关注今日：10 | 主题：287482
微信扫一扫
【分享】荧光定量PCR详细流程和问题解析
页码直达：
这个帖子发布于8年零171天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。
荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。普通PCR与荧光定量PCR技术区别？ 简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。
如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。 另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green法选择单通道实验还是多通道实验？
这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。
可以看出，如果单通道实验可以解决问题，就不要选择多通道实验了。三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通道，就是有更多的通道，实验条件的优化也是足够麻烦了。双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难？
对于反应条件的优化，可通过两个单独实验的标准曲线来优化，主要是复性温度，可用PCR仪的温度梯度功能来选择，然后找到一个合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰，则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较，如果差别不大，则表明没有干扰。至于模板数差别很大的问题，可以通过降低引物浓度的方法来实现，即primer limited，在一般的PCR反应中，引物的浓度是足够高的，基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽，在优化引物浓度时，用不同的引物浓度进行实验，找到不影响反应的C(t)值的最低引物浓度。这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。引物设计中的几个注意事项1、 引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。2、 引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域。3、 在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增4、 由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的过程，如果逆转录是用poly（T）作引物，则设计的片段尽量靠近poly（A），以免逆转录的效率影响到实验结果。如果用特异性引物进行逆转录，则要考虑引物区是否存在RNA二级结构的问题5、 产物片段的大小：定量PCR一般产生片段都不大，不会超过600bp。Sybr Green法一般选择250-600bp，过大会影响到PCR扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开，但并不是绝对的。Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。Molecular beacon法对片段大小的要求不高，只要不是太长即可。Sybr Green法的实验策略：
实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。一、 实验条件的优化阶段，这一阶段是最花时间的，1、 要找到一个阳性的模板，可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验，如果有普通PCR的实验条件，也可以此为基础进行实验。2、 扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小，以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因，有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对，不是自己想要的基因。当然，能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够，个别情况下会出来解键不充分的现象。3、 有了基本的PCR条件后，要将阳性模板进行倍比稀释，一般用10倍稀释。将稀释的模板带上阴性对照，分成多份进行温度梯度实验，对复性温度进行优化，以找出复性温度范围，复性温度最好能满足以下条件：高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度，这样可以提高实验的稳定性，不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。4、 如果找不到合适的条件，如引物二聚体过多，可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化，然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。二、 预实验阶段
按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验，每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验，预实验的目的主要有两个，一是了解样本的模板浓度范围，如果有样本的模板浓度在标准曲线之外，如过高或过低，则可能要对标准曲线进行重新优化，当然，如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少，直接进行外推是不科学的。另一个目的看样本中是否有PCR抑制物的影响，如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同，则表明没有抑制物的影响，如果不同，如原倍结果为零，而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性，则表明样本中PCR抑制物浓度较高。可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。
有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的，也许有更多用户没有进行这样的实验，得到了错误的结论。因为样本RNA的提取试剂中经常有抑制PCR反应的物质，清洗不干净就会影响到定量PCR反应。三、 正式实验阶段
然后就可以进行正式实验了，只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。有抑制物的样本先进行稀释，计算浓度时不要忘记就行了。最后就可以进行实验结果分析了，个别样本中离群的数值可以删除。Sybr Green法的注意事项1、 最好按照上面提到策略进行实验，以免造成不必要重复实验，从而降低实验成本2、 Sybr Green I一般是先将母液用DMSO进行稀释100倍，最终的使用浓度为分之一。可能不同的Sybr Green I母液的稀释倍数不同，可通过实验来证明，但高浓度的Sybr Green I肯定会影响PCR反应。另外用水稀释后的Sybr Green I保存的时间很短，一般1周后就不能用了。DMSO似乎反复冻融会影响性能，但原因不明。3、 在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到满意的结果，特别是引物二聚体很多时，可以考虑更换引物，因为引物成本低，而优化实验成本很高。4、 当有少量引物二聚体影响荧光结果时，可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响，如将读板时的温度提高到82度，此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR反应，消除引物二聚体的影响也没有用。5、 大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2ΔΔC（t）来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2ΔΔC（t）来计算了。这是错误的，会得到错误结论。6、 无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别，如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等，可能会影响到实验结果，甚至要重新进行实验条件的优化。7、 不要在管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，后来再擦掉，也会对实验有些影响。8、 最好使用高质量的PCR管，低质量管的管间差可能会很大。9、 每次实验一定要有阳性对照和阴性对照，以免出现问题时找不到原因。10、 在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低，理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。
其他方法也可以采用类拟的策略，以节约成本，提高效率。
想到的内容就这些了，希望大家多批评指正。 反应体系的建立及优化
来源： 作者： 发布时间：
1. SG浓度：　　终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,0002. Primer浓度：　　终浓度50nM－300nM　　固定摸板浓度的梯度实验　　不加摸板的对照实验（NTC）——有无非特异信号　　熔解曲线的分析——是否单峰　　建议使用HPLC纯化的引物3. MgCl2浓度　　降低MgCl2浓度以减少非特异性产物　　最低可至1.5nM　　同时做梯度实验和NTC对照4. 反应温度和时间参数　　反应温度参考所用酶的种类　　退火温度使用温度梯度功能优化　　反应时间与常规PCR类似，扩增片断一般为200－300bp5. TaqMan探针　　引物、探针设计：　　首先选择探针序列　　探针的Tm值为68－70度，长度不应超过30碱基　　探针的5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素　　引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp　　引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基　　避免引物、探针之间的二级结构委托合成公司设计　　使用辅助软件　　确定反应参数　　一般为两步法，94度10－20s　　60度30－60s （Taq酶的5’外切酶活性在60度最强）　　通过温度梯度优化退火温度　　三步法， 72度45s　　优化引物探针浓度目标：最高的信号/背景比　　最小的Ct值　　引物浓度：50nM-900nM　　探针浓度：50nM-250nM　　通过多次实验确定各自的浓度和比例
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
arsen 编辑于
很好很强大
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
太感激了，学到了很多。我进实验室已经三个月了，从一窍不通到现在一片混乱，日子太难过了。读了楼主的文章，虽然不能全懂，但是感觉心中有了几缕阳光。感谢！这三个月简直是我目前人生中最难熬的一段日子。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
学习了，非常好，希望能深入讨论！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
好贴谁能帮我详细的解释下面这句话是什么意思？在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增？？？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
回LS：不对的请指出哈1、如果两个引物分别分布在两个外显子上，外显子之间存在一个或多个内含子，那么cDNA扩增得到的PCR产物当然小于来自基因组的PCR产物；另外Taq酶对PCR产物的合成长度是有一定限制的，并且在较短的延伸时间内也完成不了长片段的延伸。所以，如果来自基因组的PCR产物如果能顺利P出来，它的大小也是大于来自cDNA的，这在电泳时容易区分的；要么根本就P不出来的。2、如果其中一个引物是由一个外显子尾部和下一个外显子头部拼接而成的话，那么此时的引物只能P出cDNA的产物，根本就不会把基因组的P出来。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢楼上的解答，基本明白了不过还有一个问题：如果要研究的目的片短只是一个外显子，这样的话是不是就不好办了，因为这样设计引物的时候要么只能将引物放在目的外显子内，要么只能放在内含子内
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢，呵呵
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
先收一下 最近在做real-time 有空来交流
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
横空出世高人一枚,汇总得很好,学习了:D个人以前并没听过这个说法.楼主可否将这个问题阐述一下?还有这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。是一个基因就消耗一个模板的意思?恐怕......
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
好小猫 好贴谁能帮我详细的解释下面这句话是什么意思？在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增？？？RT-PCR的主要问题是RNA样品中存在gDNA污染。这样会引起假阳性的发生、特异性降低，或者特定RNA含量测量值偏高。为了排除gDNA的污染对实验结果的影响，可以在特定的位置设计引物。如下图：1、在外显子与外显子连接处设计一条引物，另一条在外显子处。这样gDNA不会被扩增，而mRNA/cDNA可以扩增。2、设计跨外显子、内含子的引物（一条或一对）。这样，mRNA/cDNA不会被扩增，而gDNA可以扩增。3、在内含子两侧的外显子设计引物。gDNA扩增得到大扩增产物，mRNA/cDNA扩增得到小扩增产物。然后通过电泳等方法区别。具体图解请看附件！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
yaoshan 横空出世高人一枚,汇总得很好,学习了:D个人以前并没听过这个说法.楼主可否将这个问题阐述一下?还有这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。是一个基因就消耗一个模板的意思?恐怕......第一个问题：我个人的理解是，荧光定量是退火、延伸、荧光信号收集一步完成，如果扩增片段太长，势必影响荧光采集效率，如果有其它解释大家可以共同讨论。第二个问题：这种说法不太合适，主要的意思是，为了确定合适引物浓度，可以采用过量的模板。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
还有这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。是一个基因就消耗一个模板的意思?恐怕......也可以这样理解，在做多通道荧光定量试验优化时，需要考虑的是降低各个通道之间的相互干扰。而最容易遇到的相互干扰是一个通道a对应的靶基因浓度很高，另外的通道b/c对应的基因浓度很低，那么a会先耗费大量的dNTP同时产生大量的焦磷酸和dNMP等PCR副产物，这些过早产生（比如在前15个cycle就有大量积累）的副产物会抑制其他通道b/c的反应。 b/c通道他们原来会在25cycle起跳，但由于dNTP的缺乏和抑制物的大量存在而无法起跳或很晚起跳。为了解决这个问题就可以适当降低a通道对应基因的引物浓度，在不影响a通道的起跳的前提下抑制a通道消耗dNTP也抑制副产物的过量生成，从而不影响其他通道的检测。这个问题我是没遇到过，听roche的人讲课我这样理解下来的。不过做taqman snp时感觉说的好像没错，但没自己真正验证过多通道pcr，感觉做科研的人患不着惹这个麻烦事。关于Taqman法的扩增片段大小问题，如果考虑到taqman 的PCR循环参数是95度60度反复循环的话，片段还是短点的好，当然也不能短到引物探针都放不下。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
mediated 编辑于
挺好的主题，记下
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
荧光定量与常规定性pcr各有千秋，因试验而定，但荧光定量是一个发展方向
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园准中级站友
不错，我也做这个，搞好好久，才算懂了一点！！特别是数据统计！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
记下，慢慢看看
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关注学习中。。。。。。。。。。。。。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
现在分子试验很多人做这个，学习一下，谢谢楼主分享
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请问我用2-△△Ct计算,设了3个复孔,比较用药组与对照组有没有显著性差异,怎么计算?我只做了一次,每组都设了3个复孔,不知怎么求算△Ct标准差,以及怎么进行2-△△Ct统计
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢楼主分享，我刚开始做，还有很多不懂
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
太谢谢了，终于找着一点需要的了，刚开始学习，真的是要许多实用的建议和操作方法的，呵呵
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
先做个记号，最近也要做了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
感谢楼主的无私奉献，受益非浅！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2ΔΔC（t）来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。怎么证明呢？我的内参和目的基因扩增效率好象就不一样。设计了两个内参引物还是不行，有什么办法解决呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
好贴！学习一个!
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
感谢分享，学习中。^_^
请较各位高手，在荧光定量PCR中CT值一般是多少？有没有标准对CT值判断，如果越小越好，那么最小不能低于多少，最大不能超过多少呢？
盼回复，多谢先！O(∩_∩)O~
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我就不用谢了哈
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
讲得很好 详细 但是若结果没有熔解峰是为什么呢 可否解答
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请教一下，我刚进实验室，想问问，我想测一下某种基因在某种细胞中的基础量，是否可以用荧光定量PCR的绝对定量测定
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
如果CT是20个循环，那么PCR设置循环数在多少左右适合，才不至于进入平台期呢，是大于8左右还是多少？？？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
很有收获，谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园荧光定量PCR常见问题及解答_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
荧光定量PCR常见问题及解答
阅读已结束，下载文档到电脑
想免费下载本文？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，方便使用
还剩2页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢小木虫 --- 600万学术达人喜爱的学术科研平台
热门搜索：
&&实时荧光定量PCR结果无法分析！求助
实时荧光定量PCR结果无法分析！求助
用的ABI的定量PCR仪，运行的时候就没有扩增曲线与熔融曲线，分析结果的时候软件出现 “Analysis failed due to: GExsession doesn't exist in context”，求教是什么原因
好的，谢谢，我再重新检查一遍
那请问数据还能用吗
请问同学你这个问题解决了吗，
学术必备与600万学术达人在线互动！
扫描下载送金币关注今日：10 | 主题：287482
微信扫一扫
【求助】荧光定量PCR产物大小问题
页码直达：
这个帖子发布于10年零223天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
以前一直以为荧光定量PCR产物的大小一定要控制在200bp之间，自己的师姐师兄也是这样教的，所以做完RT-PCR的引物好像就没有用啦，今天去中科大生科院，无意中和一位国内很有名气的导师说到这个问题，他的观点是，不是荧光定量PCR的产物一定要控制在200bp左右，其实和普通RT一样也是可以扩大一点片段的，为什么会有这种说法呢，那是因为中国的一些诊断试剂公司为了推出自己的高灵敏度的产品，选择了很小的扩增片段，其实在做科研的时候，大一点的片段更能说明问题，做完RT的引物业完全可以用来做荧光定量PCR，只要在引物中间按照上游引物的方向设计一条20bp左右的片段，最好是跨外显子的做探针就可以啦。我听的也是似懂非懂所以上来请教各位。
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
使用TAqman水解探针时候一般建议反应产物小于300bp,我用的actin引物就是290多的,这是许多国外权威杂志用的序列,一般而言,200以内反应100左右反应效率最高.我在文献上没有见过使用水解探针有大于400的荧光定量PCR产物,但是使用染料法时片断大于500bp的也比较多.可能原因与水解探针工作时对探针萃灭基团切除时的时间一致性有关!,
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
染料法sybrgreen进行实验，可不可以用扩增片段为350bp左右的呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
应该可以，我用sybrgreen做过1000以上的都行，但做多重时，就要尽量小一些，我做过的片段在100-1400都有，有时太短反倒容易出现假阳性
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园