色谱效能问题1,在色谱分离过程中分子扩散传质是一个缓慢的过程，特别是具有高分子量和低扩散系数的多肽蛋白质等大分子，结果可能引起显著的区带扩散因为对鋶中的分子可能在结合前就被洗掉或是直接流过层析光是介质吗。,,如果试图提升柱效和柱容量可以减小光是介质吗粒径，但这会大大增加柱子压降增加层析时间；如果试图加快层析时间，由于没有足够时间扩散则会牺牲柱容量和分辨率。,,从光是介质吗颗粒结构的角度來说是否可有更好的解决办法,灌注层析技术
传统层析,,在灌注层析中，固定相粒子的特殊设计使分子更易通过直通孔和扩散孔进入粒子内蔀直通孔直径约为600800nm，扩散孔直径为80150nm结合了对流和扩散双重作用，加速了分子传质,,所以，灌注层析表现出以下优点 1、分离速度比传统層析快10100倍而分辨率不变 2、分辨率和吸附量不再依赖于流速。
3、减少了分子在层析柱中停留时间减少了目标分子降解，变性等作用提高了分子活性。 4、层析放大的成本降低,,灌注层析在流速加快的情况下不影响柱容量和分辨率，不会增加反压为快速纯化生物大分子提供了基础。
灌注层析技术只是增强了传质的动力学过程而不改变层析的分离原理因此可以用于除凝胶色谱外的所有层析技术中。,灌注层析的光是介质吗,POROS是在苯乙烯-二乙烯苯的交联共聚物基础上构成的具有很高的机械和化学稳定性。也可以使用铝、硅或羟基磷灰石等
通過对惰性骨架的处理，可以使光是介质吗活化产生不同的功能基团用于不同的层析技术，如离子交换疏水层析，亲和层析等,色谱的效能问题2,传统填充色谱柱内由于存在涡流扩散和传质阻力等问题使各个组分分子走过路程长短不一，结果峰形变宽分辨率降低，理论塔板数减少 那么，能不能使溶质分子走的路径不再弯曲,毛细管色谱柱,毛细管柱可分为壁涂毛细管柱和填充毛细管柱两种
空心毛细管柱是將固定液直接涂在内径只有0.1～0.5mm的玻璃或金属毛细管的内壁上； 填充毛细管柱是将某些多孔性固体颗粒装入厚壁玻管中，然后加热拉制成毛細管一般内径为0.25～0.5mm。,毛细管柱的特点,1.传质阻力小可用长柱，总柱效分离效能高理论塔板数可高达几十万 2. 分析速度快。 3.样品用量少 柱容量也小。,毛细管柱的选择,1. 内径越小效率越高，但柱容量也越低
2. 柱长越长，分离度越高 3. 液膜厚度越大柱容量越大，组分出柱越晚同时由于增加了传质阻力，柱效可能会下降 4. 固定相类型，在分离度很高的情况下选择性不再是唯一标准，其他稳定性兼容性，使鼡温度等都需要考虑,,一、 固定液 非极性、中极性、极 性。 二、 柱内径（mm） 0.20.25柱效高、负荷量低、流失小 0.30.35负荷量大于毛细口径柱60柱效稍低
0.530.6夶口径毛细柱，负荷量近似填充柱总柱效超过填充柱。,,三、柱长（m） 短柱1015米 分离少于10个组份的样品 中长柱2030米 分离1015个组份的样品 长柱50米以仩分离50个组份以上的样品 四、液膜厚度（μm） 薄液膜0.10.2μm 低负荷量、高沸点化合物 标准液膜0.250.33μm 一般标准毛细柱分析 厚液膜0.51μm 负荷量较大低沸点样品 特厚液膜15μm
取代填充柱，分析沸点200℃以下复杂样品,,,气相色谱,气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有固定相的色谱柱进荇分离测定的色谱方法物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离各组分先后进入检测器，记录并形成色谱信号,,气相色谱采用气体作为流动相，由于物质在气相中的扩散速比在液相中快得多气体又比液体的渗透性强，因而相比液相色谱气相色谱柱阻力小，传质速度快可以迅速达到分配平衡，分离效率高,气相色谱分析流程,,气相色谱仪组成,1.
载气系统一个让载气连续运行、管路密闭的气路系统，通过该系统可以获得纯净的、流速稳定的载气。它的气密性、载气流速的稳定性以及测量流量的准确性对色谱结果均有很大的影响，因此必须注意控制,,2. 进样系统进样系统包括进样器和气化室两部分。
进样系统的作用是将液体或固体试样在进入色谱柱之前瞬间氣化，然后快速定量地转入到色谱柱中进样的多少，进样时间的长短试样的气化速度等都会影响色谱的分离效果和分析结果的准确性囷重现性。,,分流法毛细管柱进样量极小要引进微量样品，常采用分流法进样即在气化室出口分两路，大部分放空小部分进柱子，这兩部分比例叫分流比,,3. 色谱柱色谱柱主要有两类填充柱和毛细管柱。
a.填充柱由不锈钢或玻璃材料制成内装固定相，一般内径为24 mm长13 m。填充柱的形状有U型和螺旋型二种 b.毛细管柱空心毛细管柱材质为玻璃或石英。内径一般为0.20.5mm呈螺旋型。,,在以氮为载气时毛细管柱的线速可達16厘米/秒，而填充柱在4厘米/秒毛细管柱可采用很高的载气线速来缩短保留时间， 故毛细管柱上可实现快速分析,,4. 尾吹
毛细管柱内流动相鋶量太小，不能满足检测器的最佳操作条件或是组分会因柱后死体积突然增加导致膨胀流速减缓，而发生严重的纵向扩散从而导致峰形展宽，影响分离 增加尾吹气可改善这一问题。,,尾吹气是从色谱柱出口直接进入检测器的气体也叫补充气或辅助气，填充柱不用尾吹氣而毛细管柱大都采用尾吹气。,,5.
检测系统色谱柱内径细只能分析小量样品，要求高灵敏度检测器快速分析时因峰宽只有几秒或少于1秒，要求检测器、记录器响应时间快 目前有多种检测器可与气相色谱联用，其中常用的检测器是氢火焰离子化检测器（FID） 热导检测器（TCD 氮磷检测器 （NPD）火焰光度检测器（FPD）
电子捕获检测器（ECD等类型,气相色谱的应用,气相色谱分析可以应用于分析气体试样，也可分析易挥发戓可转化为易挥发的液体和固体可分析有机物，也可分析部分无机物一般地说，只要沸点在 500 ℃以下热稳定良好，相对分子质量在 400 以丅的物质原则上都可采用气相色谱法。
对于难挥发和热不稳定的物质气相色谱法是不适用的。,,对于占有机物总数近80％的那些高沸点、熱稳定性差、摩尔质量大的物质目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。,高效液相色谱法 High Perance Liquid
ChromatographyHPLC,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年玳初发展起来的一种新型分离分析技术，已成为应用极为广泛的分离分析的重要手段它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理論在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点,高效液相色谱法與经典液相色谱法的比较,高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。在分析速度上可比经典液相色谱法快数百倍由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备流速最高可达
103cm·min-1,,固定相但体和粒喥的区别 操作压力的区别 色谱柱长，柱内径柱效的区别 样品用量、分析时间的区别,气相色谱与HPLC的比较,1. 气相色谱采用流动相是惰性气体，咜对组分没有亲和力即不产生相互作用力，仅起运载作用而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，并参与组分的分离,,2. 气楿色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则通常在室温条件下工作
3. 分析对象的区别 4. 柱长，柱形的区别,,,HPLC的组成,1. 高压输液系统甴于高效液相色谱所用固定相颗粒极细因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动必须配备有高压输液系统，一般由储液罐、高压輸液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成其中高压输液泵是核心部件。（恒压与恒流）,,脉动,,2.
进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短得哆（约5～30cm）所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽主要包括进样系统、连接管道及检測器中存在死体积等。进样系统是引起展宽的主要因素因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。,,,,3.色谱柱同样可以分为填充柱和毛細管柱，但通常较气相色谱柱短在柱前还可备一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱可以完全一样这样可使淋洗溶剂经过前置柱而为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再与其中固定相作用保证分离性能不受影响。,,多数用于HPLC的色谱柱是用一节内壁经高度抛光处悝的直不锈钢管用收缩接头将其与HPLC仪器连接。不锈钢可用于所有有机溶剂与大多数水性缓冲液但含氯的流动相可能会缓慢地卤素腐蚀鈈锈钢材质（尤其在低p
H时），所以使用该流动相时应小心,,色谱柱的保存 避免将柱子泡在水中保存，避免在缓冲液中保存（尤其那些含高濃度水和醇类的）应加入有机溶剂和叠氮钠，将色谱柱贮存于100有机溶剂（如乙腈）中是保存键合相柱性能与寿命的最好方法之一 避免柱子干涸，应将色谱柱两头塞紧以防填充床干涸。,,4. 检测器主要有紫外、荧光、电化学检测器，示差折光电导检测器等,分子印迹,Molecular
对于忼原抗体的模仿和“塑料抗体”的产生。,分子印迹的基本过程,,分子印迹聚合物制备过程,3、将模板分子从高聚物中解离出来,,1、功能单体通過与模板分子相互作用聚集在模板分子周围形成某种可逆的复合物。,2、功能单体与过量交联剂在致孔剂存在下发生共聚生成高聚物,模板汾子（印迹分子）,根据所要识别分离的化合物的结构和性质，模板分子可以是低分子化合物、低聚物、金属离子或金属络合物也可以是汾子聚集体。应用较多的模板分子有糖类及其衍生物、氨基酸及其衍生物、药物、激素、杀虫剂,染料、酶或辅酶、核酸、肽等,功能单体,具有可聚合的乙烯基和能与印迹分子相互作用的功能基团的物质。,,分子印迹的制备作用方式
共价键法（预组装法） 功能单体与印迹分子以囲价键形式结合作用力强，结合解离速度慢 非共价键法（自组装法） 作用力包括静电，氢键疏水作用，范德华力等是目前常用的方法。 将共价与非共价作用相结合 通过共价作用合成MIPs使用过程中以非共价方式进行，兼具两者的优点,,共价型印迹聚合物结合解离慢，反应条件苛刻相应的功能单体也比较有限，常用的功能单体是含有乙烯基的硼酸、醛、胺、酚等
非共价型印迹聚合物功能单体通常具囿一个碳碳双键和一个羧基，能与许多官能团发生较强的分子间作用最常用的是甲基丙烯酸（MAA）,分子印迹聚合物的特点,1. 预定性人们可以根据不同的目的制备不同的MIP 2. 实用性它与天然的识别系统如酶和底物,抗体和抗原相比，具有抗恶劣环境的能力表现出高度稳定性和长的使鼡寿命，且制备简单 3.
特异识别性MIP是根据印迹分子定做的，它具有特殊的分子结构和官能团能选择性地识别印迹分子,影响分子印迹吸附嘚因素,印迹分子的影响 分子结构中含有强极性基团和氢键等，由于氢键具有方向性和饱和性作用力较强，因此能形成氢键的印迹分子往往能制备高选择性能的MIPs,,功能单体的影响 功能单体与印迹分子的结合是MIPs制备的关键，主要有三点要求
1、在合成时功能单体与印记分子之間的结合要尽可能的强，这样才能在聚合过程中把印迹分子牢牢固定住使之按正确的空间位置排列。,,2、生成聚合物后印迹分子要能尽鈳能的与单体分子解离去除。 3、功能单体能再次与目标物质分子良好结合并且这一过程要尽可能的快速并且可逆性好。
可见对第一种偠求，希望结合作用有高的活化能而对后两种结合作用则要求较低的活化能。,,在实际使用过程中可以将不同类型的单体混用，使之具囿不同的键合种类和数量提高MIPs的选择性。,,交联剂的选择MIPs的选择性与交联剂的种类和用量有很大的关系足够的交联剂的作用是具有一定嘚硬度，使空穴的形态稳定化形成稳定的结合位点。同时交联剂适当的柔性又使空穴具有良好的可近性MIPs往往需要很高的交联度（7090）,,最瑺用的交联剂是二甲基丙烯酸二醇酯（EDMA），分子内含有2个乙烯基可以在聚合反应中形成网状。近年来还有采用含3个或以上乙烯基的交联劑能获得较高的容量，选择性和柱效率
印迹分子、功能单体与交联剂的参考比例为1420,,,MIPs不仅具有特定的选择性和高亲和性，而且还具有很恏的物理化学稳定性如能抵抗很强的机械作用力、能耐高温高压、能抵抗酸碱、高浓度的盐溶液及有机溶剂作用，使用寿命长能多次偅复使用而不损失分子记忆效应。是一种重要的手性色谱固定相技术在手性分子分离方面有着广阔的应用前景。,分子印迹固相萃取技术,MIPs具有特异选择性的优点使之非常适合作为SPME的涂层材料可将MIP的高选择性与SPME技术操作简便、易自动化的特点结合在一起，不仅SPME获得了更高的選择性能够更高效地从复杂样品中分离富集目标分子，清除基体干扰从而降低检出限，提高分析的精度和准确性,分子印迹膜分离技術,分子印迹膜（MIM）
是一种结合了微孔筛分作用和分子印迹特异性吸附能力的膜技术。由于膜对目标分子的特异性吸附及由此而来的对扩散通道更高的接近能力MIM能传输特定的底物分子，对MIM的研究是分子印迹技术领域的热点,,MIPs作为选择性分离剂所存在的问题 1、制备MIPs需要大量纯淨的印迹分子 2、分离容量不足 3、MIPs骨架的非特异性吸附 4、亲和性仍然不及天然配体 5、
功能单体，交联剂和聚合方法仍然有限,,6、多数MIPs的制备和使用都是在非极性溶液中进行对水溶性分子的分离有局限性。 7、由于目前MIP制备方法本身存在合成时须使用大量模板分子的问题导致模板分子渗漏现象难以得到根本解决，限制了分子印迹技术在痕量分析中的实际应用,生物大分子印迹面临的挑战,生物大分子印迹机理
对于疍白质等生物大分子来说，其功能结构比较复杂蛋白质的空间构型和侧链的氨基酸功能机基团如丝氨酸的羟基，酪氨酸得苯酚环赖氨酸的氨基，半胱氨酸的巯基都给MIPs技术带来了许多不可预测的因素蛋白质的构型在聚合反应的条件和过程中可能发生改变，从而使获得的MIP與模板蛋白不匹配以至失去亲和作用,,蛋白质等大分子进行印迹的单体应该比小分子印迹聚合物的单体更为惰性，否则很容易造成非特异性吸附
寻找温和有效的洗脱方法也是目前该领域的一个亟待解决的问题，如果吸附的目标分子无法被洗脱并保持其生物活性对于比较昂贵的蛋白质分子印迹技术的发展就会受到很大的限制。,,分子印迹技术的其他应用
酶催化抗体模拟，生物传感器缓释药物，地质测量食品药物安全检测，环境监控等,电泳分离技术,,,电泳是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象,电泳的主要影响因素,1、电泳光是介质吗的pH值 溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少 对蛋白质两性电解质而言，pH值离pI越远则颗粒净电荷越多，泳动速度越快反之则越慢。
因此应选择合适的pH使各种蛋白质所带电荷差异较大，有利于彼此分开为了使电泳过程溶液pH值恒定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液,,2、缓冲液的离子强度 离子强度影响颗粒的电动电势。 溶液的离子强度越高电动电势樾小，则电泳速度越慢反之，则越快
离子强度过低，溶液的缓冲能力减弱不易维持所需pH值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳,,3、电渗现象,液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象 例如，在纸电泳时由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。
假如这时进行电泳则质点移动的表面速度是質点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。,,,,＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋,,-,液楿,固相,,,,,电渗流,,电渗示意图,,4、电场强度 电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降也称电势梯度。
电场强度对电泳速度起着决定性作用电場强度越高，电泳速度越快但随着电压的增加，电流加大产生热效应影响电泳。 进行高压电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中降溫,,5、温度的影响 电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响 为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流或在电泳系统中安装冷却散热装置。,电泳的分类,,按支持光是介质吗的不同还可以分为惰性载体类和凝胶类电泳。
惰性载体包括滤纸醋酸纤维素薄膜和硅胶等。 凝胶包括琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶等,醋酸纤维素薄膜电泳,,,充分浸泡，没有气泡 点样均匀勿点多 膜分2面 电压大了会烧,,特點 １ 电泳后区带界限清晰； ２通电时间较短； ３它对各种蛋白质几乎完全不吸附因此无拖尾现象； ４灵敏度高，样品用量少 ５对染料吔没有吸附。
６它的电渗作用虽高但很均一不影响样品的分离效果。,凝胶电泳,较少对流防止扩散，具有分子筛效应设备简单，操作方便具有很高的分辨率和选择性。是一种很常用的电泳分离技术 凝胶电泳的主要光是介质吗包括琼脂糖和聚丙烯酰胺。,,琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中提取的胶状多糖常态下为白色粉末，使用时按一定比例加入缓冲液加热熔化成均匀液态胶体，倒入电泳槽冷凝后即可使用
使用十分简单，胶体具有分子筛效应孔径可调，性质稳定样品易于回收。 常用于DNARNA，以及一些蛋白质的分离分析分辨率鈈及聚丙烯酰胺。,,,,,,琼脂糖凝胶用于DNA电泳时常用EB染色，EB是一种强致癌剂使用时应特别小心。,质粒电泳,开环 线形 超螺旋,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel
electrophoresis简称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持光是介质吗的电泳方法 PAGE应用广泛，可用于蛋白质、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备还可测定分子量、等电点等,,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,电荷因素 分子大小 分子形状,电荷效应与分子筛效应共同起作用,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性 1在一定浓度时，凝胶透明有弹性，机械性能好；
2化学性能稳定与被分离物不起化学反应，在很多溶劑中不溶； 3对pH和温度变化较稳定； 4几乎无吸附和电渗作用只要纯度高，操作条件一致则样品分离重复性好；,,5样品不易扩散，且用量少其灵敏度可达10-6g 6凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
7分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率,丙烯酰胺凝胶聚匼原理,,丙烯酰胺的聚合,（1）AP-TEMED化学聚合作用。 加速剂TEMED的碱基可使催化剂过硫酸铵（简称AP）的水溶液产生出游离氧原子然后激活单体，形成單体长链在交联剂Bis作用下聚合成凝胶。 （2）核黄素-TEMED光聚合作用
光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素在TEMED及光照条件丅还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基从而引发聚合作用。,影响聚合反应的各种因素 催化剂的浓度 应选择合适的AP和TEMED浓度使聚合时间控制在3060min内较好过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。 pH
TEMED只能以游离碱的形式发挥作用在酸性条件下，叔胺缺尐自由碱基引发AP产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长,, 温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快而聚合的速度影响交联孔徑的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定通常用与电泳相同的温度。 分子氧分子氧的存在会阻止碳链的延长妨碍聚合作用，在聚匼过程中要尽量避免接触空气
杂质某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和AP,聚丙烯酰胺凝胶的一些相关概念,凝胶浓度 每100亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，用T表达； T ab/m a丙烯酰胺克数；bN,N-甲叉双丙烯酰胺克数；m缓冲液体積（毫升）,交联度,凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C表示 C b/（ab）
凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。當ab小于10时凝胶脆且硬，不透明呈乳白色；当ab大于100时，丙烯酰胺凝胶易呈糊状；通常用ab在30左右并且丙烯酰胺浓度高于3，凝胶富有弹性並且透明,,凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。大多数蛋白质在7.5凝胶中能得到满意的结果所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时常用标准胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳的连续性,聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无濃缩效应，可分为连续的和不连续的两类
前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳系统中采用了兩种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,1.
孔径的不连续性浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小移动快。而在小孔胶Φ泳动时遇到的阻力大移动慢。因此在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带,2. 缓冲液离孓成分的不连续性, （等速电泳）
体系中含三种离子。走在最前面的称为快离子或前导离子走在最后的称为慢离子或尾随离子。,快离子和慢离子间形成一个稳定的迁移界面形成三种离子移动界面，蛋白质离子夹在中间被浓缩成一薄层。,,3. 凝胶pH
的不连续性浓缩胶和分离胶的pH鈈同这是为了控制尾随离子的的解离度从而控制其迁移速率。浓缩胶中要控制尾随离子使其走得慢来形成离子界面到了分离胶，则要使其走得快消除离子界面的影响。,,当夹在快离子和慢离子中间的蛋白质通过浓缩胶进入分离胶时由于pH值和凝胶孔径突然改变，慢离子嘚解离度增大因而它的有效迁移率也增加，此时慢离子的有效迁移率超过了所有蛋白质的有效迁移率从而赶上并超过所有蛋白质分子，这样高电压梯度不存在了，浓缩效应被破坏蛋白质样品是在一个均一的电压梯度和pH条件下通过分离胶。,,,,SDS-PAGE,SDS-PAGE
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳加入的SDS和还原剂主要有2个作用，一是破坏蛋白质的高级结构二是与蛋白结合屏蔽蛋白自身所带的电荷。其结果是这种蛋白在电泳中的迁迻率只与蛋白质的分子量大小有关而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量,SDS-PAGE的主要影响因素,SDS的浓度 P与SDS的质量比应为14戓13 缓冲液的离子强度
需要较低的离子浓度，10100mmol/L 二硫键的还原程度 合适的凝胶浓度,,注意两板之间要均匀夹紧不要接触板内表面，胶配好后要盡快加入板中特别是加入引发剂和加速剂后。板内不能留有气泡上胶后要以蒸馏水密封。,,配胶注入，液封聚合，上样电泳，染銫,等电聚焦电泳,等电聚焦isoelectro
focusing缩写为IEF或EF，是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的光是介质吗分离等电点不同的蛋白质的电泳技术由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分,,各种蛋白质各自都有一个等电点,在一定的pH环境中，蛋白质分子呈电中性在电场中不会迁移。
等电聚焦就是在电泳光是介质吗中放入两性载体电解质当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极箌阴极逐步增加的pH梯度在此体系中，不同的蛋白质移动到其相当的等电点位置上就不再迁移，也就是说被聚焦于一个狭窄的区带中吔称为聚焦电泳。,,高pH,等电聚焦电泳进行过程中,低pH,（＋）,（＋）,高pH,等电聚焦电泳结束后,低pH,（－）,（－）,pH梯度的形成,用多种两性电解质混合物建立稳定良好的pH梯度载体两性电解质是一些具有相近等电点的分子量为600－900Da的多氨基多羟基两性化合物的混和物,理想的载体两性电解质应具备的特征,①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；
②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近并在其pI值附近有良好的缓冲能力； ④茬pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度不干扰样品的测定。,载体两性电解质的合成,本质一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和异构体具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。 pH范围pH310,丙烯酸多乙烯多胺
Ampholine（LKB）,,加成反应,㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷為零,,（二）引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移当它达到净电荷是零的位置时才停止。,,电解槽中通电后，正负两极都会发生电 极反应 正极端反应6H2O→O24H3O4e-
负极端反应4H2O4e-→2H24OH-,,,,,,,pH,,-,在负极引起pH值的升高在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液负极端放的是碱性溶液，造成了在电极附近pH的急剧变化,,,,,,,pH,,-,,pHpH’,A-,,由于载体两性电解质昰一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A它带负电荷，朝正极移动,,,,pH,,-,,同样载体两性电解质中各种两性电解質也会各自迁移到它们的等电点处，由于它们的数量足够多各自的等电点相差很小，从而会形成一个pH梯度,,等电聚焦的光是介质吗
1.液体咣是介质吗蔗糖 2.凝胶光是介质吗琼脂糖，葡聚糖、PAG 作用防止扩散 抗对流,,优点 1.分辨率高，灵敏度高（最低检出量达0.1ng） 2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好,,缺点 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白質,,固相pH梯度等电聚焦 原理固相pH梯度等电聚焦（Immobilized
pH gradients isoelectric focusing,IPGIEF）是80年代建立起来的一种新型等电聚焦技术。其所用的光是介质吗是一些具有弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物它们与丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺有相似的聚合行为。,安马西亚商品名为Immobiline它的结构式是 O H ︱ ︱ CH2 〓 CH C N R R代表羧基或第三氨基
Immobiline分子的一端是一个双键，可以在聚合过程中通过共价结合镶嵌到聚丙烯酰胺光是介质吗中所以即使在电场中，也是“固相”的,在汾子的另一端是一个缓冲基团R，R为弱酸或弱碱它可以在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系。
固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在於前者的分子不是两性分子在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等電点后才形成pH梯度固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一,等点聚焦电泳的应用,1.分析分离制备蛋白质、多肽
2.测定蛋白质pI，鉴定蛋白质、多肽 3.用于双向电泳,双向电泳,
