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即送15丁当
WB测睾丸中p-p38时，是否可以用β-tubulin作为内参
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如题，因为磷酸化p38分子量为43，所以排除了最常用的beta-actin，似乎GAPDH35也略有接近，所以是否可以选择β-tubulin，它在大鼠睾丸中稳定表达吗？
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惜岫 如题，因为磷酸化p38分子量为43，所以排除了最常用的beta-actin，似乎GAPDH35也略有接近，所以是否可以选择β-tubulin，它在大鼠睾丸中稳定表达吗？可以用GAPDH，2个条带分界还是很明显的
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李万友 可以用GAPDH，2个条带分界还是很明显的谢谢！不能选择β-tubulin吗，我看很多问题关于β-tubulin都让选择另外两种，是它跑的条带不好吗
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我猜为什么不推荐用β-tubulin，是因为12-45KDA的时候可以选择15%的凝胶，而如果是10-70KDA就选择12.5的凝胶了
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即送15丁当
【求助】关于beta-actin做RT-PCR的内参问题
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这个帖子发布于6年零144天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
求助：课题组做RT-PCR一直用beta-actin做内参，结果一直很好，是神经科的一种动物模型，之前发表的文章都没有问题，现在审稿人质疑说beta-actin在好多神经模型中是会有变化的，问我怎么知道在我的模型中是稳定的呢，现在很犯愁，请求高人指点！多谢！
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现在 很多专家认为 actin tublin等很多内参基因
在不同的组织 不同的外界条件下是有变化的 不适合做内参基因
所以很多人在确定 内参基因的时候都根据自己的物种 选择很多不同的内参 然后对比 ，选择 最稳定的来做内参！！！但是那些基因到底是怎么变化的，我也不知道， 我们现在就在筛选内参基因，但是引物设计上出现了很大的问题！ 哎
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丁香园荣誉版主
现在仍然以逆转录RT-PCR为主要技术手段之一来做课题的可能不很多了，但恐怕很多人在过去的研究项目中使用过或者正在使用RT-PCR。很多人都是用用beta-actin或者GAPDH作为内参的，并且也有不少文章发表过了。最近偶然发现2001年就有文章发表反对千篇一律用beta-actin做内参照可参与此贴讨论：
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新手学习下
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时代在进步，有新认识是好事，我现在没做相关领域，但很乐见有新的idea！
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多选几个内参，如果得到一致的结论，可以回答评审的问题。
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了解一下，谢谢
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这里也有听说内参出问题杂志社返稿的情况，真是要多学习一下了~~
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我用luminex测mRNA的表达量，用ACTB(beta-actin)做为看家基因，在不同人不同组织类型中，它的表达量确实是发生变化的。要想说服审稿人只能用实验数据说话，针对你用的动物和组织类型，出具较大量的数据，证明ACTB在你的实验中是稳定表达的。
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PCR引物人鼠通用问题β-actin
5′-CCA TGT ACG TTG CTA TCC AGG-3′(F)
5′-TCT CCT TAA TGT CAC GCA CGA-3(R)
21bp β-actin
5′-GTG AAG GTG ACA GCA GTC GGT T-3′(F)
5′-GAA GTG GGG TGG CTT TTA GGA-3(R)
21bpGAPDH-UP
CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC
-3'GAPDH-down5'-
GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG
-3'这些都是人的引物,麻烦你帮我看看能用在小鼠上面嘛?我的联系方式：
未来大空樓
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我帮你看了一下.β-actin RT-PCR 252 不行β-actin QPCR 157 也不行GAPDH 的也不行建议你自己设计吧,免费的软件 小鼠GAPDH mRNA序列β-actin 把序列输到软件就可以了
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有很多方法可以解决这个问题。1、ncbi上分别查询人和鼠的β-actin和GAPDH cDNA全序列，比对一下就知道了；2、通过实验确认；3、文献检索各自的引物，都是很常用的内参基因，有大量的已知引物序列可以参考
扫描下载二维码【内参基因】内参基因_牛宝宝文章网【内参基因】内参基因专题：何为内参基因1、我记得常用的就是[color=magenta]GAPDH[/color]（3-磷酸甘油醛脱氢酶）和actin，至于什么是内参，可以打个比方，比如我们要比较两个不一样大的西瓜的含糖量，不好直接比较，那就找他们都有的东西来比较，就拿西瓜子嘛，假设西瓜子是均匀分布的，而且随着西瓜的变大，糖分的增多，西瓜子也变多，那么这个西瓜子就可以作为内参了！不知比方准确否，请高手指教，共同进步！2、内参基因一般会选管家基因，是维持细胞基本代谢活动所必须的基因，在各组织和细胞中的表达相对恒定，如：GAPDH、Actin、18S rRNA等3、内参基因,表达稳定，通常用的有GAPDH,beta-actin，18s rRNA等内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。［wWw.NIuBB.NET）其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。 一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。4、半定量RT-PCR和qPCR都需要内参，简单的说内参就是在你的那个培养条件下恒定表达的某个基因。做内参就是以内参引物PCR扩增该内参基因，看在你选定的几个时间点是不是都恒定表达，如果恒定才能说明你做PCR选的RNA（一部发RT-PCR）或cDNA(两步法RT-PCR)的量是等量的，这样比较你的目的基因的丰度才有意义。内参是相对的，不是绝对的，因为内参基因有时会受到影响。量PCR问题--绝对定量与相对定量有什么区别？绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。内参基因 内参基因定量PCR问题--标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理？假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18S RNA基因。[WWw.NIUBB.NET)IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：定量PCR问题--什么是CT值比较法？数据怎么处理？CT值与起始DNA浓度的对数成反比：如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。数据的处理方法见下表：内参基因 内参基因定量PCR问题--定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？ 总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。[WWw.NiUbB.NEt］首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。转载请保留本文连接：分享到：相关文章声明：《【内参基因】内参基因》由“的样子”分享发布，如因用户分享而无意侵犯到您的合法权益，请联系我们删除。TA的分享关注今日：15 | 主题：283134
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【求助】我的内参基因（β-actin、GAPDH）qPCR扩增曲线的不正常~求助~(T_T)
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我的内参选用β-actin、GAPDH，在A处理细胞的5个样中扩增曲线都好，B处理的5个样的扩增曲线成这副死样子。想请问一下：1.影响内参不一致的原因可能是什么丫（都是同一个人操作，应该不是加样的问题吧）？ 2.我用的是SYBR Green的双delta Ct法计算，我的这个扩增效率一样的，可否通过修正公式计算？如何修正丫？求大神带带我这菜鸟蛋~！扩增曲线如下图：1.A处理细胞的GAPDH扩增曲线2.A处理的β-actin扩增曲线3.B处理细胞的β-actin扩增曲线4.B处理的β-actin扩增曲线
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好冷清。眼泪都要掉下来了。。。
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A、B处理的CT值差好多呢，是不是B处理后RNA含量很低啊，一般内参在20左右比较好
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建议定量前cDNA做一下浓度梯度稀释，可以多选几个内参，看哪个内参的CT值在20左右，又不至于跟目的基因差异过大，我也是新手，不知道说的对不对，仅供参考?
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一风如映 A、B处理的CT值差好多呢，是不是B处理后RNA含量很低啊，一般内参在20左右比较好B处理后的RNA OD(260/280)大概都是1.9左右，应该还不错的。
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一风如映 建议定量前cDNA做一下浓度梯度稀释，可以多选几个内参，看哪个内参的CT值在20左右，又不至于跟目的基因差异过大，我也是新手，不知道说的对不对，仅供参考?请问定量稀释是为了做标准曲线嚒？cDNA我是每个样都统一稀释到了500ng/μL，测过的，差异很小（±25）。现在放上来2个的都是内参，A处理的内参的扩增曲线能大致重合，B处理的就好奇怪，CT值都不用看了。。。
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融解曲线怎么样？
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扩增条件变一下会有效果的，你可以试试，比如提高退火温度
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