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（1）提细胞蛋白① 消化或刮下细胞至 1.5 的 EP 管中，标记，10000r 离心 2 min，PBS 洗 2-3 遍。② 尽量吸去 EP 管中 PBS，加适量 RIPA 裂解液（RIPA 裂解液+蛋白酶、磷酸酶、PMSF 三联装）。③ 冰上裂解 30 min~1 h，开 4°离心机。④ 4°离心 11000r，20 min。⑤ 取上清，测蛋白浓度，加蛋白上清的四分之一体积 5x 上样 loading buffer，煮沸（95℃ 加热 5 min），分装。&（2）提组织蛋白&① 研钵中倒入液氮，加入组织块，研磨，加液氮，药匙刮。② 刮下后放入 1.5 ml 的 EP 管，加适量裂解液，吹打。③ 冰上放置 1 h，期间，每隔 10~15 min 吹打一次或者用震荡仪震荡 2 min。④ 4°离心 11000r，20 min。⑤ 取上清，测蛋白浓度，加 1/4 体积 5x loading buffer，煮沸（95℃ 加热 5 min），分装。&（3）测蛋白浓度（BCA 法）&① 八个标准孔，按说明书先加 PBS，再加标准蛋白液② 目的孔，每孔加 18ulPBS+2ul 目的蛋白③ 按说明书配 BCA 工作液，每孔加 200ul④ 37°放置半小时后测浓度&（4）计算上样量，设计上样顺序&上样体积：上样量/浓度 x 5/4上样顺序：无处理，对照，处理；体积最好不要相差太大&经验总结：&如何提高蛋白浓度：首先当然是多培养点细胞，多提供点组织啦，其次可以少加点裂解液，裂解时间长点，尽量裂解充分。如何处理蛋白浓度低的问题：实验过程中发现蛋白的浓度太低，如果上样的话，体积太大，甚至电泳孔都装不下，举例：假设我需要上样 40ul 才能达到 20ug，那么显然按照常规的方法，10 孔的梳子只能加 25ul 左右，我们此时可以取 40ul 蛋白入 EP 管中，放置于 PCR 仪器，变性温度浓缩蛋白体积，这样不断浓缩之后促使 EP 管中蛋白的水分降低，蛋白量依旧是 20ug。如何保证对照组和实验组蛋白浓度大概是一致的：种植细胞的时候计数、铺板，使铺下去的细胞数接近。&二、电泳&1、 清洗玻璃板，去离子水冲，风干或烤干。这步清洗很重要。2、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒配胶。先配下胶（分离胶），一般两块板配 10 ml 的 10% 的胶（20~80kDa 通用），混匀后灌胶，立即用正丁醇或水封，待凝固后倒出正丁醇或者水，用滤纸吸干；3、 配上胶（积层胶），一般两块板配 4 ml 的 5% 的胶，混匀后灌胶，插板, 待凝固。4、将玻璃板装好放入电泳槽中，加电泳液，轻轻拔梳。这步要注意必须要两块板一起。5、上样6、 连接电源，一定要注意红对红，黑对黑，定电压和时间，上胶（90v，约 40 min，maker 分出条带），换压，下胶（120v，2 h）。（不要让溴酚蓝跑出去）&经验总结：&胶的浓度根据你所需要跑的蛋白的分子量大小决定，想要条带跑的好看点，最好把上胶稍微配高一点。APS 最好现配先用，配制好后放 4 度避光保存，最多保存一周。胶最好现配现用，如果需要保存最好用湿润的保鲜膜包好TEMED 可以催化过硫酸铵产生自由基，所以要注意是否过期失效，主要避光保存。&三、转膜（整个 WB 过程中最重要的环节）&① & &跑到溴酚蓝距离靠近最下缘时，要提前准备半干法转膜液。② & &在电转液中剥胶，裁胶，剪膜，膜活化。③ 「三明治」黑板~海绵~三层滤纸~胶~膜（正面朝下，分清左右，与胶对应）~3 层滤纸~海绵~白板，夹紧后放入电转槽中。（海绵，滤纸，膜需浸润透，过程中不能干，赶走气泡）。④ 连接电源，一定要注意红对红，黑对黑，定电流和时间。&经验总结：&溴酚蓝跑到最终的距离是根据你所需要切的分子量决定的。滤纸和 PVDF 膜的裁剪必须要整齐，干净，标记清晰。PVDF 膜型号的选择要正确。如正常的 30~170kDa 的分子一般需要孔径 0.45 mm 的膜就足够了。太小的则需要选择孔径为 0.22 mm 的膜。关于转膜是否要加 SDS 的问题。SDS 带负电，加 SDS 一般是针对那些分子大的 WB，加入 SDS 可以增加分子导电性，这样更利于转膜。关于转膜电流，分子是否能够转过去和转膜时间没有必要关系，而更在于转膜电流的大小。举个例子，200kDa 的分子量，你用 90mAh 就算转一年都转不过去。&四、免疫印迹&① 膜处理（甲醇 1 min，风干（放滤纸上），甲醇 1 min，水 1 min）。② 封闭（Western 封闭液）1 h 配摇床。③ 加一抗，牛奶稀释所需浓度参考抗体说明书，根据膜的大小稀释一抗，4°过夜。④ 室温孵育 20 min。⑤ 0.1%TBST 洗 10 min x 3 次配摇床（0.1%TBST：tris12.1 g，NaCl87.66 g，HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后，加入 1 ml 的 TWEEN20）。⑥ 加二抗，牛奶稀释（根据说明书上进行稀释），1 h 配摇床⑦ 0.1%TBST 洗 10 min x 3 次配摇床。⑧ 发光（显影定影试剂盒）（A 液 B 液等体积混合，孵膜 1 min，正面朝上放入仪器内发光）。&经验总结：&封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用 BSA，而且封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况 5%BSA 的效果会比 5% 牛奶要好。&信号通路一般都是用 5%BSA 封闭。且洗膜的时候用快速摇床 5 min/次 3 次就可以了。&如果你想省时间，一抗可以放在 37℃1~2 hour，但是一定要封好，以免温度太高而导致抗体干了出现假阳性。二抗可以 37℃ 半个小时。&发光液的选取，如果是一般的抗体，建议用一般的发光液效果会好一点，背景会比较干净。但是一些难发出来的一般建议用 ECL 超敏化学发光试剂盒。&Western Blot 做顺的时候很简单，要不顺的时候会被它折磨死。所以内参的选择显的尤为重要。接下来讲讲怎么做好对照组实验，即怎么选择内参。&1. 内参的重要性：&内参即是内部参照 (Internal Control)，内参一般是指由管家基因编码表达的蛋白 (Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对比较恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。&在 Western Blot 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性与严谨性。&2. 如何选择合适的细胞核内参抗体？&常用的总蛋白内参即 GAPDH 和细胞骨架蛋白β-Actin 或β-Tubulin 等；对于一些植物的样本，则需要特别的植物 Actin 蛋白作为内参；当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用：核纤层蛋白 B 即 Lamin B 为核内参抗体。另外，小伙伴们还需要根据目的蛋白的大小选择合适的核内参，推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差 5KD 以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。&3．目的蛋白表达部位：&就一般的蛋白检测来说，Actin、β-actin、β-Tubulin 抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有 Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为 Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用 VDAC1 和 COX IV 作为内参抗体。&以上几条原则只是针对通常情况，但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的实验环境，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致 GAPDH 的表达增高，不适合做内参。比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun 由于自身表达变化就不适合做内参; 而在凋亡实验时，TBP、Lamin 等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。中洪博元生物技术有限公司协助广大医务人员实验设计评估整体课题外包，其中包括细胞学技术，蛋白学技术、基因学技术、组织学技术、病毒学、微生物服务动物实验等。网址： &&手机： &qq:
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blogTitle:'医学实验外包-Western blot 实验过程与经验分享',
blogAbstract:'一、蛋白样品的制备与定量（提取好的蛋白是成功的一半）（1）提细胞蛋白① 消化或刮下细胞至 1.5 的 EP 管中，标记，10000r 离心 2 min，PBS 洗 2-3 遍。② 尽量吸去 EP 管中 PBS，加适量 RIPA 裂解液（RIPA 裂解液+蛋白酶、磷酸酶、PMSF 三联装）。③ 冰上裂解 30 min~1 h，开 4°离心机。④ 4°离心 11000r，20 min。⑤ 取上清，测蛋白浓度，加蛋白上清的四分之一体积 5x 上样 loading buffer，煮沸（95℃ 加热 5 min），分装。',
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{list wl as x}{/list}指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经；3.对于特别小的蛋白，tricineSDS-PA；4.转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，；5.膜漂在水面（或者甲醇液面）让液体从下通过膜上；6.电转移缓冲液通常用Trisglycine系统；7.半干电转移（Semi-Dry）用经过缓冲液饱；8.有人觉得转膜加SDS有助于大分子蛋白转膜，我；9.如果只
指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留意分清胶上下方向，切个小角是常用的方法。膜和滤纸一起裁最好（不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀+尺子+垫厚报纸划比较容易）尽量和胶一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm，保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。
对于特别小的蛋白，tricine SDS-PAGE电泳有助于提高蛋白大小在1KD―20KD间的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的浓度也不用太高（可参考2004年中国生物工程杂志上有一篇文章（有效分离1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方法）
转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。
膜漂在水面（或者甲醇液面）让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气，膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的。最后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理PVDF不要超过15秒。以后的步骤中不要让膜干涸了。
电转移缓冲液通常用Tris glycine系统，如果是转膜后有部分样品要蛋白测序，最好用CAPS缓冲液，减少甘氨酸对测序的污染。
半干电转移（Semi-Dry）用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽，非常节约试剂，而且效果也好。由于不用“泡”在缓冲液中，半干转不单可用均一缓冲体系，也可以做非均一转移缓冲体系。半干转可以在30分钟内完成转膜（每平方厘米电流2.5―3.5mA，恒流，冷库。如果电流要求小可以延长到60―90分钟，但要防止过热。如果有那种温度贴，可以贴上参考温度），即使205KD这么大的蛋白转膜效率也高达80%。各种大小的蛋白的转移效率都OK。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转（面积还是按照单个计算），只要控制好单位面积的电流强度，防止过热就好了。
有人觉得转膜加SDS有助于大分子蛋白转膜，我个人持保留意见，因为SDS等去垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合，反而不好。
如果只做Western Blot，膜可以用丽春红S染色并在脱色前照相，对后面的免疫反应影响不大。不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染Marker需要用针或者笔扎眼记录条带位置，以免后面会洗掉而无法判断结果。预染Marker也有助于判断转膜的效率和情况，如果比目标分子大的Marker都已经转过去了，那就OK了。
有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序，如果要蛋白测序需要提前一天倒胶，并说预电泳6小时（有还原剂如Glycolate）后再倒积层胶。除了要做HPLC分析应该用丽春红S而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色，其他的比如测序或者PTH都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。
转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带，有时这种快速的方法可以不用染色识别条带，避免染色膜影响后继实验。
转膜后的封闭注意：
转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方，用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素―亲和素的检测方法，脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活（可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好）。经济的脱脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也更宽，现在HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记：封闭时间和封闭剂的量都要足够。
如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS干扰AP。
这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）
胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS），封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
两胶板之间的电泳液要满. 接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为100V. 观察MARKER的情况, 适时终止电泳.
建议说目的带要跑到分离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以.如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线.
注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子**浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜**以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头**加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.
10* 电泳缓冲液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.
不好溶,可用搅拌器.
可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦.
跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.
另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇30分钟左右（有次着急只晃了10分钟，结果也挺好的）。NC膜，0.22um ，效果挺好的，MARKER易染上，丽春红也易着色，还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。
不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是BIO-RAD 的半干转（电压不过25V的那款），电源是BIO-RAD的PC200，70KD的我转50分钟，20V，17KD的转20V，30分钟左右，条件不是很稳定，有时半路打开盖子看看MARKER转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流，说1.2-2MA/CM2我看了一下，我的胶大约都是5*3左右大的，20V一般电流会是60-30MA之间，要是这样算的话,最高就30MA, 我不太清楚.
跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶
粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。
2 本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜，不要漏掉任何一个小角落哟。
3 洗膜的时候，最好将膜放在平皿中，置于水平的试验桌面上，不时用手晃动一下平皿，这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。因为在脱色摇床上晃动，有时洗涤液不足以完全没过膜，在最后显色的时候，会发现液体流过的一道道痕迹，使背景值增加。
4 其实在western blot中，以上操作都是小问题，最主要的是一抗的质量和待检测蛋白的提取质量。在试验之前，最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检测（如ELISA），看看其效价和质量，以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和加量。另外，在做杂交之前最好也先跑一块PAGE胶，染色，检测一下待检蛋白的提取质量。
5 在加一抗温育之前，最好先将等量的一抗与野生型（即阴性对照）的蛋白在37摄氏度作用30分钟，这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。
6 一定不要忘记做阴性对照和阳性对照，特别是阴性对照，不然结果出了什么问题，就无从分析了。
7 全程做下来，最后的显色就像是个一锤定音的时刻，分外激动，但也应该尤为专注，一旦目的条带出现了，就要马上对显色进行终止，要不然杂带就要出来了。
“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。
另一个感觉是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。
Western Blot为什么必须要用内参？
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦DD做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦??毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果DD即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、
等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。
常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。：GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。GAPDH检测。Western Blotting(检测条带大约在36kDa，稀释比例达10，000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。注：因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样品与样品之间的比较。反应：抗GAPDH单抗（clone 6C5）能够与鱼、蛙、鸡、兔、小鼠、大鼠及人组织来源的GAPDH反应，但不能与酵母GAPDH反应。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。
图示: A-G分别表示不同实验小鼠心脏蛋白（上样量50ug），兔抗小鼠Akt抗体（康成生物Cat＃KC-5A01）检测心脏组织匀浆中Akt水平。加入兔二抗（康成生物Cat＃KC-RB-035，稀释比例为1：5，000）时同时加入HRP标记的抗GAPDH单抗（稀释比例为1：10，000，康成生物Cat＃KC-5G5）。采用化学发光试剂盒（康成生物Cat＃KC-420）及X胶片曝光显影。一次反应即可同时检测目的蛋白（Akt）与内参GAPDH的含量。
actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量&20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了），但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。
actin几种异构体存在组织分布特异性，不同型actin之间具有较高的序列相似性(&90%)。β-actin是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白，选择作β-actin内参时首先得保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）。那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin
其它异构体一致的氨基酸序列。公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原，可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除非肌细胞外,还可以检测cardiac，skeletal，smooth muscle细胞的actin
Western Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP――碱性磷酸酶。做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多――分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照。如今由于HRP系的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。
附：在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
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