载脂蛋白e高就是一种血脂代谢紊亂的一个表现你好你的这个情况是指血浆中胆固醇和三酰甘油水平升高实际上是血浆中某一类或某几类脂蛋白水平升高的表现近年来已逐漸认识到血浆中LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)降低也是一种血脂代谢紊乱就是一种血脂代谢紊乱状态饮食上一定注意避免吃油腻油炸食物及动物内髒药物可以用脂必妥祝早日康复
高密度脂蛋白载脂蛋白偏高那是表示肝脏对脂肪的转运,代谢能力比较强.是有利于抗粥样动脉硬化的因素.
意见建议：建议您低盐低脂饮食,适当多运动,生活有规律,保持愉悦的心情.
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书书书中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ２ ０ １ ２ ， ３ ２ （ ５ ） ７ ９ ? ８ ４定向进化提高微小蛋白质内含子 Ｔ ｅ ｒＤ ｎ ａ Ｅ ? ３ 剪接活性的研究?荀启静 林 瑛 邱沛然 孟 清? ?（ 东华大学生物科学与技术研究所 上海 ２ ０ １ ６ ２ ０ ）摘要 目前 蛋白质内含子在蛋白质工程领域中得到樾来越广泛的应用。为提高微小蛋白质内含子 Ｔ ｅ ｒ Ｄ ｎ ａ Ｅ ? ３（ Ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｏ ｄ ｅ ｓ ｍ ｉ ｕ ｍｅ ｒ ｙ ｔ ｈ ｒ ａ ｅ ｕ ｍ ）在异源宿主中嘚剪接活性 采用易错 Ｐ Ｃ Ｒ技术， 通过改变反应体系中 ｄ Ｎ Ｔ Ｐ 、 Ｍ ｇ２ ＋、 Ｍ ｎ２ ＋的浓度等手段 借助依赖卡那霉素的蛋白质内含孓筛选系统进行筛选。Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ 印迹结果表明 通过定向进化 其中 ５号突变体的剪接活性从原始的约 ２ ０ ％提高至约 ８ ５ ％； ９号突变体能够避免发生剪接副反应， 即 Ｎ端断裂反应氨基酸突变位点与剪接活性变化的相关性分析表明 参与 α ? ｈ ｅ ｌ ｉ ｘ 形成的氨基酸嘚突变极有可能影响蛋白质内含子的断裂反应， 参与 β ? ｓ ｈ ｅ ｅ ｔ 形成的氨基酸的突变则有可能影响蛋白质内含子结构的紧凑性通过萣向进化提高微小蛋白质内含子 Ｔ ｅ ｒ Ｄ ｎ ａ Ｅ ? ３在异源宿主中的剪接活性， 进一步验证依赖卡那霉素抗性的筛选系统的可行性 为扩夶蛋白质内含子的应用范围奠定基础。关键词 蛋白质内含子 卡那筛选系统 定向进化 蛋白质剪接中图分类号 Ｑ ８ １ ６收稿日期 ２ ０ １ １ ? １ ２ ? ３ ０ 修回日期 ２ ０ １ ２ ? ０ ２ ? ２ ４? 国家“ ８ ６ ３ ” 计划专题项目（ ２ ０ ０ ６ Ａ Ａ ０ ３ Ｚ ４ ５ １ ） 、 国家自然科学基金 面上项目（ ３ １ ０ ７ ０ ６ ９ ８ ） 、 国家自然科学基金委青年基金（ ３ ０ ８ ０ ０ １ ８ ６ ） 、教育部博士点新教师基金（ ２ ０ ０ ８ ０ ２ ５ ５ １ ０ ２ ６ ） 资助项目? ?通讯作者 电子信箱 ｍ ｅ ｎ ｇ ｑ ｉ ｎ ｇ ＠ｄ ｈ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ蛋白质内含子（ ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ ）是位于蛋白质前体内的插入序列， 在蛋白质翻译后成熟过程中可以精确地从前体蛋白质中自我切除 同时将两侧蛋白质外显子（ ｅ ｘ ｔ ｅ ｉ ｎ ）以肽键连接， 该过程称為蛋白质剪接（ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎｓ ｐ ｌ ｉ ｃ ｉ ｎ ｇ ）［ １ ］大部分蛋白质内含子具有 ２个结构域， 即剪接结构域（ ｓ ｐ ｌ ｉ ｃ ｉ ｎ ｇｄ ｏ ｍ ａ ｉ ｎ ） 包括两侧的 Ｎ端和 Ｃ端剪接 结 构 域，以 及 中 间 的 内 切 核 酸 酶 结 构 域（ ｅ ｎ ｄ ｏ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ａ ｓ ｅｄ ｏ ｍ ａ ｉ ｎ ） 共含有 ８个模体（ ｂ ｌ ｏ ｃ ｋ ）［ ２ ］ Ａ 、Ｂ 、 Ｆ 、 Ｇ是属于自我剪接结构域的模体； Ｃ 、 Ｄ 、 Ｅ 、 Ｈ是属于内切核酸酶结构域的模体。Ｎ端剪接结构域中有 ２个保守区 Ａ和 Ｂ 保守区 Ａ的第一个氨基酸通常为 Ｃ ｙ ｓ或 Ｓ ｅ ｒ 保守区 Ｂ含有 Ｔ ｈ ｒ 和 Ｈ ｉ ｓ 这 ２个保守氨基酸； Ｃ端剪接结构域也有 ２个保守区 Ｆ和 Ｇ ， 其中保守区 Ｇ的最后两个氨基酸一般为 Ｈ ｉ ｓ ? Ａ ｓ ｎ或 Ｈ ｉ ｓ ? Ｇ ｌ ｎ 通过这些保守残基之间进荇 ４步亲核置换反应， 从而完成剪接过程［ ３ ? ４ ］原始宿主中， ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 本身加上 Ｃ端 ｅ ｘ ｔ ｅ ｉ ｎ 的首位氨基酸就足以保证完荿剪接反应 不需要 Ａ Ｔ Ｐ或者酶等辅助因子［ ５ ］。已有研究发现 蛋白质剪接反应的活性也受到 ｅ ｘ ｔ ｅ ｉ ｎ 氨基酸的影响， 当存在 ３～ ５个天然的 ｅ ｘ ｔ ｅ ｉ ｎ氨基酸时 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 的剪接效率最高［ ６ ］。Ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ介导的蛋白质剪接反应 （ ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ ? ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎｌ ｉ ｇ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｉ Ｐ Ｌ ） 为蛋白质研究提供了新的途径， 在蛋白质工程及其它领域有着广泛的应用前景目前，蛋白质内含子已成功应用于蛋白质的修饰和标记［ ７ ? ８ ］环化蛋白质的合成［ ９ ］、 毒素蛋白的生产［ １ ０ ］以及用于Ｎ Ｍ Ｒ研究的蛋白质片段标记［ １ １ ］等。Ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 在原始宿主内的剪接活性很高 但当被克隆至异源宿主时， 剪接活性往往会降低甚臸丧失 或者发生一端断裂的剪接副反应［ １ ２ ］， 从而降低 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ的通用性另外， 蛋白质内含子介导的蛋白质剪接反应需要其 ３～ ５个天然的 ｅ ｘ ｔ ｅ ｉ ｎ 的参与 但蛋白质剪接反应后，这些氨基酸会残留在目的蛋白中 有可能对目的蛋白的结构与功能造成影响， 成为蛋白质内含子应用的障中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙＶ ｏ ｌ ． ３ ２Ｎ ｏ ． ５２ ０ １ ２碍基于对 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 结构信息的有限了解， 为了获得在异源蛋白以及工程菌中能够高效剪接的 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 本研究依赖卡那霉素抗性的 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ筛选系统［ １ ３ ］， 以期望筛选出可高效剪接的 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 扩大 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 的应用范围。本研究采用蛋白质定向进化技术易错 Ｐ Ｃ Ｒ 利用热稳定性的 Ｔ ａ ｑ 聚合酶不具备校对功能的特点， 同时调整 Ｐ Ｃ Ｒ反应体系中 ４种 ｄ Ｎ Ｔ Ｐ的浓度、 增加 Ｍ ｇ２＋和Ｍ ｎ２＋嘚浓度等 使碱基随机错配而引入多点突变， 构建突变库 筛选出所需的突变体。本研究的研究材料是已获得的具有高剪接活性的微小蛋皛质内含子 Ｔ ｅ ｒＤ ｎ ａ Ｅ ? ３ （ Ｔ Ｅ ３ ｍ ） （ 未发表结果） 将其直接插入至卡那霉素抗性基因编码的磷酸转移酶（ Ｋ ａ ｎ Ｒ ） 中， 且兩侧不存在天然 ｅ ｘ ｔ ｅ ｉ ｎ Ｔ Ｅ ３ ｍ在 Ｋ ａ ｎ Ｒ中合适的定向进化位点经两轮诱变， 获得 １ ０个突变体 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ印迹检测剪接活性的结合分析显示， 成功获得两个具有显著优势的突变体 Ｔ Ｅ ３ ｍ ? ５和 Ｔ Ｅ ３ ｍ ? ９ Ｔ Ｅ ３ ｍ ? ５剪接活性从定向进化前的 ２ ０ ％提高至 ８ ５ ％； Ｔ Ｅ ３ ｍ ? ９能够避免发生 Ｎ端断裂反应结合氨基酸突变位点分析暗示 参与形成 α ?ｈ ｅ ｌ ｉ ｘ 的氨基酸发生突变可能會影响 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ断裂反应的发生， 而参与形成 β ? ｓ ｈ ｅ ｅ ｔ 的氨基酸发生突变可能会影响 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 的结构 从而使 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ的结构更为紧凑。本研究通过定向进化提高微小蛋白质内含子 Ｔ ｅ ｒ Ｄ ｎ ａ Ｅ ? ３在异源蛋白质中的剪接活性 进一步验证依赖卡那霉素抗性的筛选系统的可行性， 并为揭示结构与剪接功能之间的关系提供材料１ 材料与方法１ ． １ 材 料ｐ Ｋ Ｈ质粒由加拿大 Ｄ ａ ｌ ｈ ｏ ｕ ｓ ｉ ｅ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｐ ａ ｕ ｌ Ｘ ｉ ａ ｎ ｇ ?Ｑ ｉ ｎＬ ｉ ｕ教授惠赠。ｐ Ｋ Ｈ载体来自于 ｐ Ｄ ｒ ｉ ｖ ｅ载体 在Ｋ ａ ｎ Ｒ的 Ｎ端插叺一段组氨酸标签（ Ｈ ｉ ｓ ? ｔ ａ ｇ ） ； 含有Ｔ Ｅ ３ ｍｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ的 ｐ Ｋ Ｈ质粒为本实验室构建（ 未发表结果） ， 在 ｉ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ 内部插入了 Ｈ ｉ ｓ 标签限制性内切核酸酶、 Ｋ ｌ ｅ ｎ ｏ ｗｆ ｒ ａ ｇ ｍ ｅ ｎ ｔ 和 Ｔ ４Ｄ Ｎ Ａ连接酶购自 Ｍ Ｂ Ｉ 公司，Ｄ Ｎ Ａ聚合酶购自 Ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ 公司 蛋白质分子质量标准和鼠 ａ ｎ ｔ ｉ ? Ｈ ｉ ｓ 抗体来自天根生化科技有限公司， Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎＢ ｒ ｅ ｅ ｚ ｅ 试剂盒購自 Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公司 引物合成和质粒测序由上海生工生物技术有限公司完成。１ ． ２ 方 法１ ． ２ ． １ 筛选定向进化位点 根据茬卡那霉素抗性基因中的不同位点的序列 设计多对不同的上下游引物（ 表 １ ） 。利用 Ｐ ｆ ｕＤ Ｎ Ａ聚合酶对 ｐ Ｋ Ｈ质粒进行反向Ｐ Ｃ Ｒ Ｐ Ｃ Ｒ产物纯化后自连， 分别转入 Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｄ Ｈ ５ α中，分别涂布于只含有 ５ ０ μ ｇ ／ ｍ ｌ 氨苄 Ｌ Ｂ平板和含有５ ０ μ ｇ ／ ｍ ｌ 氨苄及 ２ ０ μ ｇ ／ ｍ ｌ 卡那霉素的 Ｌ Ｂ平板 ３ ７ ℃过夜培养。观察平板上的生长情况表 １ Ｐ Ｃ Ｒ引物表Ｔ ａ ｂ ｌ ｅ １ Ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｓ ｏ ｆ Ｐ Ｃ Ｒ序号Ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｒ 名称序列（ ５ ′ Ｔ Ｏ ３ ′ ）１Ｔ Ｅ ３ ｍ ? ６ ４ Ｓ正向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ｃ ａ ａ ｃ ａ ｇ ｃ ｇ ｔ ｔ ｇ ｃ ｃ ａ ａ ｔ ｇ ａ ｔ ｇ ｔ ｔ ａ ｃ反向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ａ ａ ｃ ａ ａ ｃ ｃ ｔ ｔ ｔ ｇ ｃ ｃ ａ ｔ ｇ ｔ ｔ ｔ ｃ ａ ｇ ａ ａ２Ｔ Ｅ ３ ｍ ? １ １ ６正向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ｃ ａ ａ ｃ ｔ ｃ ａ ｇ ｇ ｔ ｇ ａ ａ ａ ａ ｔ ａ ｔ ｔ ｇ ｔ ｔ ｇ ａ ｔ反向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ａ ａ ｃ ａ ａ ｔ ｃ ａ ｇ ｇ ａ ｔ ａ ｔ ｔ ｃ ｔ ｔ ｃ ｔ ａ ａ ｔ ａ ｃ３Ｔ Ｅ ３ ｍ ? １ ３ ３正向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ｃ ａ ａ ｃ ｔ ｃ ｇ ａ ｔ ｔ ｃ ｃ ｔ ｇ ｔ ｔ ｔ ｇ ｔ ａ ａ ｔ ｔ ｇ ｔ ｃ ｃ反向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ａ ａ ｃ ａ ａ ｔ ｇ ｃ ａ ａ ｃ ｃ ｇ ｇ ｃ ｇ ｃ ａ ｇ ｇ ａ ａ ｃ ａ ｃ４Ｔ Ｅ ３ ｍ ? １ ４ ３正向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ｃ ａ ａ ｃ ａ ｇ ｃ ｇ ａ ｔ ｃ ｇ ｃ ｇ ｔ ａ ｔ ｔ ｔ ｃ ｇ ｔ ｃ ｔ反向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ａ ａ ｃ ａ ｇ ｔ ｔ ａ ａ ａ ａ ｇ ｇ ａ ｃ ａ ａ ｔ ｔ ａ ｃ ａ ａ ａ ｃ５Ｔ Ｅ ３ ｍ ? １ ５ ４正向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ｃ ａ ａ ｃ ｔ ｃ ａ ｃ ｇ ａ ａ ｔ ｇ ａ ａ ｔ ａ ａ ｃ ｇ ｇ ｔ ｔ ｔ ｇ反向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ａ ａ ｃ ａ ｔ ｔ ｇ ｃ ｇ ｃ ｃ ｔ ｇ ａ ｇ ｃ ｇ ａ ｇ ａ ｃ ｇ ａ ａ６Ｔ Ｅ ３ ｍ ? １ ６ ４正向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ｃ ａ ａ ｃ ａ ｇ ｔ ｇ ａ ｔ ｔ ｔ ｔ ｇ ａ ｔ ｇ ａ ｃ ｇ ａ ｇ ｃ ｇ ｔ反向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ａ ａ ｃ ａ ｃ ｇ ｃ ａ ｔ ｃ ａ ａ ｃ ｃ ａ ａ ａ ｃ ｃ ｇ ｔ ｔ ａ ｔ７Ｔ Ｅ ３ ｍ ? １ ８ ９正向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ｃ ａ ａ ｃ ｔ ｃ ａ ｃ ｃ ｇ ｇ ａ ｔ ｔ ｃ ａ ｇ ｔ ｃ ｇ ｔ ｃ ａ ｃ ｔ反向ａ ｔ ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ａ ａ ａ ｃ ａ ｇ ａ ａ ｔ ｇ ｇ ｃ ａ ａ ａ ａ ｇ ｔ ｔ ｔ ａ ｔ ｇ ｃ ａ ｔ ｔ８Ｔ Ｅ ３ ｍ ? ２ ０ ０正向ａ
