筛选产业化研究提供关键参数；；E.利用该模型针对中草药植物精提物进行细胞水平的；本项目中的独创性技术成果将申请国际上和国内的发明；（二）研究基础与工作条件；1.工作基础；项目主持人宋有涛教授在日本的加滕昭夫实验室研究工；NatureBiotechnology（2003；PNAS（2005,Ross,ED.etal.,；项目主持人在2005年9月份回国后，得到
筛选产业化研究提供关键参数；
E. 利用该模型针对中草药植物精提物进行细胞水平的药物筛选，从而在分子机理和细胞学角度对该种中药成分抗朊病毒的药效进行评估，为今后推动抗朊病毒中药的国际市场化提供理论依据。
本项目中的独创性技术成果将申请国际上和国内的发明专利保护，研究同时形成一个稳定的、多学科交叉的、由以青年为主的教授-副教授-讲师-助教/实验技术员组成的科研人员梯队，培养8-9名硕士；结果以论文形式公开发表，预计在国内外学术期刊上发表论文8-9篇，其中5篇以上被SCI收录（其中影响因子4分以上1篇，2分以上2篇）。
（二）研究基础与工作条件
1.工作基础
项目主持人宋有涛教授在日本的加滕昭夫实验室研究工作中，从事细胞内分子伴侣对于蛋白质的类淀粉样沉淀（amyloidosis，与朊病毒的发生机理相同）的调控和治疗机理研究，年在国际SCI期刊（Protein Science，FEBS Letters.，J. Biochem.）上发表了6篇论文（其中3篇为第一作者，详见5.1.4.），发表期刊的平均影响因子为3.4，这些研究成果已被国际上其他实验室在Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure（2004, Sanders et al., 33: 25-51），J Mol Biol.（2005, Alcocer et al., 343:759-69），Biochemistry（2002, Goers et al., 41:12546-51），Biochemistry（2004, Nagy et al., 43:19-25），Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics （2005, Vanhooren et al., 60:118-130）等高水平SCI期刊上发表的文章中所引用；此外，申请者在美国科学院院士Wickner R.博士和高级研究员Masison DC.博士领导的美国国家卫生研究院朊病毒研究国家实验室的3年博士后研究工作中，从事分子伴侣对于酵母朊病毒生成、传播的调控机理研究，年在在国际SCI期刊（Genetics., J.Biol. Chem., Eukaryot. Cell., Mol. Cell. Biol., Mol. Gen. Genet.）上发表了5篇论文（其中2篇为第一作者，详见5.1.4.），发表期刊的平均影响因子为4.9，这些研究成果已被国际上其他实验室在Nature（2005,
Nature Biotechnology（2003, Bach et al., 21:1075-81），Satpute-Krishnan et al., 437:262-265），
PNAS（2005, Ross, ED. et al., 102:），PNAS（2005, Wu et al., 102:12789-94）Mol Biol Cell.（2004, Gilks et al., 15:5383-98），Mol Cell Biol. （2004, Rakwalska et al., 24:）等高水平SCI期刊上发表的文章中所引用。因此，项目主持人对于朊病毒的发生机理和治疗机制积累了丰富的研究经验。特别是项目主持人曾在年负责主持日本科学协会SASAGAWA科学研究基金（No.12-169）项目，其成果发表在J. Biochem.和Febs Letters.两种SCI期刊上（详见5.1.4.）。 因此，项目主持人对于主持合作性科研项目积累了丰富的实践经验。
项目主持人在2005年9月份回国后，得到辽宁省教育厅高等学校科学技术基金资助（No.05L156），正在主持利用野生型酵母建立筛选抗朊病毒中成药物筛选平台的研发项目，目前在辽宁大学所在的实验室已经建立了初级的野生型的酵母细胞的抗朊病毒药物筛选模型，并在理论研究和实验操作水平上取得了相当的进展。另外，项目主持人回国后在辽宁大学实验室进行的同日本山口大学加滕昭夫教授合作的科研课题“Prevention of Amyloid Fibril Formation of Amyloidogenic Chicken Cystatin by Site-Specific Glycosylation in Yeast” 成果已经发表在2006年的Protein Science期刊上（15:213-22，辽宁大学为第二完成单位），证明了项目主持人从国外到国内的可持续性研究能力。
项目主要合作者徐威副教授多年在沈阳药科大学来一直从事微生物与生化药学方向的研究，曾于年参与完成国家十五攻关、国家863项目各一项，主持省、市级课题多项，在国内外刊物发表论文24篇（详见5.2.），在药物纯化以及筛选领域积累了深厚的研究经验，并具有参与科研合作的丰富实践经验。
在上述研究的基础上，宋有涛教授与徐威副教授以及项目组其他成员在共同合作前文所述“利用野生型酵母建立筛选有效中药成份的抗朊病毒药物筛选平台”过程中，逐渐提出本项目的清晰思路。本项目抓住建立产业化抗朊病毒药物筛选平台这一基本点出发，探讨如何在不改变利用酵母模型的简单、经济、安全、高效的前提下，利用基因重组技术建立细胞水平高准确性、高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型，进一步降低该筛选系统的复杂性和检测上的不稳定性，从而达到产业化高通量筛选抗朊病毒药物的目的。
2.实验室仪器、设备条件
项目主持人所在的辽宁大学生命科学系拥有建有综合研究中心，已建立了一套基本的分子生物学与生物化学的工作平台。项目主持人在2005年9月作为辽宁大学重点人才引进被特聘为辽宁大学生命科学系教授，人才经费26万元人民币，设备购置费200万元人民币，进一步建立和完善了蛋白质机能实验室。现有涉及本课题的设备主要包括：多功能的无菌操作间；用于微生物培养的各种设备（恒温培养箱，CO2厌氧培养箱，小/中/大型温控摇床等）；用于细胞器/膜成分/高分子蛋白质分离纯化的高速冷冻离心机，HPLC液相色谱仪；用于蛋白质和核酸等分离/分析的各种电泳设备（大型水平/垂直电泳仪，大型半干电泳转印仪，全波长紫外分光光度计等）；用于分子生物学研究的仪器设备（PCR仪，数码多功能凝胶成像系统，基因/蛋白质芯片点样/检测仪，分子杂交仪等）；用于细胞生物学及药物筛选研究的仪器设备（电转移仪，荧光正置/倒置显微镜，高压细胞破碎仪等）。同时辽宁大学生命科学系计划利用2006年度的日本银行贷款，继续为项目主持人的实验室提供了150万元左右的仪器设备（快速分子纯化系统，CO2超临界萃取系统，微生物/蛋白质膜分离系统等）。随着辽宁大学“十一五”计划的制定和实施，项目主持人所领导实验室的实验条件将有更明显的提高，研究设施进一步向国内外先进水平靠近。另外，项目主要合作者徐威副教授所在沈阳药科大学制药工程学院的实验室拥有全套的药物分离纯化设备平台。
此外，本课题研究中，DNA测序委托宝生物工程（大连）有限公司完成；利用激光共聚焦显微镜运用光脱色荧光恢复方法（FRAP）在细胞水平上定量检测抗朊病毒药物对于活体酵母细胞中荧光标记的朊病毒成分的治疗效果的研究将租用中国医科大学中心实验室（沈阳）的相关设备完成。申请者注意到在美国使用的共聚焦显微镜与现有的共聚焦显微镜在性能和价位上有所差异，这可能会造成定量上灵敏度的差别，我们在菌株构建后会测试这种差别是否影响到平台的灵敏度和准确性。如果遇到这个问题，申请者计划同我们的合作实验室（中国科学院生物物理所国家高分子重点实验室的Perrett S.副研究员）在其所在的中国科学院生物物理所的测试中心租用其与申请者在美国相同型号的共聚焦显微镜共同完成这部分工作，同时准备通过辽宁大学“十一五”计划的设备投资，积极寻求购置相同型号的共聚焦显微镜。因此，申请者的课题组所拥有和创造的条件完全能够满足本项目研究的需要。
因此，项目组按照上述研究计划和实验方案所申请的国家自然科学基金将主要用于研究中的试剂、耗材和各种测试费用。同时，为了高效、高质、尽早完成本课题，项目组计划在现有的基础上增购国产大型水平电泳装置及蛋白质转印装置各一台，以便在次级筛选过程中节省大量时间。另外，为了在微生物操作的过程中达到便捷、准确的目的，项目组计划利用少量经费在实验室自己仿制美国微生物研究中常用的人性化微生物接种装置一套。
3.技术条件
该项目关键的野生型酵母细胞J780菌系（感染朊病毒PSI+的J780-1C和对照J780-1D菌株）、经改建的酵母用pH317系列质粒载体由申请者的合作实验室--美国国立卫生研究院（NIH）朊病毒研究国家实验室的Masison DC.博士提供。本项目涉及的核心实验技术和方法，是国际上朊病毒研究领域中最前沿的技术，申请者在前期研究中曾经在理论和实践上改良、验证和使用，并在5篇高水平的国际SCI收录期刊（Genetics., J.Biol. Chem., Eukaryot. Cell., Mol. Cell. Biol., Mol. Gen. Genet.）上公开发表，同时，其成果已被他人在高水平的SCI 源刊（Nature，Nature Biotechnology, PNAS，J Mol Biol., Mol
Biol Cell., Mol Cell Biol.等）多次引用。
正如前文所提，有关朊病毒的防治药物的研究是一个集合了分子生物学、细胞生物学、分子遗传学、蛋白质化学、基础和临床药理学等多学科的新领域，它需要研究者具有广博深厚的理论基础和实验室间的团队合作能力。而项目主持人在2005年9月回国后，在辽宁大学领导的蛋白质机能实验室已经建立了初级的野生型的酵母细胞的抗朊病毒药物筛选模型，初步完成了课题组成员的技术培训，并在理论研究和实验操作水平上取得了相当的进展。宋有涛教授、惠秀娟副教授在分子生物学和细胞生物学方向、徐威副教授、张慧丽讲师在基础药理学方向、回晶讲师在蛋白质化学方向、刘剑利助教在蛋白质纯化技术方面、李辉实验员在微生物培养技术方面已具备合作完成该课题的理论与技术基础（详见“5.项目组成员简历”）。迄今，课题组已经完成使用药物phenanthridine和guanidine检测酵母J780菌系对于抗朊病毒药物的敏感性的初步试验，并在定性研究上得出0.5 mM phenanthridine和3 mM guanidine可以治愈该菌系酵母朊病毒PSI+的结论。
4.国内及国际合作
美国国家卫生研究院（NIH）朊病毒研究国家实验室的高级研究员Masison D.博士（项目主持人在NIH做博士后工作的导师），爱尔兰国立大学酵母朊病毒研究实验室的助理教授Jones G.博士（项目主持人在NIH工作时的同事），中科院生物物理所国家高分子重点实验室的副研究员Perrett S.博士目前同申请者所在的辽宁大学蛋白质机能实验室建立了合作关系，为本项研究提供了理论和实验的援助，从而确保申请者在现有实验室的条件下，能够完成利用基因重组技术建立细胞水平高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型的研究。
5.项目组成员简历
5.1.宋有涛（申请者和主要完成者，在本项目中负责项目方案的制定）：
申请者宋有涛，男，1973年3月出生。博士、教授，辽宁大学生命科学系蛋白质机能实验室主任。2002年在日本山口大学获得博士学位后，5.8年在美国国家卫生研究院（NIH）进行博士后研究，从事于朊病毒引发疾病的发病、治疗机制的基础分子生物学水平研究。近五年来，在国际高水平SCI收录英文期刊上发表了论文14篇，其中第一作者7篇，影响因子合计为49.101分。2005年9月作为辽宁大学重点人才引进被特聘为辽宁大学生命科学系教授，人才经费26万元人民币，设备购置费200万元人民币。
5.1.1.学习简历：
5.7： 南开大学生命科学学院微生物系，学士。主修微生物学。
7.3：日本山口大学农学院应用生物化学系，研修。
9.3： 日本山口大学农学院应用生物化学系，硕士。从事细胞内利用遗传方法
进行蛋白质修饰对于蛋白质构象折叠病（老年痴呆、帕金森类的神经系
统疾病）的调控机制研究；导师：加滕昭夫教授（退休前为山口大学农
学院院长）。
2.3： 日本山口大学农学院应用生物化学系，博士。从事细胞内分子伴侣对于
蛋白质构象折叠病的研究；导师：加滕昭夫教授。
博士毕业论文题目：内质网中分子伴侣Calnexin缺损对于类淀粉样蛋白
分泌的影响
5.8：美国国家卫生研究院（NIH）美国科学院院士Wickner R.博士和高级研
究员Masison DC.博士的朊病毒研究国家实验室实验室，博士后。从事
于朊病毒引发疾病的发病、治疗机制的基础分子生物学水平研究。
5.1.2.主持项目情况：
1. Effects of calnexin deletion in Saccharomyces cerevisiae on the secretion of glycosylated lysozymes（日本科学协会SASAGAWA科学研究基金，71万日元，No.12-169，01.2.，负责）
2. 酵母朊病毒发病机制的研究（辽宁大学人才引进基金，No.05.9.-2007.8.，负责）
3. 高通量抗朊病毒药物筛选平台的研发（辽宁省教育厅高等学校科学技术研究项目，3万元，No.05L156, 07.12.,负责）
5.1.3.参与项目情况：
1. Posttranslational modification of lysozyme （Grant-in Aid for Scientific Research B from The Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology of Japan No.98-1999，PI：Kato Akio，主要执行人）
2. Quality control of nascent lysozyme in yeast （Grant-in Aid for Scientific Research Specific field A from The Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology of Japan，No.99，PI：Kato Akio，主要执行人）
3. Molecular design of protein-polysaccharide conjugates as a new functional ingredients（Nestle Scientific Promotion Committee，，PI：Kato Akio，负责用遗传方法的糖链附加及蛋白质功能检测）
5.1.4.近年来发表的SCI收录论文：
（影响因子合计为49.101，影响因子按2004年统计结果）
1. He, J., Song, Y., Ueyama, N., Saito, A., Azakami, H. and Kato, A. (2006) Prevention of
Amyloid Fibril Formation of Amyloidogenic Chicken Cystatin by Site-Specific Glycosylation in Yeast. Protein Science, 15, 213-22. Impact Factor: 4.116
2. Tutar, Y., Song, Y., Masison DC. (2006) Primate chaperones Hsc70 (constitutive) and
Hsp70 (induced) differ functionally in supporting growth and prion propagation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. (in press, 2005 Nov 19, Epub ahead of print) Impact Factor: 4.138
3. Song, Y. and Masison, DC. (2005) Independent regulation of Hsp70 and Hsp90
chaperones by Hsp70/90 organizing protein Sti1 (Hop1). J. Biol. Chem. 280, 34178-85. Impact Factor: 6.355
4. He, J., Sakamoto, T., Song, Y., Saito, A., Azakami H. and Kato A. (2005) Effect of Eps1p
deletion in Saccharomyces cerevisiae on the secretion of foreign proteins which have disulfide bridges. FEBS Letters. 579, 2277-83. Impact Factor: 3.843
5. He, J., Song, Y., Ueyama, N., Azakami H. and Kato A. (2005) Characterization of
recombinant amyloidogenic chicken cystatin mutant I66Q in yeast. J. Biochem. 137, 477-85. Impact Factor: 2.292
6. Song, Y., Wu, Y., Jung, G. Tutar, YHsp70 chaperone in yeast prion seed replication. Eukaryot. Cell. (4): 289-97. Impact
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