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实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质
实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】 1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理； 2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。 【实验原理】 在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯 酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白 质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称 ACR）和交联 剂 N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称 BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的 三维网状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子 量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： （1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵， 加速剂为 N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称 TEMED） 。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在 1 小时内 完成。 （2 ） 光聚合： 通常用核黄素为催化剂， 通过控制光照时间、 强度控制聚合时间， 也可加入 TEMED 加速反应。 聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶 （浓缩胶和分离胶）电泳。 一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） ； ②凝 胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致） 。③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中 聚丙烯酰胺的浓度及 pH 的不同，即不连续性所致） 。因此，样品分离效果好，分辨率高。 SDS 即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称 SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例 和蛋白质结合，形成一种 SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原 来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。与此同时，蛋白质在 SDS 作用下结构 变得松散，形状趋于一致，所以各种 SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决 于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂 （巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫 键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率 和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X 为迁移率，k、b 均 为常数。 本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，以分离和鉴定大肠 杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白产物。 【试剂与器材】 （一）试剂（(全班分两大组，每组配一份，如 1－5 组一份，6－10 组一份) （1）30% 的凝胶贮备液：ACR 30g + Bis 0.8g 溶于 100 mL 去离子水中，用 3 号新华滤纸过滤至棕 色瓶中，4℃ 避光贮存（1） 。 （2）3mol/L Tris-buffer,pH8.9： Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddH?O 至 100 mL） （3）0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 6.05g Tris base 溶于 40mL ddH?O 中，加 1mol/L HCl 48mL, 加水补至 100mL. （4）5×Tris-甘氨酸电泳 buffer（pH8.3):（配 1L） Tris-base 15.1g + 甘氨酸 94g + 5g SDS + H2O 至 1L（用时稀释 5 倍） 。 （5）10% SDS:：称 10 克 SDS 溶解于 100mL 去离子水中，贮存于室温中。 （6）TEMED（四甲基乙二胺） ：浓度 10%，20 mL (全班共用)，4℃保存。 （7）10% AP（过硫酸铵） ：10 mL，新鲜配制，分装至 1.5mL 离心管中，－20℃保 存待用（2） 。（8）样品溶解液：内含 1% SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或 20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL 缓冲液。 * 先配制 0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液： 称 Tris 0.6g ， 加入 50 ml 重蒸水， 再加入约 3 ml 1mol/L HCL,调 pH 至 8.0，最后用重蒸水定容至 100 ml *按下表配制样品溶解液：*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。 *或配制 2 X SDS 样品缓冲液： 100mmol/L Tris-HCl (pH6.8) 200mmol/L DTT 4% SDS 0.2% 溴酚蓝 20% 甘油 必要时加入少量（1%）巯基乙醇。 （9）考马斯亮蓝染色液(3)：0.05 g 考马斯亮蓝 R250 溶于 25 mL 异丙醇里，加 11 mL 冰醋酸+H2O 至 110 mL，用滤纸过滤除去不溶物。 （10）0.1%溴酚蓝指示剂（全班共用） （11）脱色液：75 mL 冰乙酸 + 50 mL 甲醇 + 875 mL H2O（若只配 500 mL，各物质减半） （二）器材 ① 电泳仪 ② 垂直板电泳槽，电泳板 ③微量进样器（50μ L） ④染色/脱色摇床。 【操作方法】 1.胶板模型的安装： 在干净的凹形玻璃板的三条边上放好塑料条 （有些型号的电泳板已有固定的隔板） ， 然后将另一块玻璃板压上，用夹子夹紧（或装在制板模型中） ，在两块板之间滴上热融的 10 ％琼脂 糖凝胶封边（4） 。 2.分离胶的制备[10 ml，可供两块板( 11cm x10 cm)使用]用手轻摇混匀, 小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间（～2.5cm）,轻轻在顶层加入几毫升去离子水覆盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。 刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置 片刻使聚合完全，整个过程约需 30 分钟（25℃室温） 。 3.浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的水吸去，再用滤纸吸干残留的水液。 方制备各种体积的浓缩胶溶液： 按下列配混合后将其注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡的出现。 4.在浓缩胶聚合的同时，将蛋白样品与 2x 样品缓冲液等体积混合，置沸水或微量恒温器（100℃）中 加热 3 分钟，马上插入冰上冷却待用。 5.浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入 1X 电泳缓冲液，小心地拔出 梳子，用移液器冲洗梳孔，检查有无漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。 6.按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋白浓度 而定，一孔加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白作对照。 本实验系统中需要分离鉴定的是纯化的 GFP 蛋白，点样样品和次序包括： 蛋白 Marker pUC18 细菌总蛋白 pGFP 未诱导总蛋白 pGFP 加 Glu 及 IPTG 诱导总蛋白 pGFP 加 IPTG 诱导破菌后上清总蛋白 层析时的穿流峰（杂蛋白） 层析时的洗涤峰 I 层析时的洗涤峰 II GFP 对照 7.电泳：开始时电压为 5～8V/cm（约 100V）凝胶，待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后，将电压 增到 10～12V/cm（约 180V）凝胶，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源。 8.剥胶：取下胶板，从底部一侧轻轻撬开玻璃板，用手术刀切去浓缩胶，并切去一小角作记号。9.固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液染色并固定，最好放在摇床缓慢旋转 1-2 小时。 10.脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换脱色液 3-4 次，约 4-8 小时或过夜。 11.将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥，也可无限期地用塑料袋封闭在含 20%甘油的水中。 【注意事项与提示】 （1)丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套。两者聚合后即无毒性，但为避 免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上手套操作。另外，配好的溶液 之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。 （2）过硫酸铵极易吸潮失效，因此要密闭干燥低温保存。配好的 10％过硫酸铵要分装冷藏。 （3）考马斯亮蓝 R-250(三苯基甲烷）染色: 每分子含有两个 SO3H 基团，偏酸性，结合在蛋白质的 碱性基团上。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色。检测灵敏度约为 0.2－0.5ug。也可用银染色：将 蛋白带上的硝酸银还原成金属银、以使银颗粒沉积在蛋白带上。此法比考马斯亮蓝灵敏两个数量级， 但步骤较复杂。 （4）制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有 空隙， 所以这步要特别留心操作。 有些型号的电泳板可在模型中直接安装， 免去了封边和拆边的麻烦， 还可以同时制备多块凝胶。 （5）AP 和 TEMED 是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快， 影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。 （6）加热使蛋白质充分变性。 （7）用移液器冲洗梳孔可将空中的凝胶除去，以免点样孔不平齐或影响蛋白样品的沉降。 （8）两玻璃板间凝胶底部的大气泡可阻断电流，因此必须除去。 （9）总量一般不超过 20μ l，如果点样量太多溢出梳孔，就会污染旁边泳道。要根据样品浓度来加样 品溶解液。每点一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。 （10）电泳时间要依据所用电压及待测蛋白分子量大小而定。 （11）电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致，不能在凹形板双耳处撬，也不能用死力弄坏玻璃板。 （12）考马斯亮蓝染色液盖过凝胶即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次。 （13）脱色过夜可使背景更干净，谱带更清晰。 【实验安排】 本实验试剂配制和电泳可在一天内完成， 各小组要在上午配好试剂并做好胶，中午或下午即可开始电 泳。 【实验报告要求与思考题】 1．就实验中出现的各种问题进行分析讨论。 2．在不连续体系 SDS-PAGE 中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 3．在不连续体系 SDS-PAGE 中,分离胶与浓缩胶中均含有 TEMED 和 AP,试述其作用。 4．根据下式计算标准蛋白和待测样品的电泳迁移率，然后以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，其分 子量的对数为纵坐标作标准曲线图， 根据标准曲线图准确计算待测蛋白的分子量。粗略估计待测蛋白 分子量的方法是直接根据凝胶上的分子量标准进行估算。 5．为什么样品电泳前要高温加热？ 6．进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？
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PCR扩增产物的电泳分析
凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.
(一)凝胶浓度:凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.
琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度(%)
线型DNA分子的分离范围(Kb)
(二)电泳缓冲液
核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.
10XTBE缓冲液的配制
Tris硷，108克
EDTA，9.3克
硼酸，55克
H2O至，1000ul
(其PH应为8.0～8.2)
临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释.
(三)核酸电泳的指示剂与染色剂
1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.
染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色.
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般&5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.
银染色:银染色液中的银离子(Ag )可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.
1.电泳装置:
电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.
2.电泳方法:
(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.
(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段，可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.
3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.
4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有气泡，应设法除去.
5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内.
6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).
7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的PCR产物50V电压，电泳20～40min即可.
(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小.
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.
聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表2.
丙烯酰胺(%)
有效分离范围(bp)
*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).
1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.
2.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.
3.10%过硫酸铵过硫酰铵，1克加水至，10ml
4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.
4.1XTBE电泳缓冲液
5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)
(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳:
根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.
1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.
2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.
3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.
4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止.
5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10&角，可减少液体泄漏的机会.
6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE缓冲液.
7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.
8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡.
9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.
10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.
11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.
12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出&10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染.
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聚丙烯酰胺凝胶电泳时间比平时时间长很多怎么回事，各位大神帮帮我！
我是做AFLP的，聚丙烯酰胺凝胶电泳用的是6%的，ED是新买的，10%APS是重新配置的，用的是10×TBE，前几天跑胶还比较正常都是2.5h就跑完了，自从配了新的胶母液，所有的试剂换成新的以后，跑胶时间都要很久，昨天跑了四个多小时还没跑到一半，今天的也是跑的很慢，不知道是什么原因，之前都是这样跑的没什么问题，这次不知道怎么回事了，有知道的亲们指点我一下啊，好着急，这是我的毕业论文的试验，现在研三，捉急啊！谢谢大家啦
咋跑那久??
一直都是过夜啊，可能是因为电压低把，
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