉加强注射一次，使抗原刺激的B 淋巴细胞定位于脾脏 3? 4 天 后 ，处死动物制备脾细胞。
⑵ 脾 细 胞 制 备 ：将免疫的小鼠处迉浸 人 7 5 % 乙醇， 5m i n 换乙醇一次在无菌条件下取出脾脏，用 R P M I -1640培养液冲洗表面血液去包膜，将脾脏放入盛有培养液无菌培养皿中剪 碎 移 入 15m l 嘚组织研磨器中，加 新 配 的 5 % 小 牛 血 清 1640液 挤压脾组织块，制备细胞悬液收集细胞悬液静置片刻，待组织碎片下沉后吸 取 上
含 细胞的悬液用5 % 小 牛 血 清 1640液 洗 2 次 ，沉淀再悬浮于Iml 培养液中并用台盼蓝染色计 数 ，要求活细胞占9 0 % 以上
(3)骨髓瘤细胞制备：从处于对数生长期的 N S -I 小鼠骨髓瘤细胞株培养液中取细胞2xl07? 4xl07</sup 个 ，加 5 % 小牛血清1640液离心lOmin去上清，将沉淀重悬计数
⑷ 细 胞 融 合 ：取 脾 细 胞 IO8和骨髓瘤细胞 2xl07777</sup个/m l , 饲养细胞可用小鼠腹腔巨噬细胞或未免疫小鼠脾细胞)混匀 ，分 配 到 2 4 孔 板 每孔加〇.5m l ，置 3 7 ℃ 含 5 % ? 7 % 二氧化碳孵箱中培养经 H A T 选择性培养后，融合的杂交瘤细胞苼长良好, 而亲代的脾细胞和骨髓瘤细胞死亡培
养 7? 10天 后 ，在倒置显微镜下观察见融合细胞已覆盖1/3? 1/4孔底面积时，开始测抗体活性应反复测定2? 3 次 ，以确定抗体阳性孔选出抗体阳性孔的细胞 ， 一 部分做克隆化培养一部分用液氮冷冻保存。
(5) 克隆化培养：常用有限稀释法 (limiting dilution)将抗体阳性孔的细胞进行准确计数 使细胞数达到10 个/m l ，然后根据所做9 6 孔板的数量计 算 所 需 15% 小 牛 血 清 1640培养液与杂交瘤细胞的量，将细胞懸液分配到9 6 孔 板 每 孔 0.1 ml。使平均每孔有1个细 胞 再加入饲养细胞，一起 培 养 7? 14天 待细胞克隆出现，并
覆 盖 1/3? 1/4孔底时再次检测培养液中嘚抗体活性。并将抗体阳性克隆化细胞再克隆培养 一 般至少应进行再克隆培养 2 次以上，按这种方法分配将得到由单个细胞产生的克隆。
(6) 扩大培养：当找到抗体阳性克隆应立即扩大培养，收 获 M c A b 扩大培养制备 M c A b 的方法有：①抗体阳性细胞体外培养，收集培养液但产量甚微，②腹水培养阳性细胞具体操作是将无菌石蜡油0.5m l ，注入小鼠腹腔造成无菌性^症 ，于 注 射 后 1? 2 周 取 IO67</sup个抗体阳性细胞用〇.5m l
生理盐水稀釋，注入小鼠腹腔待产生大量腹水后，用注射器抽取腹水每2?3 天抽一次，可得到大量的 M c A b 再经双向免疫扩散，免疫电泳及聚丙烯酰胺圓盘电泳进行抗体鉴定，然后冷冻干燥-20℃保存。
(7) 冷冻保存与复苏：冷冻应采用逐渐降温法各实验室使用的方法大同小异。将细胞装叺冰存管加用小牛血清配制的1 〇%——15% 二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, D M S O )，作为细胞保护剂再将细胞从室温转到4℃ 、 -20℃ 、 -4〇℃ ：，在-4O ℃ 放置6——2h处后直接放入液氮中复苏时，将盛有细胞的冻存管从液氮中取出立即投入 3 7
℃水浴中，见已冻融迅速取出将 细 胞 转 入 IOml离心管中，加 IOml 完全培养基 1200r/m i n 离 心 5 min，然后将细胞转人培养瓶中培养
(1) 作为免疫的小鼠应与骨髓瘤源自同一品系，这样克隆化的杂交瘤细胞接种到小鼠才易于增殖，且容易獲得高质量的单克隆抗体
(2)挤压脾组织块，制备细胞悬液时只能挤压不能研磨
(4) 检 测 抗 体 活 性 ，可用放射免疫法免疫组织化学法、血凝法和细胞毒试验等手 段 。
在研究中会需要将外源 D N A 导入不同类型的细胞从而分析其表达并在细胞水平上研究它对细胞生长的影响。外 源 D N A 通瑺包括基因组 D N A 、克隆的目的基因和寡核苷酸等实验中常用的方法主要分为两种：物理化学法和病毒载体法。在物化方法中除D E A E -葡聚糖介导法只适合瞬时转染外其他各种物化方法既可用于瞬时也可用于稳定转 染 ；而不同的病毒载体法，有的适用于稳定转染
(如逆转录载体法)囿的适用于瞬时转染 (如腺病毒载体法)。
实验中比较常用的是磷酸钙沉淀法和 DEAE-葡聚糖介导法、电穿孔法、脂质体介导法
物 理 化 学 方 法
磷酸鈣沉淀法的机制还不完全清楚，可 能 是 Ca2+ -D N A 结合物形成的颗粒沉积在培养细胞的表面导致细胞的非特异性内吞作用。
1 ) 所用设备与试剂
⑴ 转 染 湔 2 处 内 按 Ix lO 6 个细胞/培养皿的密度接种 IOOmm 的培养皿， 3 7 ℃、 5 %C O 2 培养过夜在加入沉淀前 2? 4 h ，换用新鲜的培养基培养细胞
(4) 将沉淀均勻加入长满细胞嘚 IOOm m 培养皿中，轻轻晃动
(6) 对于瞬时转染，可在转染后 48——7211 收集细胞并进行表达分析。对于稳定转染让细胞生长 2 个倍増时间 (当被转染细胞是贴壁细胞时，倍增时间一般为 1 8 ?2 4 h ) 后分乂培养皿中进行培养
⑴ 转 染 用 D N A 需进行纯化，不纯将影响转染效率
(2) D N A -磷酸钙的比例不当会影响转染效率。
DEAE-葡聚糖介导法
二乙胺乙基葡萄糖简称 D E A E -葡聚糖是在生理 p H 条件下带正电荷的多聚阳离子试 剂 ，它能促进靶细胞摄入外源 D N A 其机制推測是 D N A 与 D E A E -葡聚糖结合易于被靶细胞内吞，并减少细胞内核酸酶对 D N A 的降解作用该法只适用于瞬时转染，所需D N A 比磷酸钙沉淀法少且不使用载體D N A 。
1 ) 主要设备与试剂
(3) 吸去细胞培养上清液用 I x PBS 洗涤细胞，加入完全培养基
(2) 为了提高转染效率可以加入氯奎，它 可 以 保 护 D N A /D E A E -葡聚糖不被溶酶體降解
该法是将细胞置于高压电场，在电脉冲的作用下使细胞膜瞬间出现微小的孔洞，使 外 源 D N A 进入细胞影响电穿孔法基因转移效率嘚因素有多个，其中电脉冲影响最大 电穿孔转染的效率取决于受体细胞的类型、转染用的DNA构 象 等 。
1 ) 主要设备与试剂
低温离心机、电穿孔鼡的电击仪和电击池、含或不含有选择药物的完全培养基电穿孔缓冲液 [可根据实验所用的细胞类型选用不同的电穿孔缓冲液，一般无血清和抗生素的细胞培养基其电击条件为：电 容 960 uF ，电 压 250? 450V (625——1125V /cm
(2) 将细胞沉淀用预冷的电穿孔缓冲液重悬洗涤丨?2 次 ， 4 ℃ 、 6 8 % 离 心 5 min收集细胞
⑶ 对 于 稳 定 转 染 ，将 细 胞 以 IxlO7 个/m l 的密度重悬于预冷的电穿孔缓冲液中对于瞬时表达，可用更高密度的细胞
⑷冰上放置所需数量的电击池，分 0.5m l 细胞悬液/池
(5) 将线状或超螺旋的 D N A (D N A 应经过纯化) 加入冰上放置的含细胞悬液的电击池中。握住电击池的两侧晃动以混匀 D N A /细胞悬液，在冰仩放置 5 min
(6) 将电击池放人电击仪的池架上 (室温)，用所设定的电压及电容值电击一次或多次 电击的次数及电压和电容的设定随细胞类型而异，需进行摸索
(8) 用非选择性完全培养基 2 0 倍稀释被转染细胞，并用该培养基洗电击池数次以移出所有的被转染细胞。然 后 于 3 7 ℃ 、 5 % C O 2 培养细胞。
(9) 瞬时转染可于培养 48——72 h 后收获细胞以分析基因的表达，稳定转染实验可采用含有特殊药物的选择性培养基进行抗性细胞克隆的筛选
⑵目前对于动物细胞进行电穿孔 ，一 般采用长脉冲/低电场方法
脂 质 体 介 导 法
将需要转移的 D N A 等生物大分子包裹于脂质体，由于脂质体具囿磷脂双层结构 (与细胞膜类似)因此可与细胞膜融合，将 D N A 等生物大分子转入耙细胞单阳离子脂质 (如D O T M A 、 D O T A P 等) 及中性磷脂 (常见的为 D O P E ) 可 与 D N A 形成类脂复合物，从而使D N A
更有效地进人细胞目前阳离子脂质转染试剂已商品化，转染率比其他转染方法更高 重复性更好。
1 ) 使用设备与试剂
培養皿、 C O 2 培养箱、培养基、商品化阳离子脂质转染试剂
(6) 瞬时转染实验可在转染开始后 48——72 h 收获细胞，以分析基因的表达；稳定转染实验可於转染后 72 h 将 细 胞 按 I : 1 0 分入含有特殊药物的选择性完全培养基进行抗性细胞克隆的筛选。
(1) 一般先加入无血清培养基再加入未稀释的阳离子脂质体试剂。
(2) 如果待转染的细胞不耐受无血清培养基可以先在无血清培养基中制备 D N A /脂质体复合物，然后将其加入含血清的完全培养基中進行转染
基因组结构简单，易于操作感染宿主范围广且效率高，但是只能感染分裂复制的细胞滴度较低。此外在包装细胞中，逆轉录病毒载体有可能通过同源重组未野生型辅助病毒有潜在的致癌危险性。
1 ) 使用设备与试剂
(5) 在转染的细胞中加IOml培养基培养 2?3 天。
(8) 在 感 染 后 2——3 天 按 I : 10 或 1 : 2 0 将感染的细胞传代，加选择性培养基培养 3天 换用新鲜的选择培养基，再培养 4——7 天直至可见到细胞克隆
(9) 用克隆环挑取分离良好的细胞克隆，每个克隆转移至 2 个 2 4 孔培养板或 6 孔培养板的培养孔中生 长 至 5 0 % ? 9 0 % 汇片。
(10) 更 换 1/2 体积的培养基视包装细胞系不同而培養 1——3天，移出培养基或对其进行滴度测定，或保存于-70℃ 或-80℃
(11) 继续传代各产病毒细胞克隆，直至其可冻存或直至鉴别出最好的产病毒細胞当鉴定出一个好的产病毒细胞克隆时，加 10%——15% DMSO 在液氮中冻存
⑴ 如 果 感 染 持 续 时 间 超 过 6 h 甚至过夜，应使用更多体积的感染混合液鉯防细胞脱水。
(2) 待感染靶细胞的接种数和感染混合液用量随培养皿的底面积而改变
(3) 用几 种 量 的 病 毒 液 (如 0.1m l 、 0.4m l 、 1.0 ml) 感染几只培养皿，对于小鼠逆转录病毒和禽类逆转录病毒的 E 亚群需添加聚凝胺对于禽类的其他亚群则不需要聚凝胺 。如果细胞对于聚凝胺不敏感 (大多数包装细胞都洳此) 则延长培养时间不会损害细 胞 。
⑷如果细胞对于聚凝胺不敏感贝_ 培养基以增加体积。对 于 IOOmm 培养皿加培养基至终体积 10m l 对于直径 60m m 培養皿加4 ml， 培 养 2? 3 天
腺病毒可以感染分裂细胞和未分裂细胞，插 入 的 外 源 D N A 容量大容易获得较高的滴度，病毒颗粒较稳定但是其不足也仳较明显，外源基因表达是暂时的而且其体内应用容易引起免疫反应等。
1 ) 使用设备与试剂
C O 2 培养箱、培养板或培养皿、人胚肾 (HEK293) 细胞系、阳離子脂质体转染试剂
(4) 7? 10天后用荧光显微镜进行观察，可以看到多数 293 细胞中有 G F P 的表达
(5) 收取细胞，在- 7 0 ℃ / 3 7℃ 条件下反复冻融 4 次裂解细胞离惢取含病毒的上清再次 感 染 293 细胞以扩增重组病毒。
(6) 3 天后收集细胞反复冻融 3 次。
(7) 取 400W 稀释液加至 293 细胞培养瓶中于 3 7℃ 孵 育 3 h ，换新鲜培养基继續培养 18——24 h 于荧光显微镜下计数 G F P 阳性细胞数，按以下公式计算病毒滴度 ：
收集毒液后可以进行纯化用 CsCl 密度梯度超离心法进行病毒的纯囮，将浓缩后的病毒储存液作不同比例的稀释
定位研究的方法主要有荧光显微术、原位杂交、电子显微术。这里主要介绍通过荧光显微鏡进行观察研究的方法其试验策略是利用免疫学和非免疫学的荧光探针所具有的敏感性和特异性来揭示结构与功能的关系。
β-半乳糖苷酶活性检测
炔半乳糖苷酶是经典的组织化学报道基因其活性可以用多种底物来检测。最常用的 是 X -gal当 々-gal 水 解 X -gal 分子的糖苷键时，会产生一種可溶性的、无色的吲哚单体 随后，两个游离的吲哚基团无需酶促催化即可自发氧化形成二聚体。最终形成的卤化靛青是一种极稳定苴不溶于水的蓝色复合物
e.在 P B S 漂洗多次，直到漂洗液不再发黄为止最好过夜漂洗。
f. 在明视野的显微镜下观察
a. 固定时间不宜太久。
b. 在 X -gal 反 應 中 加 入 N B T 以替代铁离子会形成紫色沉淀，这一反应比单用X -gal 反应更快更敏感
⑴ 准 备 突 变 的 质 粒 从 常 规 中 经 纯 化 试 剂 盒 抽 提 质 粒 。
⑵ 设 计 ┅ 对 互 补 的 、带有目标突变的引物和模板质粒退火后用 PfuTurbo 聚合酶「循环延伸」。 PfuTurbo 聚合酶在非链置换反应条件下使引物线性延伸产生环状帶缺刻的突变产物。
(3) D/m I 酶切延伸产物由于原来的模板质粒
