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[求助]石蜡包埋组织提取RNA
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这个帖子发布于11年零286天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
求助各位高手，有用石蜡块标本组织做过RT-PCR的吗？哪里可购得相关试剂盒？？
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PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA，再用PCR进行特异性的DNA扩增，应用这种方法，他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA，操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂，离心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质，将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法进行DNA扩增。
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我没有做过从石蜡标本中提取RNA的，但是PCR发明者Kary Mullis和其他人和编的书（The Polymerase Chain Reaction，1994年出版，（中文译名《聚合酶链式反应》）；陈受宜，朱立煌等译；科学出版社1997年第一版）看到过一小段文字谈及这个问题，如下：从福尔马林固定，石蜡包埋的组织或载波片上的涂片中也能提取出RNA，并由RT－PCR加以扩增。RNA酶的广泛存在增加了分离RNA的技术难度。大多数对固定组织的研究均用DNA作为PCR模板。参考文献如下：Rupp GM，Locker J（1988）：Purification and analysis of RNA from paraffin-embedded tissues by the polymerase chain reaction.
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关于丁香园明后就可以将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡；透明剂；透明剂很多，一般常用的有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，；1．二甲苯：是最为常用的一种透明剂，它能与酒精，；2．氯仿：也是一种很好的媒剂，它的作用缓和；3．香柏油：是研究处理细柔组织的最佳透明剂，因它；透明时间的长短因组织的大小而异；延长在二甲苯内留置时间，最好先投入酒精和透明剂等；脂肪组织由于其结构不同透明最快，但是
明后就可以将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡。
透明剂很多，一般常用的有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，香柏油等。
1．二甲苯：是最为常用的一种透明剂，它能与酒精，丙酮相混合，又是石蜡的溶剂。在透明过程中，组织继续发生硬化，由于二甲苯对组织的收缩性强，作用迅速，因此，组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬，一般是达到组织的透明为度，小块组织在半至一小时内透明。为了不使组织过度硬化，苯则。是更好的一种透明剂，它较甲苯和二甲苯的作用稍缓，对组织收缩较少，不易变脆。但苯较二甲苯毒性大，挥发快，故应注意安全使用。
2．氯仿：也是一种很好的媒剂，它的作用缓和。组织在此液内过夜也不至于过硬变脆，这一点较苯，二甲苯和甲苯优良。但氯仿比重较大，折光率较小，不能改变组织的折光率，组织在氯仿中不易呈现二甲苯那样的透明现象，所以组织要比实际需要浸渍更长一些时间保证完全渗透和置换出酒精。
3．香柏油：是研究处理细柔组织的最佳透明剂，因它的硬化作用极小，组织在此液体内较长时间甚至几个月也可无妨。过硬的组织脱水后，（如皮肤和致密纤维组织）用香柏油透明，经此处理后的组织容易切片。不过香柏油的浓度大，渗透力弱，同石蜡混合不及其他透明剂效果好，故常规石蜡切片一般不用。
透明时间的长短因组织的大小而异。例如脑组织和有血块的组织，就应该缩短在二甲苯内留置时间，而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍
延长在二甲苯内留置时间，最好先投入酒精和透明剂等量混合液半小时，再入透明剂，并更换一次透明剂，待组织完全透明后进行浸蜡，一般需要半小时至2－－3小时。
脂肪组织由于其结构不同透明最快，但是这并不能说明组织中脱水剂已完全被透明剂取代，因脂肪组织本身折光率与透明剂（二甲苯）相近，所以应在透明剂中多浸一段时间使脂肪组织尽可能为透明剂所溶解，才有利于石蜡的侵入。
透明过久是否会导致组织过度硬化变脆，这取决于脱水的彻底与否，如果组织脱水完全彻底，则不会导致过度硬化和变脆，个别含胶样物质过多的组织例外。
第三节 浸 蜡
组织经媒剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡。根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要能够保持于54－60.C温箱内进行。石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关，因此对石蜡的选择应以注意。
用作浸蜡的石蜡不应含有尘粒，杂质及其他异物，不含水分，质地均匀成半透明状，触之感觉滑而不腻，结晶及颗粒少。石蜡中如有水分会结晶而变为白斑可用加热搅拌的方法除去。所有的蜡在使用前按常规必须用标准滤纸在漏斗内过滤到搪瓷杯里储存于浸蜡箱中。最好将石蜡于小锅中加热煮至近沸，冷却再煮反复数次后空气可以排除，挥
发性油脂类在煮的过程中挥发。处置后的石蜡置于恒温箱中保持液体状态备用。所用的石蜡有一定的熔点和硬度，熔点高，硬度大。一般要求在52－56℃之间，这既可以支持硬组织也可使切片成条。使用时应根据组织类型以及制片时的温度和气候而异。夏季采用高熔点的石蜡，冬季则采用低熔点的石蜡。
石蜡的熔点越低，其质地相应的较为疏松。硬蜡（熔点60℃）用于硬纤维组织。软蜡用于胎儿和乳腺组织，这些尽为研究工作的需要。为了增加石蜡的韧性，可在石蜡中加入一些混合剂，常用蜂蜡，硬脂酸，松香等。
1.蜂蜡：又叫黄蜡，是蜜蜂用来造巢的淡黄色蜡，熔点在54℃左右，质地柔软，滑润有韧性。为了使低熔点的石蜡硬一些，可加入10－20％的蜂蜡。它能增加蜡的熔点而不必使组织浸在高温内，便于切片。也要根据组织的种类而异，一般常规用量不超过5％为度。
2.硬脂酸：为有光泽的白色片状结晶体，不溶于水，而溶于乙醇，醚和氯仿。熔点64－71％，在浸蜡中加入少量的硬脂酸可增加石蜡的渗透性。有人用硬脂酸和石蜡混合液置于温箱中代替二甲苯透明。
3.松香：为棕黄色半透明的固体。质硬而脆，遇热熔解，呈胶体状，同石蜡混合时，可增加石蜡的硬度，由于松香质脆，混合后可增加硬度但韧性不足。
组织浸蜡时间也应视组织种类大小和结构不同而异。在整个浸蜡过程中，标本大小对完成浸蜡所需的时间有很大影响。较厚的组织需要较长时间才能使蜡浸入中心，而且厚的组织常带入的透明剂比较
多，故需要多次浸蜡才能将透明剂除去。即使少量透明剂也会沾污石蜡而产生结晶，致使切片时切片易碎裂。也要考虑组织的种类，骨，皮肤和中枢神经系统等致密组织要比软组织如肝肾等需要加倍时间。含血多的组织，肌肉和纤维束在蜡内易过硬而发脆，故浸蜡时间应缩短。疏松组织，脂肪，消化道组织等浸蜡时间可以适当延长一些。为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步，第三步。浸蜡时间1－4小时，或更长，并使之过夜则较易切割，如此浸渍的组织切片在干燥箱内干燥也不易卷曲和龟裂。
第四节 包 埋
包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
一．石蜡包埋法
石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。 包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下：
1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取
出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。
4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。
二．石蜡包埋的注意事项
1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再
60。C左右。
2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。
3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为
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　石蜡包埋技术制作石蜡切片, 切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中,而水与石蜡又是不 相混合的,所以在浸蜡,包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织 ... 　一、石蜡包埋技术石蜡包埋技术制作石蜡切片, 切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中, 而水与石蜡又是不相 混合的,所以在浸蜡、包埋前必须将组织内所含的水分脱去。... 　该法应用于各种组织的染色,是组织学技术的基本方法,对 任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用, 只是对不同包埋的切片法处理 略有不同。下面简介石蜡包埋... 　石蜡包埋_生物学_自然科学_专业资料。主要介绍石蜡包埋的方法和步骤 ...Bouin 氏液在组织学切 片技术方面应用甚广,配方如下: 苦味酸饱和水溶液 75ml ... 　石蜡切片技术实验实验目的 掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求。 实验原理 石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。此法 适用... 　(3)正丁醇:是较好的脱水兼透明剂,可与酒精及石蜡混合,用于脱水是可先经过各种...细胞石蜡包埋切片技术的... 3页 1下载券
从石蜡包埋的组织中提取... 4页... 　根据包埋剂的不同,分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切 片等,它们各有长处,可以根据需要选用,但是使用得最多的还是石蜡切片技术。 石蜡作为包埋剂,有其独特的优点... 　方法:使用组织芯片空心蜡模一次性成型 的模具,应用改良的组织芯片制备方法以及二次石蜡包埋技术,制作 食管癌肿瘤组织芯片,常规病理石蜡切片制备组织芯片,观察... 　石蜡包埋组织的DNA提取石蜡包埋组织的DNA提取隐藏&& 石蜡包埋组织的 DNA 提取近 10 年来,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域,为了解病理状...您的位置： &&
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详&细&地&址：广州清华科技园创新基地番禺区石楼镇创启路63号二期2幢101-3室
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