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关于信号转导研究的若干问题
关于信号转导研究的若干问题1关于信号转导研究的若干问题 郑仲承 中国科学院上海生物化学研究所） （中国科学院上海生物化学研究所）目录 信号以及细胞传递信号的主要“设备” 第一节 信号以及细胞传递信号的主要“设备” 第二节 信号转导系统的特征 第三节 二聚作用是调节信号转导的一个重要机制 第四节 信号转导的生物学效应 第五节 以信号转导为靶的疾病治疗 第六节 走向未来 打信号（Signalling）是生物结间通消息的一种最基本,最原始和最重要的方式。比如，老虎沿着一个圈撒了一泡尿。 这个圈所划定的范围就成为这只老虎的&领地&。别的老虎经过时，闻到这种味道就&识相&地悄悄离去，免遭麻烦。孙悟空 用金箍棒在地上划了一个圈，让唐僧、八戒、沙僧和小龙马待在里面。妖怪来了，想抓走唐僧，却被这个圈发出的万道金 光所逼退。又如，我国古代的烽火台，在外敌入侵时，狼烟四起，发出警报。交战双方下的战书，包括哀的美登书，都传 递了作战的消息。写信、打电话、打手电。发暗示、对口令、对暗号、发 SOS 求救信号也是发消息，同情报的手段。美好 的事情也要用信号来传达。如，蜜蜂告诉伙伴什么地方有美味的花粉时，就在伙伴们面前飞舞。以各种不同的优美舞姿指 示食物的方向、方位、品种、数量和距离等等。鸟类在求偶时，相互欢快地仆翼，顶喙；蛇类在交欢时纠缠盘结的双蛇快 步舞；昆虫的鸣叫等等。愉悦的信号还有下课的铃声、睡觉的号声、开饭的钟声、空调机的马达声等，当然，还有无线电 的歌声，电视机的笑声等等。总之，生物的生命活动离不开信号。 生物的细胞每时每刻都在接触着来自细胞内或者细胞外的各种各样信号。有的信号激奋高昂，促进细胞增殖；有的信 号谆谆劝诱，使细胞向一定的方向分化；有的信号如此迷惘，使得细胞误入歧途，无节制地分裂，&疯长&；有的信号哀徊 低荡，让细胞心甘情愿地去死亡！ 虽然，我们身居闹市，经常在车辆的轰隆声和不绝耳的喇叭声、小贩的叫卖声、鸟叫蝉鸣、打击碰撞、潺潺流水、电 话电视……中煎熬，但是，我们总能我自岿然不动地处变不惊，在这些杂乱无章的信号中找到自己需要的信号，作出正确 的反应，安然地生活。即对有些信号置之不理，对有些信号听之任之，对有些信号一关了之，都有些信号则照此办理，作 出反应。细胞也有一个接受、归纳、分析、筛选、放大、传达、处理和答复(响应)信号的过程与机制，使得细胞最终决定： 是增殖分裂；是分化成熟；是变异追求一时的痛快，求己之生存而不顾其载体的死活，最后落个鸡飞蛋打，统统死光光； 还是干干脆脆地自作了断，一死了之。 可见，信号只是个诱因，生理反应是信号作用于细胞的最终结果。相同的信号作用于不同的细胞可以引发完全不同的 生理反应；不同的信号作用于同一种细胞却可以引发出相同的生理反应。细胞的一切生命活动都与信号有关，信号是细胞 一切活动的始作俑者。因此，对信号转导的研究非常重要，非常有用。无怪乎近几年你也打信号，我也打信号，他、她也 打信号，信号转导研究成为一个发烫的热点。 信号以及细胞传递信号的主要“设备” 第一节 信号以及细胞传递信号的主要“设备” 可以将细胞内的信号转导与电子计算机作比较。那些起着细胞内信号转导通路作用的分子可以视作为细胞内集成电路 的分子转换器(开关)，它们放电时就与适当的信号接受器相连接。想象一下吧，尽管有些差异，电子计算机的操作过程与 细胞内信号转导事件何其相似乃而！二者都有信息的定向流动；二者都有编纂过的语言，并通过它们将信息加以译释；二 者又都有一套套的反应系统，通过这些反应就可以对它们所接受到的输入信号作出响应。当然，有生命的细胞比之电子计 算机要高明得多。设想一下，在任何时刻，会有多少不同的细胞外刺激同时施加于细胞之上！它们驱动了多少细胞内信号 转导通路！但是，在细胞内，所有这些信号通路都有严密的协调关系。显然，细胞内信号转导是一个有严密组织的，并且 是高度网络的过程。 一 作用于细胞的信号 生物细胞所接受的信号有多种多样，从这些信号的自然性质来说，可以分为物理信号、化学信号和生物学信号等几大关于信号转导研究的若干问题2类，它们包括光、热、紫外线、X-射线、离子、过氧化氢、不稳定的氧化还原化学物质、生长因子、分化因子、神经递质 和激素等等。在这些信号中，最经常、最普遍、最广泛的信号应该说是化学信号。 生物体内有各种各样的，能够调节机体功能的生理活性物质，它们大多是在细胞内合成，并分泌出细胞的物质。这些 物质就可以作为化学信号在细胞间传递信息。这些化学信号大部分是水溶性的，它们可以很容易地在体内随血液或体液运 送，但是不能通过细胞膜，需要与细胞膜上的特殊受体结合，在经过几毫秒或者几分钟后被内化而进入细胞；有的是脂溶 性的，特别是激素，它们可以穿越细胞膜进入细胞内，也可以与特殊的载体蛋白，如清蛋白结合在一起通过血液运送到身 体的各个部位，还可以通过受体的作用到达所要去的位点。因此，它们在几小时后还能起作用。这些化学信号及其信号转 导方式可以分为三类。 1，内分泌系统的激素 内分泌系统将来自环境的信号传达到生物体内的各种器官和细胞，在整体上起着综合调节生物体功能的作用。它产生 的化学信号是激素。内分泌系统的细胞产生的激素释放到血液中，经过血流的运送到达靶细胞而发挥特别的作用。这样的 传递方式叫内分泌作用。可见，这种方式有几个特点：A，低浓度――激素在血流中的浓度被稀释到只有 10-8 到 10-10M。 但是它依然能够起作用， 而且低浓度对它们安全地发挥作用也是必须的； 全身性――即激素随血流而扩散到全身， B， 但是， 只被有它的受体的细胞接纳和发挥作用；C，长时效――激素产生后经过漫长的运送过程才起作用；而且血流中微量的激素 就足以维持长久的作用。 2，神经系统的神经递质 在神经系统中，神经细胞与其靶细胞之间形成一个叫突触的有限结构。突触是神经细胞胞体的延伸部分，神经细胞产 生的神经递质在突触的终端释放出来。突触后膜上有特殊的受体，突触前面的细胞也有受体，以调节神经递质的释放。可 见，这种方式有作用时间短、作用距离短和神经递质浓度很高等特点。 3，生长因子和细胞因子等的旁分泌系统或者自分泌系统 近年发现有一个介于上述二者之间的中间型方式，即某些细胞产生并分泌出细胞生命活动必需的生理活性物质，这些 物质通过细胞外液的介导而作用于其产生细胞的邻近细胞。当这些物质作用于异种细胞时，叫旁分泌作用；作用于同种细 胞时，叫自分泌作用。这样的信号分子起着局部的化学调节剂作用。 二 信号的归宿 从各种信号刺激所导致的细胞行为变化来说，信号的分类以及信号的最终归宿是： （1）细胞代谢信号――它们使细胞 摄人并代谢营养物质，提供细胞生命活动所需要的能量； （2）细胞分裂信号――它们使与 DNA 复制相关的基因表达，调节 细胞周期，使细胞进入分裂和增殖阶段； （3）细胞分化信号――它们使细胞内的遗传程序有选择地表达，从而使细胞最终 不可逆地分化成为有特定功能的成熟细胞； （4）细胞功能信号――比如，使肌肉细胞收缩或者舒张，使细胞释放神经递质 或化学介质等，使细胞能够进行正常的代谢活动，处于细胞骨架的形成等等； （5）细胞死亡信号――这是细胞一生中发出 的最悲壮、最惨烈的信号。这类信号一旦发出，为了维护多细胞生物的整体利益，为了维护生物种系的最高利益，就在局 部范围内和一定数量上发生细胞的利他性自杀死亡！ 可以说，所有重要的生命现象都与细胞内信号转导有关。细胞随时都在接受如此多样的信号，它必需对这些信号进行 汇集、分析、整理、归纳等工作，并且能够作出最有利于细胞生存和发展的反应，才使各个细胞或者多细胞生物能够与周 围环境之间保持高度的和谐与统一，使各种生命现象得以绚烂地呈现，使生命过程得以完美地进行。而信号转导一旦失误， 就会产生疾病，甚至危及生命！那么，信号转导究竟是怎样导致细胞，乃至生物体作出反应，引发它们的行为发生改变的 呢？其中有没有更本质， 更基本的共同规律呢？科学家对细胞内信号转导分子机制的专门研究总共只有 12 到 15 年的时间。 最早，由于对病毒致癌的分子生物学机理加深理解，开始认识到细胞外的刺激会介导细胞内信号转导过程和引发细胞命运 的深刻变化。而在近来，则由于研究者们共同努力地发现了许多参与信号转导的生物分子，阐明了这些分子的结构与功能 关系，才对细胞内信号转导机制的认识前进了一大步。现在认为，说到底，细胞内信号转导的机制就是提供一种生物化学 和分子生物学的分子生物学的分子机制，以支持和帮助细胞下决心对信号作出某些决定的过程，例如调节细胞分裂和调节 细胞分化等等细胞的最终功能。而且，已经很明确地知道，细胞只有能够传递专一的信号，才能决定其发育的前景。所以， 如果没有这些机制，细胞就会在复杂纷繁的外界刺激面前束手无策，无所适从；茫无头绪，不知所措；迟疑不定，一筹莫 展；转辗徘徊，不知所终。 三 构成信号转导系统的要素关于信号转导研究的若干问题3构成信号转导系统的各种要素必须具有识别进入信号、对信号作出响应并发挥其生物学功能的作用，它们的任务象接 力赛的传棒手更要多得多，即不仅仅是将棒接过来，传下去就完事，还需要具有识别、筛选、变换、集合、放大、传递、 发散、调节信号的全套功能。这些功能不是仅靠个别蛋白质就能够完成的，需要有一个体系，由一些蛋白质协同地进行操 作。这个细胞内的信号转导系统应当包含信号转导最必需的关键组分，它们有： （1）接受细胞外刺激并将它们转换成细胞 内信号的成分； （2）有序地激活一个或者有限几个“唱主调”的信号转导通路，以译释细胞内的信号； （3）使细胞能够对 信号产生响应，并作出功能上或发育上的决定（如基因转录，DNA 复制和能量代谢等）的有效方法； （4）将细胞一生所作 出的所有决定加以联网的方法，这样，细胞才能对在任何特定时刻作用于它的、种类繁多的信号作出协同响应。下面简要 叙述其中最重要的某些要素。 (一) 受体 受体无疑是这个系统中最重要的一员，细胞是通过它表面的相应受体接受来自其外界环境的细胞因子和生长因子信号 的。正是它，首先识别和接受外来信号，启动了整个信号转导过程。 1 膜受体 这类受体存在于细胞膜上，通常由与配体相互作用的细胞外域、将受体固定在细胞膜上的跨膜域和起传递信号作用的 细胞内域三部分构成。 这些受体通常是跨膜的蛋白质； 然而， 也有一些可以是通过聚糖磷脂酰肌醇(GPI)键挂在细胞膜上的， 例如睫状神经营养因子(CNTF)的受体。其主要种类有 5 种。 (1) 本身具有酪氨酸激酶活性的受体酪氨酸激酶(RTK)家族， 在与配体结合后会发生寡聚作用， 并据以调节激酶活性的受体。 属于这一类的有多肽型的生长因子受体，如 EGF，PDGF，CSF 等。这类都是一次跨膜的受体。只由一条肽链组成。但是，胰 岛素和胰岛素样的生长因子－1(IGF-I)的受体却有 a 和 b 两种亚基，并由各两条亚基组成四聚体型受体。其中，b 亚基具 有酪氨酸激酶活性。而 IGF-II 和 NGF 的受体虽然也由一条一次跨膜的肽链组成，却没有这个激酶活性； (2) 本身没有酪氨酸激酶活性，但是通常与某些细胞内的酪氨酸激酶结合在一起，或者在与配体结合后能够罗致细胞内的 酪氨酸激酶，从而启动细胞内信号转导的受体。它们主要是细胞因子的受体，也是一次跨膜型受体。与配体相互作用后也 会发生二聚作用； (3) 能够激活 G 蛋白（一种与鸟苷三磷酸结合的膜蛋白质） ，能够在细胞内产生第二信使并据以改变其他酶活性的受体。这 是一类七跨膜型的受体。已经知道的第二信使有 cAMP，Ca++，IP3（肌醇 1，4，5-三磷酸） ，DAG（二酯酰甘油）等。改变 第二信使的含量的化学信号可以分为促进 cAMP 生成，抑制 cAMP 生成和与 Ca++，IP3，DG 有关的三类。在视网膜的杆状细 胞中视紫质接受光，以 cGMP 作为第二信使(见下面)。G 蛋白介导的信号转导反应是一种慢速的过程，经历时间长，但是敏 感性高，灵活性大，花样更多； (4) 由几个具有 2，4 或 5 个跨膜域的亚基集合而成的，形成离子通道的受体。它们与信号结合后就可以对离子的流入或流 出细胞进行调节。骨骼肌上的烟碱型乙酰胆碱受体是它们的代表，它形成钠离子通道。腺苷酸受体则有两类，一类是七跨 膜型的，另一类是二跨膜、离子通道型的。离子通道型受体介导的信号转导反应是一种快速的反应，配体与受体结合，就 打开了通道，如同闸门被打开一样，离子就通过细胞膜而流动； (5)由功能不同的几个多肽链集合形成的受体。 大多数受体是这样的， 包括淋巴细胞活素受体和 T 淋巴细胞的 T 细胞抗原受 体。它与具有 G 蛋白功能的蛋白质可能会有相互作用； 2 细胞内受体 与上述几种膜受体不同，甾体激素等的受体是细胞内受体，它或者在细胞质中，或者在细胞核中。如上所述，甾体类 物质是脂溶性的，它们能够通过细胞膜，直接进入细胞内；也可以借助于某些载体蛋白，进入细胞内。在细胞内，它们与 相关受体结合，并直接作用于靶分子。 (二) 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将 ATP 的 g 磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨 基酸残基的特异性， 将这些激酶分为 4 类。 其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。 这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为 250-300 个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共 同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保 守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有 11 种这类高度保 守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最 N-端的 I 开始,到最 C-端的 XI。对这些酶的结晶进行 X-射线结关于信号转导研究的若干问题4构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域 I,II 和 VII 在结合 ATP 中起重要作用；而亚域 VIII 则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域 VIII 中，紧靠关键模体上游 的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE-或 -KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 1 蛋白质酪氨酸激酶 蛋白质酪氨酸激酶亚组是蛋白质激酶家族中一个最重要的蛋白质家族， 它们至少有 10 个结构变种。 把它们归为一个亚 组依据的是它们的激酶结构域的特异性，而正是这些结构域使它们能够识别专一底物中的酪氨酸残基。这个功能域强大的 生理催化活性可以满足范围很广的生理要求，包括转导细胞外的生长和分化刺激，和细胞对胞内氧化还原势的响应等等功 能。这个家族的成员都由传递感觉的、起调节作用的和起效应作用的三种结构域组成。这类激酶又可以分为两种。 (1)生长因子受体 PTK（受体型酪氨酸激酶或 RTK）――是这个家族中被了解最多的一个结构变种。这些信号转导分子的结 构有利于信息从细胞外单向地流入细胞内。这个过程有配体－受体的专一性。哺乳动物基因组中有 70 个 PTK 家族成员(而 STK 的有 200 个)，由于在属于其他后生生物门的生物中也发现 PTK,使得其家族成员猛增到接近 100 个。这也明确地表明， 这类蛋白质在导致细胞分化和发育的细胞内信号转导过程中起着十分重要的作用。 作为一般的规律，RTK 的胞内域都有一个或者几个专一的酪氨酸残基，它们在配体与 RTK 胞外域结合时被磷酸化了。 这些酪氨酸残基通常位于 PTK 域的 C-末端和蛋白质分子的 C-端末尾之间的区域内。有几类 PTK 还有额外的蛋白质结构域， 它们插在两个 PTK 域之间。这种排列方式已经成为一个常见的特色，许多底物的酪氨酸残基就位于这个结构域。有这种排 列方式的最好例子就是血小板来源的生长因子受体(PDGF-R)家族。被广泛接受的看法是这些酪氨酸自身磷酸化位点是在与 SH2 域结合的位点之中。 因此， PDGF 受体的自身磷酸化位点就是它与磷脂酶 C-g1,GTRase 激活蛋白(GAP),PI3’ -激酶和 SRC 酪氨酸激酶等的 SH2 域结合的位点。而位于 PI3’激酶 p85 亚基的 SH2 域可以识别 EGF-R,CSF1-R 和 c-kit 上面的磷酸酪氨 酸。这些受体将各种激酶招致身边是配体与受体相互作用后发生的第一波信号转导分子集聚，此后，第二波，第三波... 的信号转导分子集聚将更深入地进行，直至信号转导的完成。 (2) 非受体型的蛋白质酪氨酸激酶――非受体型的蛋白质酪氨酸激有 9 个亚族：SRC 、Tec 、Csk 、Fes 、Abl、Syk /ZAP-70、 Fak 和 JAK。每一个结构变种看来都是特别设计的，以在细胞内特殊的代谢过程中起作用。虽然在大多数情况下并不清楚它 们每个成员的确切作用，但是，它们都有特别保守的结构域，例如 SH2 和 SH3 同源域等，这些结构域可能在信号转导中起 重要作用。 (3)SH2 域――SH2 域是酪氨酸激酶的特殊的功能域。SH2 指与 SRC 同源的 2 域，是无催化功能的蛋白质组件，其大小约 100 个氨基酸残基。开始它作为一种保守域在许多胞浆的 PTK，包括病毒癌基因 v-fps/fes 和 v-src 中发现。虽然它们看来不 具有内在的催化活性，但是，很快就发现这个亚域在信号转导过程中是非常重要的，因为在被激活的、癌基因来源的 PTK 的下游分子中都有这个结构域！在正常情况下，Fujinami 肉瘤病毒编码的转化蛋白 p130gag-/fps 可以将细胞转化为癌细 胞，但是，如果这个蛋白质的 SH2 域发生突变，其转化细胞的能力就被抑制。因此,PTK 的信号转导既需要有功能的、活化 的 PTK 域，又需要有功能的 SH2 域。SH2 域的功能是专一地结合含有磷酸酪氨酸残基的模体。因此，SH2 域与存在于各种各 样的细胞内信号转导蛋白上的磷酸酪氨酸残基结合。这种结合有很高的亲和力；还有很大程度的序列专一性，即总是结合 在紧挨着蛋白质的 N-末端和紧挨着 C-末端的磷酸酪氨酸。 如果一个特殊的细胞外信号要能够产生适当的生理反应的话， 那 么，细胞内信号转导必须有专一性和有选择性地加以协调。SH2 域与磷酸酪氨酸的结合就这样地高亲和力和很专一的。这 种专一性来自于 SH2 域对磷酸酪氨酸残基周围的氨基酸的识别， 尤其是磷酸酪氨酸残基 C-端的 4 个氨基酸内的氨基酸残基 对底物的专一性特别重要。还需要指出的是，含有 SH2 域的不同的分子可以结合在同一个受体的不同位点上；而同一个含 SH2 域的分子可以因为响应各种不同的生长因子或者细胞因子而被激活。因此，只要更换数量有限的信号转导分子就可以 实现范围很广的细胞响应，每个响应都是为特定的刺激因子“量身定制”的，也是为对这种刺激发生响应的细胞类型“定 做”的。 总而言之，PTK 域/SH2 域组合对于真核细胞中信号转导专一性的产生是至关重要的。看来，这种专一性以两种方式产 生：第一是 PTK 域选择磷酸酪氨酸底物，第二是 SH2 域选择性地结合特殊的磷酸酪氨酸残基。这种双重标准的选择专一性 就在细胞外配体与受体结合时激活了专一的信号转导途径。 丝氨酸/ 2 丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶 除了蛋白质酪氨酸激酶外，在信号转导中起着重要作用的是丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶。它也有许多种类。最常见的如 Raf-1，是已知的许多激活 MAPKK 的细胞激酶之一，在细胞对刺激产生增殖响应的 ras 信号转导通路中起着关键作用。被激关于信号转导研究的若干问题5活的 ras(即 Ras-GTP)就结合在 Raf-1 的 N-末端域上。在与 Ras-GTP 结合并且其酪氨酸被磷酸化后，Raf-1 就激活 MAPKK。 例如，在 IL-2 刺激下，Raf-1 的酪氨酸被激活的 SRC 激酶(pp60SRC)磷酸化。这个磷酸化作用对于 Raf-1 与 Ras-GTP 结合， 并激活激酶 MAPKK 是绝对必须的。许多因子都可以充分地激活 Raf-1，例如，蛋白激酶 C(PKC)，ras-GTP 和被激活的 SRC 激酶。然而，这些因子并不总是导致同样的最终结果，相反地，常常产生各种各样不同的响应。比如，PKC 将 Raf-1 磷酸 化，随后用佛波酯处理，尽管这使得 Raf-1 的自身磷酸化增加了，但是，MAPKK 没有激活。而一旦 MAPKK 被 Raf-1 激活， 它就会把目标瞄准 MAP 激酶的异构体。 这些胞浆丝氨酸/苏氨酸 MAP 激酶的异构体， Erk-1 和 Erk-2 被激活和向细胞核转 即 移是信号转导通路上游 ras 激活的最终结果。如上所述，Raf-1 激活了 MAPKK，后者则将 MAPK 的苏氨酸和酪氨酸磷酸化而 将它激活。然后，MAPK 磷酸化，并激活细胞核的转录因子，包括 c-Myc、c-Jun、c-Fos、核因子-IL-6(NF-IL-6)、细胞质 磷脂酶 A2(cPLA2)、EGF-R 和蛋白质激酶――如 c-Raf-1、MAPKK 和 p90rsk(蛋白磷酸酯酶-1，PP-1 的糖原结合亚基)。这样 的信号转导通路是将各种各样的信号转导事件分割成一个个独立部分的例子，正是通过这些活动，激活了的激酶才能转位 到各个分割的空间，转录因子才得以驻留在细胞核内。 3 其他激酶 还有一些激酶，虽然不能在整个信号转导通路起核心作用，但是，它们在第二信使的生成等方面是必不可少的，因此， 也是信号转导通路不可缺少的成分。 它们的代表有磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3-K)。 PI3-K 是一个由催化亚基(p110)和连接亚基 (p85)组成的酶，它将磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇-4-磷酸〔PI(4)P〕或磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸〔PI(4,5)P2〕上的 D-3 位点 磷酸化,分别产生 PI(3)P、PI(3,4)P2 和 PI(3,4,5)P3。p85 亚基的氨基端有一个 SH3 域，在中间有功能未知的 Rho-GAP 同 源域，还有两个 C 端的 SH2 域。已经知道，PDGF-R 上的“激酶插入片段” ，即磷酸酪氨酸残基 Tyr740 和 751 是与 PI3-K 的 SH2 域有高亲和力的结合位点。此外，还有一些其他的与 p85 亚基的 SH2 域结合的磷酸酪氨酸位点，如在激活的 IRS-1 上， 与 TCR 结合的 CD28 上和 CSF1-R 上都有这种位点。 连接亚基 p85 上面的 SH2 域与被激活的受体结合， 然后， 它才能通过 SH3 域将 p110 催化亚基招致身旁。PI3-K 的细胞功能可能是它参与有丝分裂信号的转导。激活的 PDGF-R 能够与 PI3-K 稳定结 合，结果使得丝氨酸/苏氨酸激酶――p70S6K 被激活。后者是血清诱导的新蛋白质合成，c-Fos 的诱导合成和细胞周期进入 S 期所必须的。 磷脂酶 Cγ的异构体――PLCγ是一种蛋白质。它的 783 位酪氨酸被磷酸化后，就能够将 PI(4,5)P2 裂解为肌醇三磷酸 (IP3)和二脂酰甘油(DAG)。所以，它的作用与 PI3-K 正好相反。但是，IP3 和 DAG 也是非常重要的第二信使。它们分别介 导钙离子从其细胞库中释放和激活蛋白激酶 C（PKC） 。前者看来不是有丝分裂响应所必须的，因此 PKC 的激活才导致有丝 分裂。比如，有很强的致肿瘤作用的佛波酯就能激活 PKC。此外，被 DAG 激活的 PKC 异构体的过量产生就会导致细胞生长 失去调控和细胞转化。 PLCγ1 有两个 SH2 域， 它们与活化的 EGF-R 的 C-末端的 992 位磷酸酪氨酸相互作用， 还和 EGF-R 上面的 766 位磷酸酪 氨酸相互作用。C-末端的 SH2 还能够结合相当于 PDGF-R 上面 1021 位酪氨酸的磷酸肽。还有一些其他激酶将在相关部分加 以介绍。 4 连接蛋白 连接蛋白在信号转导通路起着重要的桥梁作用， 它们把被配体激活的受体与其下游的信号转导分子相连接， 沟通整条 信号转导通路。比如，GRb2/Sos 复合物。GRB2 是一个连接蛋白，它有一个 SH2 域，其侧面是两个 SH3 域。它与 EGF-R ,胰 岛素受体(IR),胰岛素受体底物-1(IRS-1)信号分子等等的磷酸酪氨酸残基结合。在 EGF 刺激之下，GRB2 通过它的 SH2 域 EGF-R 结合，然后，又通过它的 SH3 域与核苷酸交换因子 Sos 结合。这样，Sos/GRB2 复合物由于与膜结合的 ras 鸟苷三磷 酸酯酶(GTPase)相互作用而被招至质膜。由于 Sos 固有的活性在 EGF 刺激后并没有增加，看来这个转位过程对 Sos 的激活 是必要的。接着，Sos 可以催化 ras 上面的 GDP 与 GTP 的交换，从而激活了 ras。最终导致细胞的增殖。还有 ras-GTPase。 它是一个对酪氨酸激酶与丝氨酸/苏氨酸激酶之间的信号转导通路极其重要的分子转换器，这些通路导致细胞分化或者增 殖。 许多人类的肿瘤有被激活的 ras 癌基因就充分地说明了 ras 是细胞分化或者增殖的强力调节者。 微量注射能够中和 ras 的抗体就可以阻断酪氨酸激酶与 ras-GTPase 之间的联系。但是，它只能阻断酪氨酸激酶类癌基因造成的细胞转化，而不能 阻断丝氨酸/苏氨酸激酶类癌基因造成的细胞转化。看来，ras- GTPase 的主要功能是控制 MAPK 级联反应。 (三) 将信号转变和放大的 G 蛋白 配体与受体结合后，需要通过一类叫做传达器或者转换器的调节蛋白的介导才进一步激活过程。起着转换器作用的蛋 白质是与 GTP 结合的蛋白质(G 蛋白)。关于信号转导研究的若干问题 1 G 蛋白的分类6生物体内的 G 蛋白有三类：(1) 由 a ，b 和 g 亚基各一个组成的异源三聚体。a 亚基有与鸟苷酸结合的活性，还有弱 的 GTP 水解酶活性，它决定着 G 蛋白的个性，属于这个群体的 G 蛋白有 10 种以上。而 b 和 g 亚基则由各种 G 蛋白所共用。 它们作为复合物而存在，看来，没有它们，α亚基不能被激活。也可能通过它们将α亚基固定在细胞质膜上，这就提高了 α亚基的局部浓度，有利于 G 蛋白与受体结合；(2)有些分子量在 2 万左右的单一多肽，它们也有分解 GTP 的活性，看来它 们是低分子量的 G 蛋白。 包括癌基因 ras 的产物在内的不下于 15 种蛋白质属于这种 G 蛋白类， 估计它们有丰富多采的作用。 (3)蛋白质合成系统必需的因子，决定蛋白质分泌路径和分泌方向的因子。与信号转导有关的主要是(1)和(2)类。 2 G 蛋白的作用机制 G 蛋白有两种构象：与 GTP 结合时的激活态和 GDP 结合时的钝化态。通常情况下，绝大多数 G 蛋白是与 GDP 结合的钝 化型。与 GDP 结合的 G 蛋白能与各种各样的受体相互作用，这种相互作用增加了受体与配体的结合亲和力。一旦受体与配 体结合，受体被激活，a 亚基就与 b 和 g 亚基分离，同时离开受体。由于解离下来的 a 亚基与 GDP 的结合亲和力下降， GDP 就能够与游离在细胞内的 GTP 发生交换，产生与 GTP 结合的激活型的 G 蛋白。被激活的 G 蛋白就与效应蛋白相互作用， 改变了第二信使的浓度，从而发生信号转导响应。如此这般，配体与受体短短几毫秒时间的接触可以延长为几十秒，乃至 更厂时间的反应，使输入的信号可以被大大地放大。 3 与 G 蛋白相互作用的效应蛋白 G 蛋白的α亚基有许多种，它们分别与不同的效应蛋白相互作用，调节它们的生物活性。Gs 激活腺苷酸环化酶（AC） ， 起着提高 cAMP 浓度的作用。Gi 则抑制腺苷酸环化酶活性，降低 cAMP 含量。有一种叫做 Gt 的，在视网膜杆状细胞的视紫 红质接受光时，起着激活 cGMP 环化酶的作用。Gp 激活磷脂酶 C，与 IP3 和 DAG 的产生有关。此外，离子通道，PLA2（它被 水解后产生花生四烯酸，而这个酸又是前列腺素、血栓恶烷和白三烯的前体，是神经元突触前的介质）和各种转运蛋白（如 葡萄糖转运蛋白、镁转运蛋白和钠/质子交换蛋白）等等都受 G 蛋白的调节。 (四) 细胞内的第二信使 第二信使是指受体被激活后在细胞内产生的介导信号转导通路的活性物质。已经发现的第二信使有许多种，其最重要 的有： 1 cAMP cAMP 是最早确定的第二信使，在 1958 年被 E WSutherland 发现，与糖原的生理作用有关。它是细胞膜的腺苷 酸环化酶作用 ATP 后的产物。可以被细胞内的 cAMP 磷酸二酯酶水解生成 5’-AMP。通常 cAMP 的细胞内浓度为 10-6M 以下。 它的作用是激活依赖 cAMP 的蛋白质磷酸化酶(PKA)。 组成 PKA 的有催化亚基(C 亚基)和调节亚基(R 亚基)两种亚基。 通常它以两个 C 亚基和两个 R 亚基形成四聚体方式存在。 这样的全酶是没有活性的。当每个 R 亚基与 2 个 cAMP 结合后，2 个具有激酶活性的 C 亚基就作为单体解离出来。这样的 C 亚基可以将许多底物的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化。据认为，在所有的真核细胞中都有 PKA，而且 C 亚基的底物看来也不 象有种属和细胞专一性。那么，各种细胞特有的 cAMP 作用是如何实现的呢？这就成为一个难解的谜。现在对此有两点可能 的解： （1）PKA 有 I 型和 II 型两种异构体，它们的差别在于 R 亚基有所不同。因为各种各样的 R 亚基存在于细胞内的不同 局部区域，所以解离下来的 C 亚基就能够使不同的底物被磷酸化； （2）针对造成 cAMP 浓度变化的刺激，细胞会作出何种应 答反应，看来取决于 PKA 的底物。即，各种细胞内预先存在有种类和数量各不相同的 PKA 底物，这样，在不同情况下，cAMP 的作用有所不同，使得底物下游的各条信号转导通路也不同。 此外还发现，在细胞内 cAMP 浓度上升时，既会发生细胞增殖停止的情况(主要见于纤维母细胞和造血细胞)，也会发生 促进细胞增殖的情况(主要见于上皮细胞和内皮系统的细胞)，可见，情况是很复杂的。 2 钙离子 在处于静止期的细胞内，游离钙离子的浓度是 10－8～10－7 M，保持在很低水平。而细胞外的钙离子浓度是 10－3 M。这样，在细胞内外钙离子浓度存在有 104～105 倍的梯度。在信号刺激后，细胞内游离钙离子的浓度上升到 10－ 6 M 的水平。造成这种上升的原因是细胞内储存的钙离子被释放，以及细胞外的钙离子流入细胞。只有在细胞膜上的钙通 道被打开，或者细胞被激活时，细胞内的钙离子浓度才会瞬时上升。 细胞内的钙离子必须与蛋白质结合才能发挥作用。细胞内有各种各样的能够与钙离子结合的蛋白质，1953 年垣内在大 部分的非肌肉细胞中发现的钙调蛋白被认为是与钙离子相互作用的主要蛋白质。每一个分子的钙调蛋白可以结合 4 个钙离 子。一旦二者结合，就引起钙调蛋白构象的改变，从而影响钙调蛋白的功能。 钙调蛋白是如何起作用的呢？原来，钙调蛋白的结合蛋白有 2 类。一个是酶，被钙离子－钙调蛋白复合物激活的酶以关于信号转导研究的若干问题7依赖钙调蛋白的蛋白质磷酸化酶 II(激酶 II)和肌球蛋白轻链激酶为代表。 另一个是和细胞骨架相关的蛋白质， 它们有 MAP2 和作为 t 因子与微小管结合的调节蛋白，它们在被激酶 II 活化后，就与钙离子－钙调蛋白复合物直接结合，于是微小管 就与肌动蛋白纤维解离。可见，这些蛋白质与细胞骨架的形成与功能有关。说明信号转导可以调节细胞的结构。 3 磷脂质代谢 1953 年 Hokin 夫妇在鸽子胰脏切片中发现，用乙酰胆碱刺激可以促进 32P 参入磷脂质，说明对化学信号的应答与构成 细胞膜成分的磷脂质的代谢有关。以后知道，这些磷脂质是占细胞膜磷脂质不到 5％的微量成分，即肌醇磷脂质。于是， 把这种响应叫做磷脂酰肌醇(PI)应答(PI 应答)。 1975 年 Michell 发现细胞应答刺激时都有细胞内游离钙离子浓度上升的现 象，于是产生由于 PI 分解使钙离子由细胞外流入细胞内的见解。 肌醇磷脂主要有三类：磷酸肌醇(PI)，磷酸肌醇－4－磷酸(PIP)和磷酸肌醇-4，5－二磷酸(PIP2)。PIP，PIP2 占全部 磷脂质的 1％不到。通过它们的代谢，在细胞膜附近的信号转导系统中起着重要作用。在接受化学信号后，磷脂酶 C(PLC) 激活，将 PIP2 水解，生成二酰甘油(DAG)和肌醇－1，4，5－三磷酸(IP3)。IP3 与钙通道上的受体结合，将钙离子储存库 中的钙离子释放到细胞质。IP2 进一步代谢为 IP4(肌醇－1，3，4，5－四磷酸)，它作用于细胞膜，引起细胞外的钙离子流 入细胞内，使得钙库中的钙离子浓度维持高水平。 此外，1979 年西冢发现 PIP2 分解产物之一的 DAG 可以激活依赖钙离子和/或磷脂质的蛋白质磷酸化酶(C 激酶，PKC)。 C 激酶在微量的钙离子介导下，与细胞膜的磷脂酰丝氨酸(PS)结合，形成钙离子－PS－酶三元复合物。DAG 结合在这个复合 物上就明显地增加了 PKC 的活性。所以，DAG，cAMP 和钙离子三者连续地作为的第二信使而起作用。最近，提出一个在细 胞应答时必需维持一定量 DG 的机制。并提出磷脂酶 D 作用于磷脂酰胆碱(PC)，生成磷脂酸(PA)的反应通路。作为第二信使 的 DAG 的主要功能是激活 PKC，此外，它还被脂酶分解为花生四烯酸(前列腺素，凝血烷等的前体)而游离出来，还可以引 起 PI 专一的磷脂酶 C，磷脂酶 A2 活化，和降低细胞膜流动性等。 PKC 至少有 7 种，而且被 PKC 磷酸化的底物有细胞膜受体，细胞骨架蛋白，酶，核蛋白质等等。进一步，还发现了强 力的致癌剂，如 TPA 等的受体。说明 PKC 在调节细胞增殖中起着重要作用。 综上所述， cAMP，钙离子和 AG 等细胞内的第二信使可以激活各种各样，专一的蛋白质磷酸化酶。它们有的将功能的 蛋白质的丝氨酸和和苏氨酸残基磷酸化，有的将底物磷酸化。它们在信号转导通路中起的作用都值得研究。 归纳上面所说的，担负信号转导功能的信号转导系统可以一般化地概括为四个组分：检测器――信号的接受和检出， 这是受体的主要任务；效应器――使信号产生最终的效果，比如腺苷酸环化酶或磷脂酶 C 等可以起到这种作用；转换器― ―控制着信号的时间和空间。比如 G 蛋白，它决定了 GTP 水解的速度，还决定了效应物的被激活时间。其结果不仅使输入 的信号被大大地放大了，也起到信号计时器的作用；调谐器――它修饰信号转导通路的成员，如磷酸化；协调多条信号转 导通路的相互关系，也是在配体存在的情况下使信号转导通路保持连续畅通的要素。 第二节 信号转导系统的特征 在细胞中有许多生物反应通路，比如物质代谢通路，基因表达通路和 DNA 复制通路等等，现在又知道还有信号转导通 路。这些通路都是由前后相连的生物化学反应所组成，前一个反应的产物可能作为下一个反应的底物或者发动者。那么， 它们之间是否有所不同呢？应该说，信号转导通路比代谢通路等通路要复杂得多，它主要表现在：(1)人们可以通过示踪技 术检测出代谢底物化学转化的连续步骤，但是不能够直接用这种方法来研究信号转导。因为在信号转导通路中输入信号的 化学结构与信号的靶的结构一般是没有关系的。实际上，在信号转导通路中，信号最终控制的是一种反应，或者说是一种 响应；(2)与代谢反应等不同，信号的化学结构并不对其下游的过程产生影响。而代谢底物或者基因转录调节因子的构象会 影响各自相关通路的进行；(3)与依赖模板的反应，如基因转录和 DNA 复制不同，在信号转导通路中不存在对全过程的进行 和结局起操纵作用的模板；(4)其他通路常常是由线性排列的过程组成，一个反应接着另一个反应地，沿着既定的方向依次 进行，直到终止。可以说，它们是直通式的，纵向交流的。而信号转导通路是非线性排列的。实际上，许多信号转导通路 可以通过一系列的蛋白质与蛋白质相互作用形成一个网络。可以说，它们是全方位地交流的。所以，我们必需研究和了解 信号转导通路的特性，以更好地驾御它们。 （一）信号转导通路的一般特性 1，信号转导分子存在的暂时性 一般而言，信号转导通路有这些特性： 因为打信号只要一下子就够了。比如，特工用手电筒发信号，不能不仃地闪光，否则一定会被抓住。对细胞的刺激也不能持续不断地进行，否则细胞没有时间去思考该如何响应。因此，许多信号蛋白质的半关于信号转导研究的若干问题8率期都很短， Fos 只有 2 小时； 如 c-fos 基因表达在刺激后 2 小时就仃止； junB， erg-1 的表达在刺激后 14 小时仃止； c-jun 则在 6 小时。尽管如此，这些基因产物的作用时间却是很长的 。如，c-fos 诱导的与 AP-1 结合的活性可以持续增达 6 小 时以上； 2，信号转导分子活性的可逆性变化 3，信号转导分子激活机制的类同性 4，信号转导通路的连贯性 被激活的各种信号转导分子在完成任务后又回复钝化状态，准备接受下一波的刺 比如，Fos 的激活要其丝氨酸和苏氨酸的磷酸化；JAK 激活要其酪氨酸磷酸化。在 激。它们不会总处在兴奋状态。比如，激酶的磷酸化与去磷酸化，就有磷酸酪氨酸磷酸酯酶在调节着； 传递信息后又都要去磷酸化。可见，磷酸化和去磷酸化是绝大多数信号分子可逆地激活的共同机制； 信号转导通路上的各个反应相互衔接，形成一个级联反应过程，有序地依次进行，直至完 一条信号转导通路的总时间有多少？恐怕还难以说清。不过，看来不会 成。其间，任何步骤的中断或者出错，都将给细胞，乃至机体带来重大的灾难性后果； 5，作用的一过性与效果的永久性的有机统一 很长。因为，编码转录因子的原癌基因的诱导只有几到几十分钟，许多功能基因的被诱导过程也是以小时计算的。这么点 时间对整个生命长河来说简直只是一瞬间而已。但是，刺激经由信号转导通路所造成细胞增殖、分裂、分化、成熟、恶变、 转化，或者自我凋亡等等效果却往往是无可挽回的，甚至是一去不回头的。由此可见，信号转导过程一定受到严格的调节 控制。而任何对细胞的不经意刺激，甚至潇洒地抽支烟，好奇地吸口毒品，对细胞，对个体，都可能造成悔之莫及的结果！ 要小心啊！ 6，网络化 如果说，人类社会进入信息高速公路时代是由于电子计算机发展与普及的结果，那么，这也只是最近才开始 的过程。更毋庸说，这条公路还远远没有达至地球上每一个有人的地方。但是，自从有生命以来，特别是有细胞以来，细 胞就会对环境和细胞内的刺激作出反应，即有信号转导通路。正如上面说到的，细胞内存在有一张很大的，由许多个信号 转导通路组成的网。它也就是细胞内的信息高速公路，它早在几十亿年以前就出现了。在这张网中，各条通路相互沟通， 相互串连，相互影响，相互制约，相互协调，相互作用。形成你中有我，我中有你，一呼百应，一唱百喏的局面。往往是 牵一发而动全身，一荣俱荣，一损俱损。这样，细胞才能够对各种刺激作出迅速而准确的响应，才能因应环境的变化而变 化。 也正因为这样， 要想了解信号转导的基本规律有如必须依靠阿里阿德涅 （Ariadne） 线轴才能找到走出迷宫的道路一样。 可是这个线轴又在哪里呢？ 7，专一性 鉴于各条信号转导通路有共同的信号转导分子，鉴于细胞内存在有信号转导通路网络，那么，为什么不同的 刺激能够产生特殊的细胞响应呢？这说明，信号转导有专一性。有赖于此，细胞能够对不同的刺激作出不同的反应。 在这些特性中，网络化和专一性无疑是最重要的。下面就对它们略加分析。细胞内的各种信号转导通路是相互联系的， 形成一张遍布整个细胞的信号转导通路网络。 （二） 细胞内信号转导通路网络的分子基础 构成细胞内信号转导通路网络的分子基础至少有两个。 不同种类的受体(例如， RTK)用共同的组分发信号 1 不同种类的受体(例如，细胞因子受体和 RTK)用共同的组分发信号 被激活的细胞因子受体可以将胞浆的蛋白质酪氨酸 激酶（PTK）罗致到自己身边，并将它们激活。从被激活的 PTK 在发动特殊信号转导通路方面所起的核心作用，人们意识到 细胞因子受体以及 RTK 下游的信号转导手法一定都是非常相同的。实验证明的确是这样，二者都以罗致含有 SH2 的信号转 导分子为基础建立整条信号转导通路。还知道，不仅仅在手法上相同，而且它们所建立的每一条信号转导通路所罗致的组 分也有共同的功能。例如，CSF-1、PDGF 和 EGF 等生长因子与它们各自的蛋白质酪氨酸激酶型受体结合后，就使得 JAK 家 族的特殊成员发生酪氨酸磷酸化反应，并且，最终激活含有特定 STAT 的转录因子复合物。进而言之，这种功能上的重叠可 以进一步延伸至细胞因子受体所利用的下游信号转导分子。因为，有证据表明，许多以前认为只能由受体型的 PTK（RTK） 激活的细胞内信号转导分子也能与细胞因子受体结合。 比如，EPO，IL-3 和 steel 因子都可以激活 SHC；EPO 可以激活 Raf-1，p21ras，GAP 和 PI3-K；而 IL-4 受体可以结合 非受体型的 PTK――fes 等。这些现象说明，虽然细胞内的信号转导通路有许多条，但是，许多信号转导分子不止参与一条 通路，许多信号转导通路也使用不止一个的信号转导分子。因此，在细胞浆这“一锅汤”里，各种各样的信号转导分子混 杂其中；各种各样的信号转导通路并存其中，很难以想象它们之间竟然会“河水不犯井水”地互不干扰，老死不相往来。 2 不同类型的磷酸化同时起作用 在信号转导通路中承担磷酸化作用的既有蛋白质酪氨酸磷酸化酶，又有蛋白质丝氨酸/ 苏氨酸磷酸化酶。虽然，酪氨酸磷酸化在信号转导中起着特别重要的作用，但是，越来越多的实验说明，丝氨酸/苏氨酸磷 酸化也是不可或缺的。两种磷酸化同时起作用，两种磷酸化酶在各种信号转导通路上交叉穿梭地催化这些磷酸化反应，是关于信号转导研究的若干问题9造成细胞内信号转导通路网络的另一个原因。比如，以前只认为酪氨酸磷酸化就足以激活 STAT 复合物，而近来却证明还要 有丝氨酸的磷酸化才能使这种激活得以完成。比如，IFNgamma 诱导原单核细胞分化为成熟的巨嗜细胞时，要求包含在转录 因子复合物 GAF 中的 STAT1alpha 亚基的丝氨酸被磷酸化。而与此同时，这个 STAT 的酪氨酸磷酸化程度没有丝毫增加。研 究表明，与未分化的细胞相比，在分化为单核细胞后，GAF 的 DNA 结合活性也增加了。这个现象说明，GAF 发生了双重磷酸 化，从而加强了它与 DNA 的结合能力。又如，响应 IFNgamma 时，含有 STAT1 的转录复合物的被激活和响应 EGF 或 IL-6 和 CNTF 时，含有 STAT3 的转录复合物的被激活，也都需要丝氨酸磷酸化才能达到最大的效率。这些结果强烈地暗示 STAT1 中 存在一个丝氨酸残基， 它是 MAPK 的候选磷酸化位点； STAT3 中也是这样。 在 当然， 这些撩人的结果还需要进一步加以证实， 特别是要证明这些丝氨酸残基在细胞内的确是 MAPK 的靶子；MAPK 确实与 JAK-STAT 通路交联，而且参与激活 STAT。 最近，有人提出报告，说 MAPK 的激活，特别是它的一个亚型――调节胞外信号的激酶 2（EGK2）的激活与 IFNbeta 激 活 STAT 蛋白之间有直接的生物化学上的联系。他们用融合蛋白的方法证明，ERK2 组成性地与 IFNalpha/beta 受体 alpha 亚基的近膜区 50 个氨基酸残基相互作用。在 IFNbeta 刺激下，发生了依赖时间的与 STAT1alpha 结合现象。这些情况究竟 是巧合呢， 还是这两个蛋白质的确在同一条信号转导通路上发生碰撞？用不能被激活的 MAPK 蛋白质， 即其磷酸化位点产生 突变的 MAPK，证明它抑制了 IFNbeta 对含有 ISRE DNA 元件的基因的激活。这就证明 ERK2 这种 MAPK 的确在 INFbeta 信号 转导通路中 STAT1alpha 上游起作用。 所以，IFNgamma 受体下游的信号转导通路需要丝氨酸磷酸化参与，才能最大程度地激活 STAT，这不是一个偶发现象， 而是信号转导通路中一个极其关键的组成成分。 显然，RTK 激活的通路和无催化能力的细胞因子受体激活的通路都利用了共同的、在进化上被证明是成功的方式和组 分，这样才能对它们产生的响应进行精细的调节。我们不再认为这些通路是相互排斥的，它们的确是存在于一张网上的。 细胞内信号转导通路之间是相互交流，形成网络的。这个网络的一般特点是： （1）它由配体、受体、连接物、激酶和转录 因子或复制因子等五大要素组成； （2）组成信号转导通路的分子常常有密切的关系，它们的基因多是一些多基因家族的成 员； （3）由关系密切的分子组成的各种各样信号转导通路有重复性； （4）有共享组分的各种因子之间可以在许多水平上进 行交流。信号转导通路编织成的这个迷宫，使机体的细胞能够对外来信号作出恰当的反应。 （三）信号转导通路网络的形成机制 社会上复杂的人际关系是以功利为基础而形成的。看来，细胞内信号转导网络――这个反映细胞社会中复杂的“分子 际关系”的现象，一定也是受到某种功利需要的驱动而形成的。细胞内信号转导的最大功利需求是什么呢？是细胞能够对 各种刺激作出及时而准确的反应，以使生命得以维系和延续。为了实现这个需求，在生命进化过程中发展出了形成这个网 络的机制。已经知道，细胞对信号转导的诸多反应，都涉及蛋白质与 DNA 的相互识别和相互作用。实验表明，各种不同的 蛋白质因子对各种不同的 DNA 元件的识别和结合有重复性和普遍性等特性，这些特性可能就是形成信号转导网络的分子机 制之一。 研究得比较清楚的是，转录调节因子的 DNA 结合特性的重复性和广泛性。比如，转录因子 Fos 和 Jun 家族都有亮氨酸 拉链结构，通过这个结构，这些转录因子可以与含有 AP-1 位点的 DNA 靶序列结合而调节基因表达，影响细胞表型。但是， 来自活性转录因子(ATF)家族，和来自与 cAMP 响应元件(CRE)结合的蛋白质(CREB) 家族的转录因子虽然也有亮氨酸拉链， 它们却不与 DNA 中的 AP-1 结合位点相互作用， 而去与 DNA 序列中的 CRE 专一序 列――TGACCTCA 结合。不仅如此，这两个家族之间的成员还可以通过亮氨酸拉链相互作用，形成混合的异源二聚体。可是， 这些异源二聚体却又有完全不同的 DNA 结合专一性。比如，ATF-4 与 Fos/Jun 形成的二聚体优先结合 CRE。这可以解释为什 么 Fos /Jun 也有一定的 CRE 结合活性。所以，由于细胞内各种组分的数量、比例和它们相互作用形成的异源二聚体等的差 别，就可以在细胞核内造成非常复杂的基因表达调节格局，并在各种信号转导通路之间形成自由对话的局面。 不仅如此，上面讲的只不过是发生在同一类信号转导通路之间的对话。而我们知道，大体上说，细胞内有两类信号转 导形式，即由跨膜受体介导的信号转导，和由核受体介导的信号转导，后者是以类固醇激素家族为代表的。这两类信号转 导之间有没有对话呢？如果有， 其分子机制又是什么呢？研究发现， 糖皮质激素(G)可以透过细胞膜直接与细胞核内的受体 (如 GR)相互作用。G 和 GR 形成二聚体，然后，共同地与靶基因的专一结合元件――糖皮质激素响应元件（GR）相互作用， 调节靶基因的表达。这是通过核内受体进行的细胞内信号转导通路。而跨膜信号转导通路是通过刺激细胞膜上的受体，经 由胞浆内的第二信使激活细胞内的蛋白激酶系统，再经过所谓的第三信使――AP-1、CREB 和 ATF 等等作用于靶基因，引起 转录响应。但是，现在知道，在有些基因的启动子上面既有 GR 结合的位点，又有 AP-1 结合的位点。也就是说，这类基因关于信号转导研究的若干问题10有既适用于膜受体，又适用于核内受体的双功能 DNA 结合元件。这种元件叫做复合型基因响应元件(composite response element) 。通过这种元件就可以将两类不同的信号系统整合起来。 此外，锌指结构是类固醇激素受体的特征性结构，而亮氨酸拉链结构是 AP-1 的特征性结构。现在却发现这两类结构可 以相互作用，形成二聚体。这种相互作用的结果是阻止了对方蛋白质与其本身的 DNA 元件结合。这也是信号转导通路之间 对话的一种形式，只不过是一种负调节式的对话。 信号转导网络的多样性与统一性正说明它存在的必要性，它将与细胞厮守一生，生死与共，永不分离！ （四） 信号转导专一性的调节 既然信号转导通路形成网络，既然许多不同的信号转导通路使用相同的信号转导分子， 那么，细胞对不同刺激怎么会产生不同的响应呢？信号转导还有没有专一性？如果有，它又是如何形成的？信号转导专一 性当然是有的。否则为什么细胞能够对不同的刺激作出完全不同的响应呢？否则生命现象难道还会有如此丰富多采吗？但 是，对于信号转导专一性的产生及维持的机制还知之不多，这是生命科学工作者要努力的。通过研究 STAT 转录因子，人们 得到了一些线索。 第三节 二聚作用是调节信号转导的一个重要机制 特殊的蛋白质-蛋白质相互作用是几乎所有生物学过程都必需的。 许多这种相互作用是非常稳定的， 例如血红蛋白的亚 基之间的相互作用和胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂之间的相互作用等。有一些则处于动态过程，包括磷酸化，核苷酸交换和 蛋白酶解过程中的识别过程等。 蛋白质-蛋白质相互作用的一种形式是二聚作用， 它可以定义为两个有关的亚单元组成一个 蛋白质-蛋白质复合物。 二聚作用是调节信号转导的一种常见形式。对它的研究有助于加深理解信号转导的机制。 一，二聚作用的一般功能 (一) 接近和定向 二聚作用是一种有效而灵活的调节机制，它能产生各种各样的物理学和生理学结果。 发生二聚作用的蛋白质彼此接近，使得它们可以相互作用。最普通的例子就是下面将论述的细胞表面受体的二聚作用，它激活了细胞内信号转导通路。不仅如此，受体二聚作用还能够将与受体结合的蛋白质拉近。比如，有 一些激酶与细胞因子受体的胞内域非共价地结合，受体二聚就激活了它们的磷酸化作用。 细胞内发生的这种蛋白质相互接近有非同寻常的意义。因为，与溶液中分子可以自由活动不同，细胞内液的粘滞性和 细胞内存在的空间间隔限制了蛋白质分子扩散，使得本来应该配对成双的伙伴只能泪眼巴巴地咫尺相望而终不能聚首。这 真是一场“胞寰悲剧” ！二聚作用就解决了这个问题，给多少有情分子带来了无比的欢欣。 二聚作用还有另外一个重要意义，即它不仅仅是简单地将相互作用的分子拉近，而且它还能使底物与酶的活性位点以 更适合催化作用的方位相互楔合， 这就大大增加了反应速度。 这种定向作用对信号转导的突出意义,可以用胰岛素受体信号 的激活来说明。在与配体结合前，胰岛素受体的两条链都有不同的,很高的局部浓度；但是，它们都只有低效的体积摩尔浓 度，因此不足以发信号。因此,在结合配体并发信号时，它们之间需要重新定位，这可以通过两条链在细胞膜上以二硫键连 接，形成二聚体来实现。所以，二聚作用既改变了胰岛素受体的局部浓度，又改变了它们之间的方位。 (二) 异源二聚的差示调节作用 二聚蛋白质通常隶属于其成员能够交互二聚的蛋白质家族。如果一个蛋白质有许多个 二聚搭档，则所形成的各种二聚体将会有完全不同的功能。此时，在细胞内这些蛋白质的相对浓度，和它们之间相互作用 的相对强度将决定谁是最主要的二聚体品种，当然，这也决定了它们产生的生物学的结果将会如何。这就是二聚作用的差 示调节。 通过二聚作用进行差示调节的一个特殊形式是“毒性亚基”或“显性负调”搭档。这些称呼反映出二聚作用的搭档保 留了二聚功能域，但是失去了关键的功能域。即这些搭档蛋白质的单体是没有功能的，即使它们与含有功能域的蛋白质聚 合，所形成的也只能是没有功能的复合物，它对某些功能就起着负调节者的作用。例如，蛋白质 Id 是转录因子 MyoD 的负 调节者。Id 有与 MyoD 相互作用所需的二聚域，但是，没有 DNA 结合域。因此，Id/MyoD 寡聚物不能结合 DNA。这个聚合物 将抑制 MyoD 转录的基因表达。 (三) 增强专一性 相对于单体而言，二聚作用的结果一般会形成更大的蛋白质相互作用表面。这就不仅会促进蛋白质蛋白质，或者蛋白质-DNA 的相互作用，还会使这些相互作用的专一性发生变化。这体现在：(1)不同种类的异源二聚体， 比如，二聚的转录因子与单个亚基相比有更高的 DNA 结合亲和力，它识别碱基对的专一性大为提高；(2)不同的异源二聚体 有完全不同的 DNA 结合专一性，比如，Fos-Jun 异源二聚体的 DNA 结合位点偏爱性与 Atf-Jun 的完全不同；(3)与增加蛋白 质单体的大小相比较,二聚作用是更为有效的增加专一性的方法。例如,在蛋白质-DNA 相互作用时，简单地将转录因子的大关于信号转导研究的若干问题11小扩大一倍以增加它与 DNA 的接触，当然可以增加转录因子对 DNA 上面专一结合位点的亲和力，但是，与此同时也增加了 转录因子对非专一位点的亲和力。这就会对专一性结合造成动力学的障碍。而通过蛋白质二体协同地结合 DNA，可以使它 DNA 识别元件的大小加倍而不需要付出动力学的代价。 对单体(四) 对单体-二体相互过渡的调节 单体-二体相互过渡本身可能是一个可以调节的过程，它是激活蛋白质过程的限速 步骤。例如，有一些蛋白质专门对钙含量作出反应，此时，它们的构象发生很大改变并通过形成二聚体而成为活性的复合 物。这些蛋白质包括 E-细胞选择蛋白（一种基质蛋白）和突触结合蛋白。看来，磷酸化调节着 STAT 蛋白和 SMAD 蛋白的寡 聚化状态。在上述所有例子中，蛋白质的单体形式是失活的，而一旦发生二聚作用，立即就被激活了。 二，信号转导中的二聚作用 在信号转导过程中发生了多方面的二聚作用，二聚作用可以起到打开或者关闭信号转导通路的重要作用。在信号转导 中的二聚作用可以分为下面几个方面。 (一) 调节受体的活性 通过跨膜域固定在细胞膜上面的细胞表面受体，在与配体结合后就被配体诱导的二聚或寡聚作用 而激活。虽然，可能这些分子本身并非一定乐意二聚，但是它们通过与细胞外的配体的相互作用还是被拉近了。 配体诱导受体二聚作用的机制有多种。有的配体本身就是二聚体，它们含有两个结合受体的表面。比如，PDGF 是以二 硫键连接的二聚体，有三种不同的异构体：A 链同源二聚体，B 链同源二聚体和 AB 异源二聚体。A 链以高亲和力与 PDGF 受 体 a 亚基结合；B 链以相同的亲和力与 a 和 b 亚基结合。因此，AA 产生 a －a 受体同源二聚体，AB 产生 a －a 受体同 源二聚体和 a －b 异源二聚体，BB 则产生所有可能的组合。与此相反，有的配体是单体型的,如 hGH。但是，它们的表面有 两个不同位点可以与两个受体分子接触， 形成 1:2 比例的配体:受体复合物。 有一种有趣的情况是酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)。它本身是单体，又不能诱导其受体的二聚作用。怎麽办呢？它就与肝素硫酸酯蛋白聚糖形成多价复合物，这样， 它就能结合两个或者更多的受体。还有，TNF-b 是三聚的配体，结晶结构分析表明，在一个 TNFb 三聚体上可以同时结合 三个 TNF 受体分子。 受体除了与配体结合外，还可以彼此相互作用。这种不依赖配体的受体-受体相互作用可以使二聚的受体进一步稳定。 相互磷酸化作用也是使受体二聚并激活的重要原因。对于有酪氨酸激酶活性的受体来说，结合胞外的配体所引起的二 聚作用将它们的两个激酶域拉到非常靠近的位置，使得二聚体中的一个受体能够磷酸化另一个受体。在这种分子中有两类 磷酸化位点，一类的磷酸化发生在激酶的催化功能域内部的酪氨酸上，它的磷酸化增强了激酶活性，并可将受体上的其他 位点磷酸化；另一类磷酸化发生在激酶功能域以外的位点，它是其下游的带有 SH2 域的信号转导分子泊锚的地点。蛋白质 酪氨酸激酶受体的二聚作用有同源二聚，也有异源二聚。在后一种情况下，一个搭档的激酶活性常常比较低，它往往是二 聚体中激酶活性高的成员的重要底物。例如，ErbB3 受体的激酶活性很低，不能成为同源二聚体传递信号。但是，它能与 EGF 家族的其他成员形成异源二聚体，并在配体诱导下产生很强的反应。 至于本身没有激酶域的细胞因子受体，它们通常利用在细胞内的胞浆域结合激酶，如 JAK 家族激酶。结合配体发生的 受体二聚作用同时也将与受体结合的激酶拉近，就产生了激酶的相互磷酸化，把激酶激活。然后。激酶就磷酸化转录因子 而将它们激活。看来，配体诱导的受体二聚作用有两个目的：拉近激酶并使之相互磷酸化；形成一个能够与受体或激酶下 游分子结合的支架。 (二) 调节蛋白质酪氨酸激酶的活性 蛋白质酪氨酸激酶（PTK）有两类，一个是跨膜受体型的，另一类是细胞质型的。 跨膜型 PTK 被分子间二聚机制激活，而细胞质型的被分子间和分子内两种二聚机制激活。 1，对受体型 PTK 的激活 单体型的受体 PTK 只有很弱的基础活性，在配体将它二聚后才表现出充分的活性。如上所述， 能够使受体型 PTK 二聚的配体可以分为两类。一类是本身就有诱导这类 PTK 发生二聚作用的。比如几个生长因子家族的成 员，包括 PDNF，EGF 等。它们的单体型含有两个与受体结合的位点，因此可以交联两个与之相邻的受体而使两个受体聚合。 另一类如 FGF，虽然它们自身只是以一价形式结合受体，但是可以借助某些辅助分子促进配体-受体复合物的多聚作用。受 体的二聚作用对于激活它们内在的催化活性和生长因子受体的自身磷酸化作用是必须的。聚合可以是同源的，也可以是异 源的。由于聚合体中的每个成员都能够罗致不同的信号转导分子，因此这种作用不仅是为了增加 PTK 的活性，还为信号转 导的多样性提供了一个简单的机制。 二聚作用提高受体型 PTK 催化活性的机制是什么呢？许多的这种激酶由调节域和功能域组成。它们被激活的核心步骤 就是其催化域内的活性环（A 环）中的一个或者多个酪氨酸被磷酸化了。配体诱导的受体二聚作用可以增加激酶域的局部 浓度，以更有效地将可流动的 A 环中的酪氨酸残基磷酸化。被激活的 PTK 就将磷酸基团转移给它们的催化域中的另外一些关于信号转导研究的若干问题 酪氨酸残基，后者则起着信号蛋白结合位点的作用。 2，对非受体型 PTK 的激活12看来非受体型 PTK 的激活机制与上述的类似。许多细胞质型 PTK 的催化活性也因其 A 环中酪氨酸残基的转磷酸化作用而被激活。但是，不同的二聚作用格局造成的激活机制有所不同。某些激酶，例如 Src 家族的 Lck 和 Jak 家族的激酶，它们的激活机制是与其相关的受体非共价地同源或者异源二聚作用。前者如 CD4/CD8 共受体，后者如 细胞因子受体。而有一些细胞质 PTK 则是被受体与其他家族的细胞质 PTK 之间的转磷酸作用激活。比如，认为 Src 激酶经 常参与 Fak、Syk 和 Btk 家族的激活过程。驱动这些激酶相互作用的机制还有待阐明，但是它们通常涉及将一种作为底物的 激酶罗致到浆膜或者另一个细胞区间，在那里它们与 Src 家族的激酶如此接近，以至可以被 Src 磷酸化。一般而言，这种 转磷酸化作用总是发生在细胞质 PTK 的同源或者异源二聚体之间。 虽然 Src 激酶的功能可以被受体介导的，造成 A 环转磷酸作用的过程激活，但是，看来还有另一种机制可以调节它们， 这就是它们的 SH2 和 SH3 域介导的分子内相互作用。这种作用当然不是经典意义的二聚作用，但是也是一种 2 个单元之间 的聚合，它又与同一个分子的活性调节有关，所以在此一并讨论。很久以来总是认为 Src 激酶中靠近 C 端的酪氨酸残基起 着磷酸化作用的负调位点的作用。而最近 Src 结晶结构分析阐明了这种分子内负调机制的性质。Src 的 PTK 域通过与其本 身的 SH2 和 SH3 的两种不同的分子内相互作用而维持在钝化状态。PTK 的催化域与其本身的 SH2 域之间有一个富含脯氨酸 残基的接头，当 SH3 与这个接头结合时，就使 Src 的 C 末端的磷酸酪氨酸（pTyr527）与 SH2 结合。这样，Src 的三个功能 域形成为压缩的构型，处于钝化的状态。有三个方法可以解除这种抑制作用，激活 Src。其一是用一个富含脯氨酸的序列 与 SH3 结合，不让它与那个接头结合；第二是含有磷酸酪氨酸的序列与 SH2 结合，使它不能结合 PTKC 末端的磷酸酪氨酸； 三是将 C 末端的磷酸酪氨酸去磷酸化。 总之，PTK 类激酶的故事告诉我们分子内或者分子间的相互作用都可以调节它们的催化功能。 调节蛋白质酪氨酸磷酸酯酶（PTP） (三) 调节蛋白质酪氨酸磷酸酯酶（PTP）活性 将酪氨酸被磷酸化的蛋白质去磷酸化的是 PTP。 它们起着关闭信号转导通路的作用。 PTP 也有跨膜的受体型和细胞质型 的两种。关于它们的功能是如何调节的，知之甚少。与 PTK 不同，PTP 的催化功能域不需要转译后修饰就能维持其活性。 实际上，这些酶的催化功能比 PTK 的要大得多。但是，还是有许多证据说明这些酶的功能受到严格的控制。这种调控的主 要方式，由改变它们在细胞内的位置和通过分子内和分子间相互作用调节其催化功能。 1，对受体型 PTP 的调节 已经鉴别出大量的跨膜 PTP，它们中有许多是有组织专一性的。许多酶的胞浆域中含有串联排 列的 PTP 功能域，而靠近膜的 PTP 域有较大，有时竟含有全部的催化活性。那么，为什么还要有其他的 PTP 功能域呢？这 还是一个谜。认为后者可能起调节功能。 为什么把跨膜的 PTP 叫做受体型的呢？因为它们之间的胞外域有很大不同，而且看来具有结合专一性配体的性质。它 们的生理配体是什么，还不知道。但是，知道 PTP k ，m 和 l 可以与其他细胞内的相同分子同型相互作用。而且，PTPb 的胞外域可以专一性地与神经元受体 contactin 结合。 但是与配体结合并不能改变 PTP 的催化活性， 也不能影响它的功能。 据以为，单体型的 PTP 是有活性的，在它近膜的 PTP 功能域中有一个催化功能域，起催化作用，还有一个楔形结构，起抑 制催化功能的作用。与配体结合引起的受体型 PTP 二聚作用，促使两个近膜 PTP 功能域也发生二聚作用。于是，各个单体 的楔形结构也与彼此的催化功能域相互作用，从而阻止了底物与催化核心的结合而抑制 PTP 的活性。 2， 对细胞质 PTP 的调节 看来，封阻催化位点是调节这些酶活性的通常方式，细胞质 PTP 的调节也将是这样。但是， 它们的主要作用方式不是分子间相互作用，而是在分子内就封阻了催化位点。因为除了磷酸酯酶功能域外，细胞质 PTP 还 有与其他蛋白质相互作用的功能域。如 SHP-1 和 SHP-2 就是含有 2 个 SH2 的 PTP。SHP-1 抑制淋巴细胞上的受体，SHP-2 抑 制 EPO 受体。SHP-2 的 N 端 SH2 与其 PTP 功能域的催化活性裂口相互作用，N-SH2 占据了催化裂口，使底物无法接近，将 PTP 维持在钝化状态。 用含有专一性磷酸酪氨酸的序列与 N-SH2 结合， 就可以缓解这个自抑制作用， SHP2 成为活性状态。 使 而 C 端的 SH2 看来不与催化功能域相互作用。它的功能可能是增加 SHP-2 与底物相互作用的专一性和亲和力。 由上面所述，可见 PTK 和 PTP 的激活和抑制竟然有惊人相似的机制。说明二聚作用能够从正反两个方面同时起作用， 即激活 PTK 的同时也抑制了 PTP；或者相反。这就保证了细胞内可逆磷酸化作用的顺利进行，使信号转导通路保持畅通。 造化真是奥妙无比啊！ (四) 调节转录因子的活性 许多细胞外的信号实际上最终被传送入细胞核并引发基因表达的变化。正如上面提到的，单体型的 DNA 结合蛋白聚合 后与 DNA 结合的机会就加倍，它作用的专一性也成倍增加。因此，转录因子的二聚作用也是信号转导过程中最常见的一种关于信号转导研究的若干问题 二聚作用。 1，细胞核激素受体13亲脂的激素，如类固醇、视黄酸、甲状腺激素和维生素 D3 可以穿越细胞膜进入细胞，与核受体相互作用而发挥功能。细胞核激素受体是一种细胞内的受体，它与配体形成的复合物能够直接作用于相关的 DNA 元件。从某 种意义上说，这类受体具有转录因子的功能。这些转录因子构成了类固醇/核受体超家族。激素的核受体有类固醇雌激素 (ER)、孕甾酮(PR) 、盐皮质激素(MR)和雄激素(AR)；还有甲状腺激素(TR)、维生素 D（VDR） 、视黄酸（RAR）和 9-顺式视 黄酸（RXR） 。此外，还发现一些其配体未知的‘孤儿’受体。这个转录因子家族恐怕是最令人难以理解的，不知如何才能 搞明白这些成员的交互二聚作用竟然能使基因表达产生预期的变化！ 核激素受体以单体或者二体形式与 DNA 上的响应元件结合。这些响应元件由两部分构成。对类固醇激素响应的 DNA 序 列叫做激素响应元件（HRE） 。GR、PR、ER、AR 和 MR 成为同源二聚体，与 DNA 结合并识别一个回文结构式的响应元件；其 他受体，包括 TR、RAR、VDR 和 RXR 则形成异源二聚体，并识别有直接重复序列的响应元件。这些异源二聚体比它们自己形 成同源二聚体有更高的 DNA 响应元件亲和力。所以认为，异源二聚体是这些受体的主要功能形态。由于观察到 TR、RAR、 VDR、COUP-TE、PPAR 和 RXR 都结合直接重复序列 AGGTCA，这就有一个问题：它们如何区别各自不同的结合位点？生化研究 揭示，RAR 偏好于通过间隔 2 个核苷酸的直接重复序列去激活转录；而 VDR 和 TR 分别通过间隔 3 和 4 个核苷酸的直接重复 序列去激活转录；但 RXR-PPAR 异源二体和 RXR 同源二体则通过只有一个间隔的直接重复激活转录。所以，不同的二聚体利 用不同的，由 1 到 5 个的核苷酸间隔来激活基因表达。 核激素受体至少有两个二聚作用界面：一个在它的 DNA 结合域；另一个在它的配体结合域。DNA 结合域在没有 DNA 存 在时是单体，有 DNA 才发生聚合。配体结合域二聚作用的功能看来是稳定受体-DNA 复合物。有一个叫做 SHR 的孤儿受体， 它虽然没有 DNA 结合域，但是它能通过配体结合域与其他受体所异源二聚。看来，它可能作为依赖受体的信号转导通路的 负调节剂。 2，STAT 的二聚作用 几年前才发现的 STAT 家族转录因子可以形成二聚体并介导许多细胞因子的生理作用。通常，STAT 通过它分子中的 SH2 域与受体结合。在配体激活受体和 JAK 后，STAT 的酪氨酸被 JAK 磷酸化。然后，STAT 由受体上解离下 来形成同源或者异源二聚体，转位到细胞核，结合于靶基因的增强子元件。大量证据表明，STAT 的二聚作用是通过一个分 子中的磷酸酪氨酸位点与另一个分子中的 SH2 域的交互相互作用实现的。二聚作用对它们进入细胞核和与 DNA 结合是绝对 必需的。有一个天然存在的 STAT1 变种，叫做 STAT1b，它缺少 38 个羧端的氨基酸残基，而这些氨基酸残基是激活转录必 须的，因此，这个变种是显性的负调因子。 对细胞因子响应时， 激活专一品种的 STAT。 这种专一性的选择看来不是由 JAK 控制的， 而取决于各种受体罗致专一 STAT 的能力。实际上，第一个结合在酪氨酸被磷酸化的受体上的 STAT 单体，在自己被磷酸化了的就可以结合第二个 STAT，当 后者也被磷酸化时，它们就形成稳定的二聚体。 STAT 一般结合在非常相似的、对称的 DNA 序列上。既然它们都有相同的 DNA 结合偏爱性，那么，STAT 是如何激活专 一靶基因的呢？研究发现，STAT 蛋白的氨基末端对 STAT 二聚体与 DNA 的结合有协同作用。这些协同相互作用使得 STAT 蛋 白能够识别虽然从总体上说保守，但有各式各样变种的 DNA 结合位点。因此，在溶液中，STAT 形成二聚体，而在 DNA 上却 形成高度有序的寡聚复合物。 碱性螺旋-环-螺旋蛋白质 3， 碱性螺旋子序列。 第一个被鉴定的 bHLH 是 MyoD，它的基因专门在骨骼肌中表达，所产生的 myo cDNA 可以诱导各种各样已经分化的细胞 株表现出肌肉细胞的特性。MyoD 的 bHLH 中的第 68 个氨基酸残基对这种活性是必要和充分的。虽然 MyoD 能够作为同源二 聚体与 DNA 结合，但是，E47-MyoD 异源二聚体对靶序列的亲和力要大 10 倍。MyoD 有一个叫做 Id 的负调因子，它也有 HLH 二聚作用域，但是缺少碱性区。它能与 MyoD、E12 和 E47 形成异源二体，但是这些复合物都不能结合 DNA。有趣的是，在 处于增殖状态的成肌细胞中，Id 含量很高。说明在成肌细胞中，Id 阻止 MyoD 和/或 E47 激活肌肉专一的基因表达。 另一些了解较多的 bHLH 调节系统包括 Myc,Max 和 Mad bHLH 蛋白。c-Myc 致癌蛋白本身并不会发生同源二聚作用，也不 结合 DNA。但是，它能够与 Max 异源二聚并作为转录激活剂和转化蛋白发挥作用。尽管 Max 倾向于与 Myc 二聚，但它也能 形成同源二聚体， 这个二聚体可以结合 DNA， 并可以抑制 Myc 引起的转录和转化。 也可以与两个其他的 bHLH-LZ 蛋白质， Max 即 Mad 和 Mxi1 异源二聚。Myc 一样，这些蛋白质本身不会同源二聚，也不会结合 DNA，但是，倾向于与 Max 异源二聚以识 碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族转录因子， 在产生细胞类型专一的基因表达中起着重要作用。 它们含有一个高度保守的、结合 DNA 必须的碱性区，这个区域与 HLH 模体靠近。这些蛋白质的特点是能够结合 E-box 增强关于信号转导研究的若干问题14别和 Myc-Max 同样的 CACGTG E-box。看来，Max 调节着这些蛋白质的转录活性。在未分化的 U397 单个核细胞株中，只形成 Max-Myc 复合物，但不形成 Max-Mad 复合物。可是，用 TPA 刺激，诱导它向巨噬细胞分化后的头 2 小时之内，Max-Mad 复合 物就开始积累；到了刺激后 48 小时，就只能检测到 Max-Mad 复合物了。所以，分化过程伴随着 Max 异源二聚体中组分的改 变，当然，基因表达也随之改变。 4，BZIP 家族 亮氨酸拉链是最简单的二聚作用界面之一。它能够介导有高度选择性的，非常重要的蛋白质结合作用。它 最早是作为 C/EBP 和 GCN4 中的序列模体以及许多转录因子相互作用的界面而被鉴定和认识的。这个名字来自于它的分子 内有一个约 35 个氨基酸残基的区域， 其中每隔 7 个残基就有一个亮氨酸残基， 并在每个亮氨酸残基之后的第 4 个位置处是 另一个疏水的残基。 这些蛋白质可以识别两类 DNA 元件： AP-1/TRE 和 ATF/CRE 序列模体。 AP-1/TRE 元件有保守的 TGACTCA， 它是一个拟二元对称。与这个位点结合的蛋白质包括 Fos 和 Jun 家族，它们可以被促进有丝分裂的、诱导分化的和神经原 专一的刺激所诱导。ATF/CRE 元件含有 TGACGTCA 保守序列，它是一个二元对称。与这个位点结合的蛋白质的基因的表达与 cAMP、钙和病毒所诱导的反应有关。 AP-1 可能是了解最清楚的 bZIP 转录因子，它是 Jun 和 Fos 家族成员的异源二聚体。鉴于 c-Fos 蛋白的产生被生长因 子激活， 而且它又位于细胞核内， 所以认为这个蛋白质直接参与生长因子所诱导的基因的调节。 但是， 发现 c-Fos 在与 c-Jun 结合之前没有 DNA 结合能力。还发现，共转染 c-fos 和 c-jun 与单独转染 c-jun 相比，AP-1 驱动的基因表达更强。而且， 只给 c-fos 没有激活作用。 看来其原因是 c-Fos-c-Jun 二聚体比 Jun-vc-Jun 更加稳定， 因为毕竟 c-Fos 本身不能二聚作用！ 由这些情况可以推及这些家族中的其他成员：JunB、JunD、FosB、Fra1 和 Fra2。c-Jun 和 c-Fos 的生物合成都被 TPA 和其 他 PKC 激活剂诱导。由于 Fos 蛋白质和 mRNA 的半衰期都比 Jun 的短，因此，在诱导前，复合物的组分主要是 Jun 同源二聚 体，而在诱导后立即变成多是 Jun-Fos 异源二聚体。这个异源二聚体复合物的形成是细胞信号转导和细胞转化期间最重要 的调节步骤。 5，钙介导的二聚作用 细胞内的钙含量，在细胞对环境变化产生响应是急剧改变。反而言之，钙浓度的改变在许多生物 学过程，包括受精、突触囊状融合和淋巴细胞激活中起着不可或缺的作用。钙介导许多蛋白质构象的变化；有时，构象的 变化会导致二聚作用。因此，某些钙调节的生物学响应是通过蛋白质二聚作用传递的。 突触小泡蛋白和突触结合蛋白起着主要的钙传感器作用， 调节着神经原钙的胞泌。 突触结合蛋白是一个整合的膜蛋白， 体外实验表明，这个蛋白质的胞外域会产生急剧的依赖钙的构象变化，结果导致二聚体形成。因此，看来钙诱导突触结合 蛋白的同源二聚对钙胞泌的有效调节十分重要。 另一个重要的受钙调节的二聚作用发生在 E-细胞选择蛋白。它介导细胞粘连，并在正常发育中起重要作用。细胞选择 蛋白发挥功能需要钙。 钙诱导 E-细胞选择蛋白整个胞外域的构象发生剧烈的可逆改变， 结果形成了它的有功能形式。 所以， 钙促进的二聚作用是这个蛋白质维持细胞功能的机制之一。 模拟二聚作用――由这些研究我们学到了什么？ ――由这些研究我们学到了什么 三 模拟二聚作用――由这些研究我们学到了什么？ 了解生物调节的机制不仅有重要的理论意义， 而且使得我们能够设计新的实验系统， 以更好地理解这些生物学功能并加 以利用。对信号转导中的二聚作用之研究也是如此。至少，我们可以做下面两件事。 (一) 设计显性负调的二聚作用搭档 多聚蛋白质的生物学功能，可以通过其单体与缺乏关键功能域的变种单体相互作用而被负调。天然就存在着许多这种 显性负调作用。而利用这个原理已经设计一些起显性负调作用的二聚体搭档。例如，各种细胞表面受体的变种，它们保留 了配体结合域和跨膜域，但是它们的细胞内域发生缺失或者突变。比如，这样的 EGFR 在爪蟾胚胎中合成时，中胚层就不能 形成。这说明 EGF 的信号转导对早期胚胎发育非常重要。同样，亮氨酸拉链的多肽内互补物可以干扰 CRE 启动子驱动的报 告基因表达。用这种“毒性亚基”方法可以进行各种实验，并得到很好的结果。它们还有可能被用来治疗某些由于信号转 导通路失误而造成的疾病，或者用来阻断使得细胞癌变的信号转导通路。 用小的、合成的、 (二) 用小的、合成的、可以促进蛋白质结合的配体来调节生物学响应 由蛋白质二聚作用所发挥的重要作用说明， 促进蛋白质与蛋白质的结合可以调节许多生物学反应。 这个概念已经被用来 设计和制造可诱导的结合蛋白。在这个技术中，用低分子量的，可通透入细胞的有机分子来诱导两个蛋白质靶子的二聚作 用。这些有机分子被命名为“二聚作用的化学诱导物” （CID） 。在这些 CID 上装有两个结合表面，它们可以识别专一的，蛋 白质性质的调节剂。同时，将这些蛋白质调节剂融合在细胞内的靶蛋白上了。当这些 CID 通透进入含有蛋白质调节剂嵌合 蛋白的细胞中时，就可以诱导靶蛋白的二聚作用。而如果 CID 只有一个这样的结合表面，它就可以迅速地逆转二聚作用。关于信号转导研究的若干问题15第一个用来调节信号转导的 CID，针对的是细胞表面受体的寡聚作用。这个受体本身缺失细胞外域和跨膜域，但是保 留了信号转导所需的细胞内域。这样，它就不能被配体激活而发生二聚作用。但是，如果它能够二聚的话，它仍然有信号 转导作用。于是，将一个 TCRz 链胞浆域，连带一个膜定位所需的肉豆蔻酯作用信号，加上与 CID 相互作用的蛋白调节剂 一起转入细胞，再用适当的 CID 处理细胞，结果激活了细胞的 TCR 响应作用。这说明，这种细胞外域和跨膜域缺失的受体， 通过它的细胞内域与 TCRz 链胞浆域的二聚作用，还是传递了相关的信号。可见，诱导或者控制蛋白质之间的相互接近， 是以一种可逆方式调节某种生物学响应的有力工具。 总之，在几乎所有的信号转导通路中，从细胞表面开始，一直连续到细胞核内，二聚作用起着十分重要的作用。 第四节 信号转导的生物学效应 真核生物的细胞核含有细胞增殖、细胞分化和细胞程序性死亡(细胞凋亡)所需要的全部信息。至于细胞该进行哪一个 程序，则取决于细胞对外来刺激应答时向细胞核输入了什么样的信号。所以，信号转导的生物学效应几乎涵盖了所有的生 命现象。我们可以从以下各个方面来了解信号转导的生物学效应。 一 信号转导的转录响应 虽然信号转导引起的细胞反应形式丰富多采，但是，追根寻源，细胞行为的改变是由于细胞内的遗传程序发生改变而 造成的。也就是说，细胞外信号引起细胞表型与行为的变化，是细胞对信号转导产生基因转录响应的结果。研究表明， （l） 不同的刺激信号作用于同样的细胞，可以激活不同的基因转录，产生不同的细胞行为； （2）不同的刺激信号作用于同样的 细胞，也可以激活相同的基因，产生类似的细胞行为； （3）同一种刺激信号作用于不同类型的细胞却可以激活不同的细胞 反应； （4）同样的刺激信号，由于作用于细胞的强度或者作用持续时间的不同，却可以诱导不同基因的表达。所以，研究 细胞内信号转导转录响应，对于阐明信号刺激所造成的生物学反应过程及其机制有着十分重要的意义。 所谓信号转导的转录响应是指在信号刺激下靶细胞内基因转录的激活过程。如果能够搞清楚各种信号分子在各种细胞 或者生物体中诱导基因转录的过程和分子机制，就有可能对信号引发的各种生理反应作出合理的解释。所以，这个研究恐 怕需要生命科学各领域研究者们的共同协力， 从各自的基础出发， 由不同角度和不同的方面探索他们所想达到的终极目标。 而他们分别观察到的结果只不过是事物本质的各个表面现象而已。 (一) 信号转导转录晌应的机制 基因转录是由基因转录起始位点 5’上游的转录调节元件与调节控制基因表达的各种蛋白质因子，主要是转录因子之 间的相互作用发动的。在这个过程中，最关键的反应步骤就是激活转录因子。所以，细胞内信号转导的转录响应的基本机 制就是信号转导途径最终激活了转录因子，并使它们所制动的基因表达和造成细胞行为的改变。正因为这样，我们常常把 信号转导的转录响应叫做信号转导造成的转录因子激活过程。众所周知，靶细胞外的信号分子需要与其细胞受体相结合才 能引发细胞内的信号转导。因此，按照受体在细胞中的存在形式，信号转导的转录响应可以有两种方式。第一种是细胞外 的信号分子与细胞膜上的受体结合，引发信号转导，造成细胞内信号分子的级联反应。这些反应首先使细胞内现存的有转 录激活作用的蛋白质被磷酸化而话化，它们成为立早期基因的转录因子并激活这类基因。立早期基因通常是原癌基因。它 们的产物是一些通用的转录因子。这些转录因子合成后，又被激活并进入细胞核，诱导晚期基因表达。晚期响应的基因的 产物使细胞发生分裂或者分化等生理反应，造成细胞结构和功能的变化。大多数的信号刺激和它们的受体采用这种工作方 式。第二种是有一些细胞外信号分子(比如甾体激素)的受体的并不在细胞膜上，而在细胞质内。这时，信号分子直接进入 细胞，与细胞内的受体结合。然后，这个复合物进入细胞核，激活转录因子。虽然说，转录响应有上述两种方式，但是， 其本质是一样的。即信号转导过程激活了转录因子，从而激活了基因表达。因此，认识转录因子的激活过程与机制，就是 了解信号转导的转录响应的关键。为此，有两个问题需要加以强调，一个是转录响应的过程；另一个是转录响应的负调节。 1．转录响应过程 转录响应过程有三部曲：(l)转录因子受控移位，进入细胞核 (l)转录因子受控移位 进入细胞核 (l)转录因子受控移位 进入细胞核。作为蛋白质的转录因子是在细胞质中合成的，但是它 是在细胞核内转录基因的。因此，转录因子必须进入细胞核。转录因子进入细胞核的过程是受调控的，不是自发的。已经 知道，转录因子分子中的核定位信号序列和细胞质滞留信号序列的受控激活与转录因子进入细胞核有关。研究得比较清楚 的是核定位信号序列。它的生物活性来自其分子中一段短短的由碱性氨基酸残基组成的肽段。当这个肽段与这些抑制蛋白 结合时，核定位信号序列就失去作用。细胞外的信号刺激可以使抑制蛋白从核定位信号序列上解离下来，使转录因子得以 进入细胞核。此外，核定位信号序列被磷酸化，则可以促进转录因子进入细胞核。(2)转录因子与 DNA 结合 (2)转录因子与 结合。转录因子是 (2)关于信号转导研究的若干问题16一种 DNA 结合蛋白，它必需与它所调节的基因的转录调节元件结合才能发挥作用。这个过程也是对信号转导响应的结果。 这体现在： （A）许多 DNA 结合蛋白都是以寡聚体形式与 DNA 结合的，它的每一个单体都是没有转录活性的。因此，那些能 够刺激转录因子寡聚化的信号就可以调节控制转录因子的活性。比如，许多细胞因子的信号转导通路都激活转录因子 STAT(信号转导和转录激活蛋白)。其机制是信号转导通路中激活的激酶使得 STAT 蛋白分子中的酪氨酸磷酸化，STAT 蛋白 上还有一个叫做 SH2 的功能域，它能与磷酸化的酪氨酸相互作用。然后，通过两个同源或者异源 STAT 分子中磷酸化酪氨 酸与彼此间的 SH2 的相互作用，就形成同源或异源的 STAT 二聚体。它进入细胞核并与基因调控元件结合而激活转录。又 如，热休克信号可以激活热休克因子的三聚化； （B）有些转录因子本来就与抑制蛋白结合着，这些抑制蛋白封闭了转录因 子的 DNA 结合域，使转录因子不能与 DNA 结合和激活转录。但是，在信号刺激下，抑制蛋白与转录因子就可以结合 DNA 了。 （C）许多转录因子的 DNA 结合域通常是碱性的，它有利于转录因子与酸性的 DNA 结合。因此，DNA 结合域内的位点或其邻 近位点被磷酸化时，就可以通过直接的静电相互作用而阻止 DNA 与转录因子结合。而信号刺激可以诱导这些位点的去磷酸 化作用，从而加强了转录因子与 DNA 的结合。由此可见，信号转导对转录因子与 DNA 结合的调节是多方面的，不同的信号 分子，不同的转录因子都有不同的调节控制方式，造成了信号转导有不同的转录响应；(3)转录因子的激活。许多起基因转 录因子作用的 DNA 结合蛋白有两个功能域。一个就是 DNA 结合域，通过它与 DNA 结合；另一个是转录功能域，通过它激活 基因表达。但是，转录因子的转录功能域本身首先必需被激活才能发挥激活基因转录的作用。最常见的转录因子激活方式 是它的功能域的磷酸化。这个作用是受信号转导调节的。有些信号转导途径使转录因子在细胞核内被激活，许多原癌基因 的激活(它们的产物是通用的转录因子) 就是这样。有些信号转导途径使转录因子在细胞的膜结构上被激活，比如 Jak／ STAT 途径，STAT 激活后才进入细胞核；有些信号转导途径使转录因子在细胞质内激活。这时的转录因子常常与抑制蛋白相 结合而失活，而对信号转导的响应就使抑制蛋白解离下来并激活了转录因子。需要注意的是通常一条信号转导通路就足以 激活转录因子。但是，有些转录因子本身是一个由多个亚基组的复合物。它的每一个组分都分别受到不同的信号转导途径 的调节。因此，需要整合所有这些信号并对各种不同的信号转导产生响应才能将它激活。这就使得信号转导的转录响应变 得十分复杂，当然，也十分有趣。 2、转录响应的负调节 因为转录响应的结果往往使细胞发生不可逆的变化，所以细胞对信号刺激产生转录响应抱着十分认真、十分谨慎和十 分严肃的态度。在开始时，细胞对信号转导的转录响应常常是暂时性的，即细胞先作出一点点响应，然后，停下来：看一 看，这些信号刺激是否继续存在；想一想：是否要继续作出响应，问一问：自已是否已经作出决定，是否已经下死决心， 从此一去不复返地发生改变――分裂、分化或者环亡! 这说明，在应激发生以前，有一个负调机制在起作用。负调作用的机制之一是通过细胞内的蛋白质合成作用合成了一 些抑制蛋白，它们与信号转导的响应元件―― DNA 或者基因转录因子结合，阻止转录响应的发生。因此，蛋白质合成抑制 剂本身可以激活信号转导的转录响应。 另一个负调机制是磷酸酯酶的作用。它使转录因子去磷酸化而失活。因此，磷酸酯酶是信号转导转录响应的通常抑制 剂。 综上所述，虽然信号转导的转录响应过程繁琐，调节复杂，但是，贯穿所有这些过程与调节机制的一个共同的核心问 题就是蛋白质的可逆磷酸化作用。这个作用不仅在信号转导途径的各个步骤和阶段起着作用，特别是在受体的激活或者与 受体偶联的蛋白质磷酸激酶的激活；这些激酶的底物以及各种信号子的级联激活过程中起着决定性的作用。而且在转录响 应的各个步骤的发生进行过程中起着重要的调节控制作用。所以，认识并掌握这个机制将有利于加深对信号转导的转录响 应的理解。 (二) 信号转导转录晌应的专一性及其调节 为什么同样的信号刺激作用于不同的细胞可以引发不同的细胞行为变化?为什么不同的信号刺激作用于同样的细胞可 以引发类似的细胞反应?其原因就是因为信号转导的转录响应有专一性。 所谓信号转导的转录响应的专一性指的是： （l） 细 胞是如何将给定的信号刺激专一地使至于激活特殊的转录因子的? （2）被专一激活的转录因子是如何使专一基因表达的? （3）不同性质和强度的信号刺激是如何产生不同的转录响应的? 这些都是生命科学研究中的热点问题。 l，转录因子激活的专一性 已经知道，不同的信号转导途径可以分享相同的信号分子，特别是信号转导途径中起关键作用的蛋白质激酶和一些通 用的转录因子。那么，不同的信号转导途径的特殊性，或者说它们自己的个性是如何维持的呢? 是什么因素控制着一个特关于信号转导研究的若干问题 殊的转录因子专一地对某一个特殊的信号转导途径作出响应，从而使细