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【求助】多重荧光定量PCR体系优化（已经更新到2月27号，请huixu答疑）
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这个帖子发布于9年零201天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我准备做两重taqman荧光定量PCR,将两对引物放在一起走了荧光定量曲线,用sybr看引物在一起是否能产生特异性的产物.荧光定量PCR后跑电泳检测,现在发现有问题了,大家可以看荧光定量PCR扩增图中绿色的溶解曲线,一个在Tm为80左右的小峰对应的是电泳图上稍大一些的目的产物,而在Tm为86左右的的大峰对应的是电泳图上稍小一些的目的产物,我的问题是,为什么电泳图上亮度差不多,在荧光图上峰却差别那么大呢?不是说峰面积代表了产物量吗?原因会不会是EB和sybr greenI插入DNA的方式不一样,请大家讨论阿.谢谢了.
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dujiaoshou edited on
个人的一点看法,供参考.我认为融解曲线的峰面积并非表征产物的量.先从数学上进行理解,融解曲线是荧光信号对温度的一阶负导数,所以融解曲线的纵轴高度表征的是原始荧光信号的变化率,Tm值对应的融解曲线的峰高表征了目标产物的纯度,生物学含义表征的是表达丰度.打个比方,两个复孔得到同样的Tm值,但融解曲线的高度不同,表征的是在两个复孔中目标产物所占的比例融解曲线峰高的比例高,所以在Tm值位置上变化率最大.从你上面的融解曲线图上,只能说86度左右的产物纯度较高,而80度以下的产物(疑似引物二聚体)纯度较低(里面可能包括很多几个碱基错配的产物,且所占比例相当),所以电泳图产物较亮,而融解曲线峰值不高.不知解释清楚没有,说起来还是挺复杂的.
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谢谢huixu。1：我感觉峰高就象您说的是代表目标产物的纯度。2：峰面积的话我觉得还是应该代表在该峰在Tm范围内的荧光量，也就是我需要的目的产物的荧光量，这个可以通过积分来算。 3：接着2，也可以象您这样的解释，我目标产物较大的片段在电泳图中显示的条带中有其他的带，从而导致在溶解曲线中表现出来峰小，而且矮。4：我上次看到过一篇关于讲荧光染料的文章，上面说sybr greenI 对CG碱基比较偏爱，这也正好比较符合我的电泳图和real time PCR溶解曲线的峰。因为我较小片段的CG含量丰富，而较片段CG含量较低，这也在一定程度上说明峰的面积还是表示在该Tm范围内荧光量的，请见下文。而EB有没偏爱就不是很清楚了。Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperatureNucleic Acids Research, Haukur Gudnason1, Martin Dufva1, D.D. Bang2 and Anders Wolff1,*
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今天把荧光定量PCR做了pure dye的校正，终于做上FAM和HEX的双重荧光定量，但是问题马上随之而来了。下面是我做的荧光定量图，两条探针分别用FAM和HEX标记。下面3个图依次是：两个目的基因同时扩增（FAM+HEX），一个基因单独扩增（FAM），另一个基因单独扩增（HEX）。这三个反应都重复2次，图1中也就是有8条曲线（FAM 4条，HEX 4条）。模板用量均为转化后提纯的质粒100000copies/ul 加1ul。从图上可以FAM这个基因扩增量明显比HEX更好。我的问题是：1：我看到这几个probe反应，一开始荧光量都很高，一般都在之间，比我以前做过的sybr green I荧光值高多了。2：我两个质粒的用量都是100000个copies左右，得到的CT值在21-23左右，是否可行了？并且我觉得CT值在双重PCR中比单独做还小，这个可能和域值有关系，但是我到时应该怎么选择才好阿？3：这两个探针的效果怎么样？我没什么经验，只是感觉FAM这个比较好，而HEX这个不是很好，是这样吗？这样的效果能用到双重定量吗？4：感觉曲线好象还是S型，应该怎么优化呢，退火温度吗？我用的是两步法，62度1min。5：两个染料在一起做的时候感觉HEX这个扩增曲线不行（见图1），图一中比较高的四条曲线是FAM的，而趴在那里的是HEX。但是单独拿出来分析的时候又觉得不错（见图3），两者的区别只是纵坐标发生了变化。这个又该怎么分析处理呢？问题好多，谢谢谢谢了。很多naive的问题高手们见笑了。
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dujiaoshou edited on
试着回答一下：1.我做实验的时候也发现是这样，可能与发光机理相关。SYBR Green染料法只有双链存在的情况下发光比较强烈，而探针虽然说在水解后5‘端发出强光，但其实在反应初期3’端也会发光，背景比较高；2.从图上来看，重复样本的重合性也较好，个人认为可以使用。就Ct值来说，的确如你所说，单独做的时候Ct值还比较靠前，这可能与阈值的位置选择有关，双荧光要兼顾两种荧光。不知你使用的定量PCR仪是否有最大二阶导数法的Ct值分析法，采用这种方法不受阈值的限制，可以应用于双荧光分析。如果没有这种分析方法，可以再看看背景基线调整的算法是否有比例法（常用的为算术法），一般做双荧光或多荧光时最好使用比例法的基线调整法，会平衡不同荧光间的差异，然后再调整阈值线，得到Ct值就比较接近单光了；3.其实不同的荧光标记探针，受染料本身的消光系数、量子产率，以及荧光的光谱和所用仪器的激发光（决定于激发光源是光谱还是单色，及不同谱带上的强度等）、检测器件（不同的检测器件对不同谱带的接受情况不同）的影响，即便是使用同一摩尔浓度的探针，平台期的高度也会不同，这是正常的。如上一条所说，可以用比例法调整基线后进一步分析。如果想了解扩增产物终产量的情况，还是跑个电泳看看更直观；4.个人认为不需要优化条件了，重复样本的重合性较好（除了HEX有一条差异较大除外）；5.参见1及3的建议。
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大家好，我最近一直在做多重荧光定量PCR，想做标准曲线，即同管跑两组标准品，从copies/ul，25ul体系里各加1ul。但是结果总不是很好，请帮我分析分析原因，FAM的相关系数很好为0.998，但是扩增效率很低，只有81.8%，而且10copies的浓度中3个重复只有2个有CT值，HEX就更加奇怪，由于10copies的其中一个重复不知什么原因CT下降很多，致使标准曲线很难看。我的问题是：1：从下图看应该从哪些方面进行优化？FAM的扩增效率为81.8%，如果发文章的话有没影响？2：HEX的那个点是否可以去掉，我想如果去掉的话应该实验结果不错了。3：发文章的话，这些扩增图和标准曲线放在文章中，是直接运用原始图的还是在特定的软件中弄好后再放中文章中的？
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继续上面的图，来张HEX的，是和上面的同管。
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下面这张是两条标准曲线在一起的。
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下面是对应的FAM扩增曲线
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下面是对应的HEX扩增曲线
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你的实验目的是什么，是要做绝对定量吗？如果做绝对定量需要做标准曲线，一般标准曲线有四个浓度就可以了，而且尽量不要选择低拷贝的（低拷贝重复性不好，会影响标准曲线的准确性），最好选择Ct值在15~30之间的。从你的实验结果来看，其实已经不错了，可以去掉10拷贝/ul的那个浓度。FAM的扩增效率低，主要是受10拷贝/ul浓度的Ct值的影响，像上面说的，如果你还想要用5个浓度做标准曲线，建议你可以提高一个量级去做。标准曲线给出的扩增效率是用标准曲线的斜率计算的，其实不能表征样品实际的扩增效率，不过用来计算实际扩增效率相近的未知样品的浓度是足够的。HEX的曲线也不错，无Ct值的那管可能出现了什么问题，应该是实验的问题，不好分析了。FAM的10拷贝浓度1个Ct值没有计算出是因为扩增曲线与阈值线没有交点，HEX的10拷贝1个Ct值较小是因为起峰太早了（查查实验的问题）。至于文章中怎么用，很多文献上说扩增效率在80%~120%之间都是正常的，其实你实验时可以每个浓度做4个或5个重复，分析时去掉重复性不好的点，数据就比较漂亮了。
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谢谢huixu了，我的实验目的就是要绝对定量的，建议给huixu加分阿。
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标准曲线，觉得可以不用十倍的梯度稀释，2倍5倍的都好，最低浓度的样本也能兼顾。
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您的HEX探针合成的有问题，荧光效率太低，可以找我们重新合成
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【求助】帮我看看荧光sybr的扩增,溶解曲线如何,谢谢了。(建议斑竹将这个贴设成讨论贴,问题比较有意思,我也将实验进展及时汇报)
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这个帖子发布于9年零204天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家，我想做两重荧光定量PCR(taqman),现在引物和探针已经设计好了，但是由于没什么经验,因此不敢贸然去合成探针,现在先把两对引物合成过来了,今天先用其中一个样品(基因组DNA)做了个sybr的定量。如下图,目的是为了看看引物合适不合适,三个阳性及三个阴性,阴性的好象都没起峰.具体的PCR步骤为.95度,3min-95度,15s-62度,1min.请大家帮忙分析下这些图,1:合适不合适继续做下面的工作2:如果要优化的话从哪些方面着手,因为我感觉扩增曲线的形状总不是很.3:大家做多重的时候具体有哪些步骤,因为我没经验,自己优化的话可能时间会浪费很多,谢谢。
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dujiaoshou edited on
这个图非常漂亮,不是来XB的吧.呵呵但要知道探针法跟SYBR法可能扩增的长度不一样,条件不是完全相同的.老板给钱就做吧,怕什么,不花钱那知道好不好呢?
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bentz大哥:我绝对不是献宝阿.我觉得我的扩增曲线还不是很好,没有呈S型阿,而且三个重复也不是很好,对此我没有什么经验.希望大家给些意见吧,谢谢了。
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我觉得你这个图很漂亮了,我也做SYBR定量的,呵呵,惭愧啊
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sybr做到这样已经很不错了，这怎么不是s型曲线呢，楼主觉得什么样的才是s型曲线呢？呵呵
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我准备做两重taqman荧光定量PCR,将两对引物放在一起走了荧光定量曲线,用sybr看引物在一起是否能产生特异性的产物.荧光定量PCR后跑电泳检测,现在发现有问题了,大家可以看荧光定量PCR扩增图中绿色的溶解曲线,一个在Tm为80左右的小峰对应的是电泳图上稍大一些的目的产物,而在Tm为86左右的的大峰对应的是电泳图上稍小一些的目的产物,我的问题是,为什么电泳图上亮度差不多,在荧光图上峰却差别那么大呢?不是说峰面积代表了产物量吗?原因会不会是EB和sybr greenI插入DNA的方式不一样,请大家讨论阿.谢谢了.
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较大片段的tm值怎么会比小片段的tm值还小呢？
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这个主要是看其GC含量的.当然长度还是一个因素.
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请高手帮忙,谢谢大家拉,我也将力所能及的帮助有问题的朋友.
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这种研究的精神是可贵的，看样子PCR的特异性不太好。对实验来说建议你重新设计一对引物，对于你提到的这个问题还是高手们回答吧：）
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请问一天到晚游泳的鱼：哪里可以看出特异性不好阿？绿色的溶解曲线是两重PCR，而其他的曲线均为阴性对照，那些峰应该是引物二聚体吧。但是3个阴性对照中其中有个被污染了。
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产物量与面积有关。但准确的定量室通过OD.mm2来算。体积和光密度的乘积
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yuyanjun1975：那请问您怎么解释，上面绿色溶解曲线呢？大峰和小烽，及电泳图中两条亮度差不多的条带呢？！
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建议楼主这样做一次平行实验比较：1。单独加第一对引物2。单独加第二对引物3。同时加入两对引物结果分析时，比较一下以上三个反应孔的扩增曲线和溶解曲线。看看位置和高度能否对应。一般来说，两重PCR的两对引物是有可能相互干扰的，而且这种干扰暂时无法在引物设计时提前避免，因此需要用实际实验去筛选。探针之间不会相互干扰，你可以大胆合成。
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谢谢huixu。1：我感觉峰高就象您说的是代表目标产物的纯度。2：峰面积的话我觉得还是应该代表在该峰在Tm范围内的荧光量，也就是我需要的目的产物的荧光量，这个可以通过积分来算。 3：接着2，也可以象您这样的解释，我目标产物较大的片段在电泳图中显示的条带中有其他的带，从而导致在溶解曲线中表现出来峰小，而且矮。4：我上次看到过一篇关于讲荧光染料的文章，上面说sybr greenI 对CG碱基比较偏爱，这也正好比较符合我的电泳图和real time PCR溶解曲线的峰。因为我较小片段的CG含量丰富，而较片段CG含量较低，这也在一定程度上说明峰的面积还是表示在该Tm范围内荧光量的，请见下文。而EB有没偏爱就不是很清楚了。Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperatureNucleic Acids Research, Haukur Gudnason1, Martin Dufva1, D.D. Bang2 and Anders Wolff1,*
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今天把荧光定量PCR做了pure dye的校正，终于做上FAM和HEX的双重荧光定量，但是问题马上随之而来了。下面是我做的荧光定量图，两条探针分别用FAM和HEX标记。下面3个图依次是：两个目的基因同时扩增（FAM+HEX），一个基因单独扩增（FAM），另一个基因单独扩增（HEX）。这三个反应都重复2次，图1中也就是有8条曲线（FAM 4条，HEX 4条）。模板用量均为转化后提纯的质粒100000copies/ul 加1ul。从图上可以FAM这个基因扩增量明显比HEX更好。我的问题是：1：我看到这几个probe反应，一开始荧光量都很高，一般都在之间，比我以前做过的sybr green I荧光值高多了。2：我两个质粒的用量都是100000个copies左右，得到的CT值在21-23左右，是否可行了？并且我觉得CT值在双重PCR中比单独做还小，这个可能和域值有关系，但是我到时应该怎么选择才好阿？3：这两个探针的效果怎么样？我没什么经验，只是感觉FAM这个比较好，而HEX这个不是很好，是这样吗？这样的效果能用到双重定量吗？4：感觉曲线好象还是S型，应该怎么优化呢，退火温度吗？我用的是两步法，62度1min。5：两个染料在一起做的时候感觉HEX这个扩增曲线不行（见图1），图一中比较高的四条曲线是FAM的，而趴在那里的是HEX。但是单独拿出来分析的时候又觉得不错（见图3），两者的区别只是纵坐标发生了变化。这个又该怎么分析处理呢？问题好多，谢谢谢谢了。很多naive的问题高手们见笑了。
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