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东胜创新技术通讯 第200412期
聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。
图 1 实时荧光扩增曲线图
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）（如图 2 所示）。
图 2. 荧光定量标准曲线
CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 3 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图 3 阈值线和 CT 值
荧光探针和荧光染料
实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
1．SYBR Green I
图 4 SYBR GREEN I 工作原理 SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 。 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
图 4. SYBR GREEN I 工作原理
SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响 1 。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。
2．分子信标（molecular beacon）
分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（ FRET ）。由于 " 黑色 " 淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图 5 ）。
图 5. 分子信标工作原理
3．TaqMan 探针
TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
图 6. Taqman 探针工作原理
4. LUX Primers
LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号（如图 7 ）。
图 7.LUX 引物工作原理
与 Taqman 探针和分子信标相比， LUX 引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。因为 LUX 引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。
实时荧光定量 PCR技术的应用
实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如 利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。 目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：
1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。
2. 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证
3. 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。 随着实时荧光定量 PCR 技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。
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实时荧光定量PCR过程问题
用ABI7500在进行实时荧光定量时，退火温度一定要60℃吗？还是根据引物来？每次的结果都有黄色的三角符号出现在上面，是引物出现问题吗？
很感谢，还请问在realtime之前需要用引物和cDNA做一下常规pcr确定退火温度和引物可否适用吗？
那麻烦请问您 需要怎样设计引物减少非特异性扩增呢？谢谢
做预实验，先用cDNA在不同的退火温度下做荧光定量，看扩增曲线和融解曲线，用两个曲线最好的温度进行正式的荧光定量。其实严格意义上来说，是要先做标准曲线的，不过由于太麻烦，大家好像都省略了，
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PCR和实时荧光定量PCR这两种有什么区别?希望能稍微介绍一下这两种PCR的原理
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PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右）,DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链.实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.普通PCR和实时荧光定量PCR的不同,是不同在实时荧光定量PCR的系统中加入了荧光染料（SYBR Green 或Taqman 探针等等）.以SYBR Green为例,这种染料可以结合在双链的DNA上,当PCR不断进行时,每一次退火生成的双链DNA也在增加,荧光染料结合也越多,荧光也越强.在机器中有一个探测荧光的探头,可以定量检测荧光的强度,转换成数值.这样就可以实时记录反映体系中DNA的反应情况.
实时荧光定量PCR的结果 亮度越强代表着什么？
体系中的核酸越多。（如果染料足够的话）
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实时荧光定量PCR仪与基因扩增仪一样吗？
&　　实时荧光定量PCR仪与基因扩增仪一样吗？有哪些区别？　　实时荧光定量PCR仪是由控制系统、电源系统、光电系统、模块部件、热盖部件、外壳部件、随机软件组成的适用于所有基于能够在PCR产物生成过程中对产物进行标记荧光的反应的医疗仪器。基因扩增仪又叫PCR仪，很多时候，人们会认为实时荧光定量PCR仪与基因扩增仪是一样，但事实上真的一样吗？它们之间又有哪些区别呢？下面就具体的为大家讲讲。　　荧光定量PCR仪比基因扩增仪（普通的PCR仪）多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，实时荧光定量PCR仪主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，而普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作，而反之就不行了，况且这样代价太大了，一般的实验室都不允许这样做的。总之两者的功能不能互相取代。　　普通的基因扩增仪（PCR仪）只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多，而且运行成本也要低很多。不过不能直接得到扩增结果，还需要做电泳检测。实际中检测遗传疾病，品种分子标记筛选，甚至亲自鉴定等都可以由普通PCR仪完成。　　但是，某些需要定量的实验就必须用到实时定量PCR了。比如检测某些病原物的数量（血液乙肝病毒复制程度），特定基因的表达量（比如结合反转录做的RNA定量分析），某些基因在染色体组中拷贝数（以前往往使用southern blot技术）等等。荧光定量PCR一般不需要对扩增产物进行电泳分析，操作相对简单些，但是耗材实在是贵。简单来说，看有没有用普通PCR仪，看有多少用荧光定量PCR。
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