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紫外可见分光光度计的技术指标
　　光度准确度（ Photometric Accur acy ） 是一个非常重要的技术指标。任何使用者买一台紫外可见分光光度计都是为了分析工作, 进行分析工作的目的是出数据, 其基本要求是数据要准确可靠, 这在很大程度上取决于仪器的光度准确度这个最重要的技术指标及其有关指标。　　一、光度准确度的表示方法　　目前, 国际上对紫外可见分光光度计光度准确度的表示方法主要有两种:一种是吸光度准确度（ Absorbance Accuracy ） 或吸光度误差（ AbsorbanceEr ror ） , 用AA （或&DA） 表示; 另一种是透射比准确度（ Transmittance Accuracy） 或透射比误差, 用TA （ 或&DT） 表示。国外的紫外可见分光光度计制造商, 绝大多数都给出吸光度准确度或吸光度误差AA （ 或&DA） , 并都指出在什么吸光度情况下测量。如美国Varian 公司的Cary500、Lambda900 等仪器, 都给出在1. 0Ab s 时, 吸光度准确度或吸光度误差AA （或&DA） 为&0. 003Ab s。　　但国外有少数仪器制造商在给出吸光度准确度或吸光度误差AA （ 或&DA） 的同时, 还给出透射比准确度或透射比误差TA（或&DT）。我国生产紫外可见分光光度计的厂商, 很多都在给出吸光度准确度或吸光度误差AA （ 或&DA） 的同时, 也给出透射比准确度或透射比误差TA或&DT）。　　一般来说，只给透射比准确度或透射比误差TA （或&DT） ,而不给吸光度准确度或吸光度误差AA （或&DA） 是不合适的, 原因如下:　　第一,若给出TA （或&DT） = &0. 5%T, 而不讲明在什么透射比情况下测试, 就应理解为在0～100%T 范围内的任何地方测试都能达到TA （或&DT） = &0. 5% T。但实际上, 若在10% T 处测量, TA （ 或&DT） = &0. 5% T 时产生的透射比相对误差为&5%。而在90%T 处测量, 则TA （或&DT） = &0. 5% T 时产生的透射比相对误差为&0. 56% , 二者相差很大。也就是说, 不可能在0～100%T 范围内的任何地方测试都能达到TA （或&DT） = &0. 5% T。　　第二, 用户在使用紫外可见分光光度计时, 基本上没有人只用透射比T 和透射比误差T A （ 或&DT）来表示光度准确度和分析测试误差。相反, 大家一般都用吸光度值A 和吸光度误差AA （或&DA） 来表示分析测试结果和分析误差。　　第三, 目前国际上绝大多数使用者, 都是采用吸光度值A和吸光度误差AA （或&DA） 来表示紫外可见分光光度计的分析测试结果和分析误差。　　第四, 吸光度准确度或吸光度误差AA （或&DA） 和透射比准确度或透射比误差TA （ 或&DT） , 在使用时二者在数值上会相差很大。若要把TA（或&DT） = &0. 5% T 换算成AA （ 或&DA） , 则在10% T 处（ 相当在1A 处） ,&0. 5% T 的透射比误差, 产生的AA （ 或&DA ） 为&0. 022A, 而在90% T 处（相当在0. 0046A 处） , TA （ 或&DT） = & 0. 5% T 时产生的AA （ 或&DA） 为&0. 0024A, 这同样是一个惊人的差距。因此, 在给出一台紫外可见分光光度计的光度准确度时, 不管是用吸光度准确度或吸光度误差AA （ 或&DA） 表示,还是用透射比准确度或透射比误差TA （ 或&DT） 表示, 都应该指出在多少吸光度或在多少透射比情况下测试。　　但是, 目前仍有许多厂商在给出透射比准确度或透射比误差TA （ 或&DT）时, 都一律写成&0. 3% T。特别是许多制造厂商对自称是高档紫外可见分光光度计的仪器, 基本上都是写成& &0. 3% T （ 0～100% T ）&。如日本岛津的UV-2401PC、UV-2450PC、UV-2550PC 等紫外可见分光光度计。从理论上讲任何高档紫外可见分光光度计的透射比准确度或透射比误差TA （或&DT） 不可能在0～100% T 内都能达到&0. 3%T 的透射比准确度。　　目前，国内外都有一些厂商在说明书或仪器样本中称&光度准确度&为&测光精度&, 这种称谓混淆了准确（ Accuuracy） 和精密度（ Pr ecision ） 的概念。准确度是指的测量值与理论值之差, 该偏差越小说明测量的数据越准确可靠, 或者说光度准确度越高。而精密度是指的分析测试数据的离散性或重复性, 是指同一操作者, 在一次开机中连续重复多次测试某一吸收峰的吸光度值中最大与最小值之差。该差值越小, 说明该仪器的光度重复性越好。　　正确的说法应该是紫外可见分光光度计的&光度准确度& 而不能说成&测光精度&。光度精密度或光度重复性是指多次测量中的离散性。如3 次或5 次测量中吸光度的最大值与最小值之差即为光度精密度或光度重复性。而准确度则是指实际测量的吸光度值与真值或理论值之差。　　二、影响光度准确度的主要因素　　影响紫外可见分光光度计光度准确度的主要因素有以下几个方面。　　① 仪器的杂散光大小。　　② 仪器的光度噪声。　　③ 仪器的基线平直度。　　④ 仪器的光谱带宽。　　⑤ 试样的来源, 包括样品的制备, 取样的方法。　　⑥ 样品的制备, 包括称量、容量、溶剂、试剂、pH 值、时间、温度等。　　⑦ 比色皿的性能等。　　由此可知, 光度准确度或吸光度误差AA （ 或&DA） 是一个综合性的技术指标。要使用紫外可见分光光度计测得准确可靠的数据, 必须注重上述几个方面的影响。否则, 不可能得到准确可靠的数据。特别应该指出的是, 在给出吸光度误差AA （或&DA） , 同时也给出透射比误差TA （ 或&DT） 时, 二者不能相互矛盾。　　三、光度准确度的标准测试方法　　用于紫外可见分光光度计的光度准确度测试的材料, 应该是纯度高、稳定性好的物质。这些物质中最主要的是铬酸钾（ K2 CrO4 , 一般在碱性溶液中）、重铬酸钾（ K2 Cr2 O7 , 一般在酸性溶液中） 、硝酸钾、中性滤光片等。在碱性溶液中的铬酸钾是一种好材料, 但是因为含有碱性, 不能储藏在普通玻璃容器中, 而需要储藏在石英器皿中, 硝酸钾本身不大稳定。这些都限制了它们的使用。因此, 最好选择易于纯化又溶于酸性介质中的物质, 并且它们的稀溶液也是很稳定的。因此, 重铬酸钾的0. 005mol/ L H2 SO4 溶液经常被使用。　　紫外可见分光光度计的光度准确度测试方法, 目前国内外各生产厂家作法不一, 其主要原因是各国的国家标准不同; 如美国国家标准规定: &选择合适的标准参比材料, 在规定的波长处, 连续测10 个吸光度或透射比读数, 取10个读数的平均值, 实际吸光度或透射比与观测值的平均值之差, 即为光度准确度&　　美国NBS 规定, 在可见区用930 标准片来测定光度准确度, 其标准透射比值分别为10%、20%、30%的中性玻璃滤光片。规定还指出也可用NBS 的931 , 它是一种溶液。而在紫外区内, 则规定用NBS 的203 来测定光度准确度; 它是一种标准透射比值分别为90%、30%、10% 熔融石英滤光片。此外,美国标准还规定在紫外区内, 用户还可以自己配置高纯度的化合物溶液来测定光度准确度。为此, 美国NBS 已发布了铬酸钾（K2 CrO4 ）、重铬酸钾（ K2 Cr2 O7 ）等标准物质可供选用。　　我国在1992 年制订的紫外可见分光光度计国家标准中规定, 用重铬酸钾溶液来测试紫外区的光度准确度, 并明确指出了测试波长。在可见光区规定可用中性滤光片来检测光度准确度, 其标准片的透射比值分别为10%、20%、40%左右; 同时还规定在紫外可见整个区间, 都可用中性滤光片来检测光度准确度, 其标准片的透射比值也分别为10%、20%、40%左右。
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文档介绍：
双光束紫外可见分光光度计
上海佑科仪器仪表有限公司
第一章分光光度计概述 1
1、基本工作原理 1
2、性能指标释义 2
4、使用条件 3
第二章产品特点及安装 4
2、性能指标 4
3、功能介绍 4
4、结构介绍 6
5、仪器安装 8
第三章按键定义与基本操作 9
1、按键面板示意图: 9
2、按键功能描述 9
3、基本操作 10
第四章仪器自检 11
1、显示公司信息 11
2、通讯端口检查 11
3、滤色片定位 12
4、光源定位 12
5、信号检测器检查 13
6、钨灯检查 13
7、氘灯检查 14
8、文件系统检查 14
9、打印机检查 15
10、波长校正 15
11、暗电流校正 16
12、系统参数检查 16
13、自检结束 17
第五章光度测量 18
1、功能说明 18
2、设定波长 18
3、设定测量模式 18
4、校正100%T/0Abs 19
5、测量数据 19
6、删除数据 20
7、保存文件 20
8、打开文件 21
第六章定量测量 22
1、建立标准曲线 22
2、打开标准曲线, 24
3、删除标准曲线 25
4、数据测量 25
第七章时间扫描(动力学) 27
1、功能说明 27
2、时间扫描参数设定 27
3、设定测量模式 28
4、设定时间间隔 28
5、设定测试时间 29
6、设定显示上下限 29
7、数据测试 30
8、测试完毕 30
第八章波长扫描 31
1、功能说明 31
2、系统基线 31
3、设定扫描参数 31
4、修改显示范围 33
5、建立用户基线(校正空白) 33
6、开始测试 34
7、波峰波谷 34
8、数据平滑 35
9、导数光谱 35
10、数据列表 36
第九章多波长测试 37
1、功能说明 37
2、设定测定波长个数 37
3、设定测定波长 37
4、输入计算系数 38
5、校正100%T/0Abs 38
6、数据测试 39
第十章蛋白质/核酸测量 40
1、功能说明 40
2、肽键od238蛋白质测量: 40
3、单链核酸测试(SSDNA) 41
第十一章系统设定 42
1、暗电流测量 42
2、寻找氘灯曲线 43
3、时间和日期设定 43
4、打印机设定 44
5、光源管理 44
6、与电脑联机 45
7、语言选择 45
8、显示数据精度 46
9、蜂鸣器设定 46
10、文件系统 47
11、恢复出厂设定 47
12、系统信息 48
第十二章关闭系统 49
第十三章仪器维护与保养 50
1、日常注意事项 50
2、仪器维护与保养 50
第十四章仪器故障排除 51
1、开机故障 51
2、自检中故障 52
3、其它故障 54
第十五章灯源更换 55
1、钨灯更换 55
2、氘灯更换 56
第一章分光光度计概述
1、基本工作原理
1)吸收的本质:分光光度法是利用物质对不同波长光的选择吸收特性而建立起来的分析方法。通常利用棱镜或光栅分光来取得单色光,使单色光连续地依次通过溶液,并测得该溶液对每一波长的吸收,得到吸收光谱曲线。
吸收光谱来源于物质对光的选择吸收,这是物质的宏观现象,而吸收的本质是分子内部运动和光相互作用的结果。当物质的分子吸收一定能量或波长的光谱后,透过的光谱中有些波长被吸收就形成了吸收光谱。吸收的能量愈小,则相应的光的波长,吸收峰出现在较长波段。当吸收在红外区时形成红外吸收光谱,如果吸收能量愈大,则相应的波长愈短,吸收峰出现在较短波段,当吸收在紫外区产生紫外吸收光谱。
2)吸收定律—朗伯比耳定律:当一束平行单色光通过均匀的溶液时,其吸光度与溶液的浓度和厚度的乘积成正比。
其数字表达式:A=KCL=LogI0/I=-LogT
吸收定律数字表达式成立的前提:①,入射光为单色光,②,吸收过程中各物质无相互作用,各物质吸光度具有加和性,③,光与物质的作用仅限于吸收过程,没有荧光散射和光化学现象,④,吸收物是一种均匀分布的连续体系,
3)影响分光光度法的原因:
a,辐射与物质的非吸收作用引起的误差,
b,荧光与光化学反应的影响,一般说来,荧光对分光光度测量产生的误差可以忽略,多数情况下显色体系的荧光效率很小,而且荧光发射是各向同性,只有一小部分沿着透射光方向进入检测器,使测量吸光度偏低,产生负偏离。荧光对吸收测量的影响极大程度上决定于仪器的吸收池和检测器光学设计,
c,反射和散射,吸收定律只适用于均匀介质的吸收体系,浑浊溶液因散射使实测吸光度增加,导致偏离比耳定律,
d,仪器的非理想性引起的误差,
e,复色光对比耳定律的偏离,大多数光度计只能获得接近于单色光的狭窄的光通带,实际上仍是有复色光性质,可导致偏离比耳定律。偏离的大小取决于二单色光的摩尔吸光系数差△ε,|△ε|很小时,可近似认为是单色光,在低浓度时,工作曲线仍为直线,但浓度较大时,随浓度增大,A-C曲线弯曲愈严重,故比耳定律只适用于稀溶液,
f杂散光,杂散光是指进入检测器的处于待测波长光谱带宽范围外的不需要的其它波长组分。其主要来源于分光光度计色散元件棱镜或光栅、反射镜、透镜表面的散射,单色器内壁灰尘及其它元件伤痕的反射和漫射等,杂散光可引起严重的测量误差。在仪器能量处于最小的波长处,杂散光通常处于最大值(如氘灯220nm,钨灯340nm),
g,狭缝宽度,狭缝宽度不仅影响光谱的纯度,也影响吸光度值。在定量分析时,为了得到足够的测量信号,应采用较大的狭缝,在定性分析时则采用较小的狭缝,当出射狭缝和入射狭缝的宽度相等时,狭缝宽度引起的误差最小,
h,波长标度尺的误差,波长标度尺即仪器的波长准确度,如误差较大或未作校正,将光谱测量产生误差,即影响吸光度测量的准确度(在吸收光谱的尖峰处更为显著),
i,不平行入射光的影响,比耳定律的前提条件之一是采用平行入射光束,以保证全部光束通过同一厚度的吸收介质,当入射光束偏离平行性较大时,就明显导致偏离比耳定律。如果仪器中光束中等强度偏离平行性,引起的吸光度测量误差一般在0.5%以内;
j,光度标尺的误差,光度标尺即透射比准确度,其误差大小直接影响光度测量的准确度。
2、性能指标释义
1)光学系统:通常是指光学系统的结构形式,目前,国际国内光度计行业常采用的机构为自准式和CT式两种结构;
2)波长范围:指光度计所能进行测试的波长最大值和最小值之差;
3)波长准确度仪器显示波长与真实波长的接近程度,即仪器设定波长与实际波长的差值。每台光度计都要在很多个波长点检查波长准确度;波长准确度是分光光度计的一项重要技术指标,它对定性、定量及结构分析结果影响极大。检查波长准确度的方法很多,如用标准镨钕滤光片、氧化钬滤光片、氧化钬波长标准溶液、氘灯或低压***灯发射的光谱线及干涉滤光片等。
4)波长重复性:波长1
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紫外可见分光光度计的使用
紫外可见分光光度计基本原理及分析技术紫外可见分光光度计基本原理 与分析技术德 国 耶 拿 分 析 仪 器 股 份 公 司- 1 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术紫外可见分光光度计基本原理与分析技术 允许打印和进一步使用 原文来自 Analytik Jena AG 2007 版 翻译：汪素萍-2-紫外可见分光光度计基本原理及分析技术目录1 定义和基本原理 ....................................................................................................................... 5 1.1 光的吸收及光谱 ................................................................................................................ 5 1.2 透射和吸收 ........................................................................................................................ 6 1.3 定性分析 ............................................................................................................................ 6 1.3.1 光谱与结构 ..................................................................................................................... 6 1.3.2 影响光谱的因素 ............................................................................................................... 7 1.3.3 定性信息 ......................................................................................................................... 7 1.4 定量分析 .............................................................................................................................. 8 1.4.1 Lambert-Beer 定律 ........................................................................................................ 8 1.4.2 标准曲线的绘制 ............................................................................................................. 8 1.4.3 用于光度测量的样品制备 ............................................................................................. 9 1.5 动力学 ................................................................................................................................ 9 1.6 UV VIS 分光光度计的更多应用 ................................................................................... 10 1.6.1 蛋白和 DNA 分析 ........................................................................................................... 10 1.6.2 DNA 熔点测定 .............................................................................................................. 11 1.7 导数光谱 .......................................................................................................................... 12 1.7.1 色度分析 ....................................................................................................................... 13 1.7.2 膜厚度的测定 ................................................................................................................. 14 2 UV VIS 分光光度计的结构 ............................................................................................... 16 2.1 UV VIS 分光光度计的组成 ........................................................................................... 16 2.2 光源 .................................................................................................................................. 16 2.3 分光系统 .......................................................................................................................... 16 2.3.1 单色器系统 ................................................................................................................ 16 2.3.2 多色器系统 ................................................................................................................... 17 2.4 光谱带宽 .......................................................................................................................... 18 2.5 样品室 .............................................................................................................................. 19 2.6 检测器 .............................................................................................................................. 19 2.7 单/双光束 ......................................................................................................................... 19 3 比色池 ................................................................................................................................... 20 4 UV VIS 分光光度计的附件 ................................................................................................ 23 4.1 简单池架一览表 ................................................................................................................ 23 4.1.1 应用： 快速测试池用于牛奶中钙的测定 ..................................................................... 24 4.1.2 应用： 微量池和可调池架用于 DNA 分析 .................................................................. 24 4.2 流通池测量 ...................................................................................................................... 25 4.2.1 应用： 用流通池定量测定磷酸盐 ................................................................................. 25 4.3 多联池 .............................................................................................................................. 27 4.3.1 应用： 多联池用于酶动力学 ......................................................................................... 27 4.4 用于固体样品测定的附件 .............................................................................................. 29 4.4.1 固体样品架和反射附件 ............................................................................................... 29 4.4.2 应用： SPECORD?透射测量法测定膜厚度 ................................................................. 29 4.4.3 应用： 积分球用于牙齿表面白和黄指数的测定 ......................................................... 30 4.4.4 应用： 防晒霜的测定 ..................................................................................................... 32-3-紫外可见分光光度计基本原理及分析技术4.5 光纤探头 .......................................................................................................................... 33 4.5.1 应用： ATR 探头用于颜料测定 ..................................................................................... 33-4-紫外可见分光光度计基本原理及分析技术11.1定义和基本原理光的吸收和光谱电磁辐射与固体、液体或气体的相互作用产生各种现象，比如吸收、反射或散射。UV VIS 分光光度计是专用于研究紫外和可见范围内辐射与物质间相互作用的。 波长波数图 1 电磁辐射当原子或分子吸收电磁辐射就会从基态转变为高能态的激发态， 在这一过程中吸收特殊波长 的能量。和原子相比，各种分子状态有着相当宽的能量范围。在红外区受激，分子会转动和 振动，而在可见和紫外区则可以通过价电子观察到特定能级(量子)的吸收。图 2：吸收和吸收光谱(抗坏血酸)这些量子的能量可以用辐射的波长来定义。波长越短，量子的能量越高。各吸收点的位置和 相对的吸收值的大小可以用 UV VIS 分光光度计测定。-5-紫外可见分光光度计基本原理及分析技术1.2透射和吸收如果入射光的强度I0 透过一个厚度为d的介质，除反射和散射的损失外，光强度会因样品的 特征吸收而减弱。此时的出射光(透射)强度为I。图 3：透射透射 T 用以下公式定义：或（公式 1）样品的吸收值 A 用以下公式表示：（公式 2）和透射形成对比，溶液的吸收随光强度的减弱而增加。1.31.3.1定性分析光谱与结构来自分子吸收带的 UV VIS 光谱通常是相对较宽的。和近红外光谱（产生许多窄带吸收）相 比，提供的定性信息相对较少。有机分子在 UV VIS 范围内的吸收通常通过生色基团 (颜色 表现的种类)产生。下表 1 中列出了各种生色基团及其最大吸收。表1生色基团 羰基-(酮) 羰基-(醛) 羧基氨基氮氮键硝基-分子式 RR’C=O RHC=O RCOOH RCONH2 -N=N-NO2实例 丙酮 乙醛 醋酸 乙酰胺 重氮甲烷 硝基甲烷最大吸收 271nm 293nm 204nm 208nm 339nm 280nm如果使生色基团与另一个共轭，吸收带会先相长波方向位移。1,5-己二烯 （无共轭） 最大吸收 185nm1,3,5-己三烯 （无共轭） 最大吸收 250nm-6-紫外可见分光光度计基本原理及分析技术独特的环状不饱和烃在 UV VIS 范围表现出非常有特点的吸收带。图 4：苯蒸气的 UV VIS 光谱图1.3.2 影响光谱的因素 对波长而言，精确值与特效取代基和溶剂二者有关。通常随着溶剂极性的增加，吸收光谱会 发生蓝移(向短波方向)；随着溶剂极性的减弱，会红移(向长波方向)。表 2溶剂（极性逐渐增加） n-（正）己烷 氯仿 二乙醚 乙醇 水透射限于 nm 处 195 240 200 200 185其他参数，比如 pH 值和温度等，也会影响波长的位置和最大吸收强度。 1.3.3 定性信息 UV VIS 分光光度计可以给出以下定性信息： 纯物质的鉴定 HPLC 分离后纯物质的鉴定（使用二极管阵列系统更合适） 纯度测试（例如：蛋白质或 DNA/RNA） 蛋白和核酸的熔点曲线 饱和与不饱和化合物的识别 酮类和稀醇形态的识别 羰基带的鉴定 键合关系和取代效果的解析 酶活性-7-紫外可见分光光度计基本原理及分析技术1.4定量分析1.4.1 Lambert-Beer 定律 Bouguer-Lambert-Beer 定律表达吸收和浓度的关系。 Bouguer （） 吸收值与光程长度成正比 Lambert （） Beer （） 吸收值与摩尔浓度成正比（公式 3）A(λ） ε(λ） c d -吸收波长λ 摩尔的对数吸收波长（L mol-1 cm-1） 浓度（mol L-1） 池程长（cm）Lambert-Beer 定律是限定性定律，在以下情形下不成立： 待测物质的浓度太高（& 0.01M/I)； 待测物质和溶剂间有副反应； 使用的幅射线非单色； 杂散光 (散射光，例如：由物体引起的反射现象)。 这就意味着，Lambert-Beer 定律的正确性需要研究。 该研究为校准过程。 1.4.2 标准曲线的绘制 绘制标准曲线就是测定已知浓度样品(标准溶液)，用各浓度值和对应的各测定吸收值绘制的 曲线。 Lambert-Beer 定律在校准曲线的线性范围内应用。 非线性校准曲线在一定程度上也是可以用的，这就扩展了校准范围。图 5：标准曲线-8-紫外可见分光光度计基本原理及分析技术1.4.3用于光度法测定的样品制备在大部分情况下，须将各待测样品转化为有色化合物。试剂的使用即为显色过程： 自然界的无机物。尽管广泛存在，但不被使用。 自然界的有机物。已知的有机试剂超过 7500 种，我们看到的颜色是配位体键合和电荷 转移化合物的结果。 表 3 显示了可以用 UV VIS 分光光度计测定的参数选择，如下所示。表3铝 氨水 铵 铅 硼溴化物 BSB 镉 氯 次氯酸盐氯化物 铬酸盐 CSB 氰化物 铁氟化物 金 碘 钾 铜锰 钼 钠 镍 硝酸盐亚硝酸盐 臭氧 苯酚 磷酸盐 不溶物氧 银 总氮 硫酸盐 硫化物亚硫酸盐 阴离子表 面活性剂 TOC 过氧化物 锌1.5动力学动力学研究随吸收值变化对应的时间运行轨迹，也就是化学反应的速度。图 6： 各最大吸收值的时间变化所表明的动力学测定结果的三维图。这些时间变化值可用于求得反应速度（例如：随线性回归对应的斜率的测定） 。 酶的浓度也可以以时间C溶解方式（动力学）测定。这种方法测定的是酶基浓度随时间的变 化。测定的时间曲线的斜率与酶的浓度成比例。-9-紫外可见分光光度计基本原理及分析技术图 7：用于动力学测定的部分数值以食品化学为例，用于动力学反应测定的一些重要参数见表 4。表 4醋酸盐 酒精 甲酸 维生素 C 琥珀酸胆固醇 柠檬酸盐 甲醛 果糖 半乳糖葡萄糖 谷氨酸盐 甘油 尿素 联氨羟基丁酸 异柠檬酸 乳酸盐 乳糖 麦芽糖草酸 蔗糖 山梨(糖)醇 淀粉 木糖醇1.6UV VIS 分光光度计的更多应用1.6.1 蛋白和 DNA 分析 在其基本结构中，DNA 由两个脱氧核糖核酸长链组成，这两个脱氧核糖核酸链交结成一个 双螺旋结构。该链在基本组分为嘌呤和嘧啶(Pu-Py)碱基，腺嘌呤和胸腺嘧啶(A-T)及鸟嘌呤 和胞嘧啶(G-C)间用氢键连接起来， 这些基本组分形成 DNA 在 UV 区的特征吸收， 260 nm 在 处具有最大吸收峰。 测定既是在 260 nm 处测定吸收值和用 Lambert-Beer 定律进行计算浓度。图 8： DNA 标准溶液在 260nm 和 280nm 处的特征吸收- 10 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术蛋白质是 DNA 溶液中一种易被沾污的物质。核酸的纯度可以通过测定 260 nm 和 280nm 的 吸收值比值进行计算，如果该比值假设在 1.8 和 2 之间，则纯度为 70% - 95%。 蛋白质在 280nm处有一个最大吸收，主要可归于氨基酸(尤其是色氨酸和酪氨酸)的芳香环系 统。所以，蛋白质可以用Lambert-Beer定律在 280nm处直接测定吸收值；蛋白质浓度的测定 也可以通过使用生色试剂， 比如Bradford 试剂 （用考马斯亮兰G-250， 最大吸收在 595nm处） ， 2+ 缩二脲试剂（把从缩二脲试剂和组氨酸链环的氧原子间的Cu 化合物染成紫罗兰色，最大吸 收值在 546 nm处） 和Lowry 试剂 （缩二脲的联接、 福林和钼蓝反应， 最大吸收在 540-750 nm 之间)。 1.6.2 DNA 熔点测定DNA 双螺旋解链既是升温引起的熔化的过程。 这里的熔化温度 Tm 是双螺旋结构解链了一 半的温度。碱基对的分离结果（增色变化） ，随着温度的提高，在 260 nm 处的吸收增加。为 了测定温度-吸收值对应的可能产生的变化，需要非常精确地控制温度。帕尔帖温度控制精 度可以到达 0.1℃，比常规的水浴温度控制更好。熔点曲线可以用光谱中的任何波长进行计 算光谱。图 9： 不同温度下的 DNA 光谱- 11 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术图 10：DNA 在 260nm 处的熔点曲线例如，Tm 值可以在测定熔点曲线的曲线图上查到。该熔点温度取决于当时的碱基对。具有 高比例 GC 对的 DNA 显示出比 AT 碱基对较多的 DNA 更高的 Tm 值。 57.7℃的 Tm 值是 DNA 用于诊断小牛斑疹伤寒病的实例。1.7导数光谱导数光谱包括对用于定性和定量测定的光谱进行求导。 紫外和可见波长范围内， 许多非常重 要的样品的定性和定量分析是应用导数光谱才能完成的。 导数光谱精细结构中的准确信息可 在解析重叠光谱时认定化合物。 导数光谱也已成为用于光谱干涉对待测物影响的研究。 通过获取光谱的导数， 可以抑制背景 信号在测定光谱上的重叠，且更有效地加强吸收系数。 用 UV VIS 分光光度计进行 Lambert-Beer 定律的下列导数： 输出光谱 （公式 3）1 阶导数公式 4- 12 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术2 阶导数公式 53 阶导数公式 64 阶导数公式 7导数可以设为正值和负值， 因为第一导数和第二导数在吸收光谱的斜坡中每一个变化都是非 常灵敏的，导数光谱法是适用于分析重叠吸收光谱的很好的方法。为此，导数光谱常被用于 分析工作的微量测定，也就是定量测定。切线、波峰-波峰和波峰-波谷法等都可用于计算。 1.7.1 色度分析颜色是物质的重要特性。 颜色可以通过计算固体或不透明样品的反射光谱测定， 也可以通过 测量半透明样品，例如树脂、石油及清洁剂等的透射获得。图 11： 肉眼看到的颜色肉眼看见的各种颜色和其被吸收的补色。 例如， 黄色溶液吸收蓝色范围内的光， 如下表所示。- 13 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术吸收色 紫罗兰色 蓝色 绿蓝色 绿色 黄绿色 橙色 红色吸收波长[nm] 380 C 435 435 C 480 480 C 490 490 C 560 560 C 595 595 C 650 650 - 780补色 黄绿色 黄色 橙色 红色 紫色 绿蓝色 蓝绿色肉眼的视觉过程是带有标准数据的数学模型， 其结果是一整套客观且独特的描述样品颜色的 色值。 计算考虑到CIE XYZ颜色间隔*在国家和国际标准，如DIN 5033 或ASTM E-308 中的定义。* CIE XYZ 颜色间隔是一种尝试，它通过国际代理 de I'eclairage 呈现以人的色感为基础的颜色。图 12：蓝色溶液的颜色测定（左图：透射光谱；右图：表示颜色图表）1.7.2 膜厚度的测量 光在膜上的反射产生干涉光谱，可用来计算膜的厚度。使用可变角度的反射附件，用一个定 义了的反射光谱可以进行膜厚度的测定。 入射光束 反射分束 1 反射分束 2膜厚度图 13：测定膜厚度的干涉模型- 14 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术干涉光谱的产生取决于几何路径的长度和折射率。 用几何路径长度和折射率的乘积计算光学 距离。（公式 8）这里 d 是样品的厚度；m 在零级最大之后，干涉最多的数值；n 样品的折射率；Θ使用的 反射角度；λ1零级干涉的最大波长，λ2 第二干涉的最大波长（λ1 &λ2） 。 下图显示聚酯样品的干涉光谱。在这个例子中，干涉现象是很容易被确定的。反射聚酯nm图 14：测定膜厚度的干涉光谱的实例（入射角为 450时测定 6.45μm的最大吸收）- 15 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术22.1UV ViS 分光光度计的结构UV VIS 分光光度计的结构现代 UV VIS 分光光度计通常有以下几部分组成： 光源 分光系统 样品室 检测器 模拟数字(AD)转换 计算机（带显示器）和其他外部设备2.2光源UV VIS 分光光度计主要使用连续光源，比如合并使用氘灯（UV 区）和卤素灯（VIS 区） 。图 15：氘灯和卤素灯的能量分布2.3分光系统干涉滤光片、 棱镜及全息光栅等都可以做光度计的分光器， 也有单色器系统和多色器系统之 分： 2.3.1 单色器系统 普通的光度计有两种类型：单色器系统和多色器系统。在单色器系统中，光在到达样品之前 就已经被分开了，所以通过样品的光是单色光。因此，即使是很低的吸光度，测定的结果也 是非常精确的。- 16 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术光路图 光源 入射狭缝 分光器 出射狭缝 样品 检测器图 16：单色器系统的光路图（例，SPECORD 40）?特点： 出射狭缝可调 很好的线性 信噪比高 光谱扫描2.3.2多色器系统在多色器系统中，光源的全部光谱都通过样品后才被分光，这特别适于快速光谱。 光路图 光源 样品 入射狭缝 固定计量单 位分光系统 检测器- 17 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术图 17：多色器系统的光路图（例：SPECORD? S 600）特点： 固定入射狭缝 同时快速获取光谱 开放式样品室 非常好的波长重现性2.4光谱带宽众所周知， 甲苯在紫外区的精细结构光谱的特点是光谱带宽对分辨率的影响的典型实例。 计 算在 266 和 269 nm 处的最大值和最小值的比值，带宽越小，比值越大，分辨率越好。图 18：光谱带宽对分辨率的影响下表显示了以不同的光谱带宽获取的在己烷中甲苯的标准光谱。- 18 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术 表5狭缝 4nm 2nm 1nm 0.5nmA最小 266nm 0.4 0.A最大 269nm 0.6 0.9A最大/A最小比值 1.0 1.4 2.0 2.3甲苯的精细结构在 0.5 nm带宽下清晰可辨，这里也以A最大/A最小的高比值显示。但是用较小的 带宽测定比用较多带宽测定时的信噪比低，这是由于落到检测器上的能量较低。因此，要在 接近检出限处测定时，用较大的带宽（例如 4 nm）更好些。如果出口狭缝较大，到达检测 器的能力就多，信噪比也就更高，测定低吸收样品的结果也就可靠得多。2.5样品室许多样品是液体或以溶液的形式测定，所以要将样品倒入比色池后放入光度计的样品室中。 当然，气体样品和固体样品使用特殊附件也是可以用光度法进行测定的。2.6检测器光电二极管 光电倍增管 灵敏度高，达到 106A/W 噪声低 动态范围宽，约 106 检测器表面积较大，达到 50mm2UV VIS 分光光度计中使用的检测器主要是光电二极管或光电倍增管（PMT） 。 优点 光谱灵敏范围宽(190 - 1100 nm) 对以下情形低敏感性： - 过度曝光 - 外部机械干扰 - 外部磁场影响 运行电压低 无附加电压或供电装置 灵敏度约为 0.5 A/W，需要后置放大 动态范围 104 C 105 接受器表面有限（约 10x10 mm2）缺点需要电压分配器将电压调制 1200 V 对过度曝光敏感（有破坏的危险） 对外部机械干扰及磁场影响敏感 光谱灵敏范围有限（180 - 650 nm, 180 - 900 nm） 相对昂贵（100 → 1000 欧元） 附加电源（约 200 欧元）2. 7单光束单/双光束系统单光束光度计有着较好的信噪比，因为不需要将能量分为两束。 分束技术（SBT） 具有参比光束技术的分光光度计结合了单光束光度计高光通量和双光束系统稳定的优点。 双光束 双光束光度计显示出较好的长期稳定性，因为测定结果总是将两束光的能量相比较得到的， 漂移现象在很大程度上得到了补偿。 双光束系统也可以改变标准样品直接补偿。- 19 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术3比色池最好的用做为比色池的材料是聚合材料，如丙烯酸。这种比色池只能在大于 300nm 时 使用，因为塑料在短波有着较强的吸收。 玻璃比色池比塑料比色池稍贵一些，但使用寿命要长些，可以用好几年。玻璃比色池 不能用于小于 320 nm 时的测定。 石英比色池是用高纯合成二氧化硅制成的，有着和玻璃比色池一样的使用寿命，但它 们的优点是在紫外区也可以使用。图 19：各种玻璃材料的光学性能不同类型的比色池的使用取决于应用的需求。标准比色池图 20：不同池程长度的常规比色池- 20 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术微量比色池半微比色池 微量比色池 超微比色池 （10mm，1400μl） (10mm，400400μl) (自 180μl…起)图 21:半微、微量、超微比色池超微比色池 （…最小至 5μl）碟型池 光纤超微测量池，用于 0.7 - 5μl 样品（0.2 或 1mm 池程）图 22：碟型光纤超微测量池的功能原理- 21 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术流通微量池 PL 10mm，750μl PL 50mm，3750μl图 23：各种流通池流通微量池 PL 10mm，450μl PL 50mm，2250μl流通超微量池 PL 10mm，80μl PL 50mm，370μl吸抽池带塑料漏斗的吸抽池 用于小池程的比色池隔离窗用于不同池程的窗板 （0.01 C 0.5mm）比色池隔离窗支架- 22 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术4 紫外可见分光光度计的附件在分光光度法中可以使用各种特殊附件以满足各种应用的需求。用于单个样品的简单池架， 各种恒温池架， 用于高通量样品测定的调节或自动进样装置， 恰当的附件选择几乎可满足所 有的应用需求。4.1 简单池架一览表100mm 池架 长程池，提高测定灵敏度快速测定池架适用于简单快速的定量分析。 圆柱型池中已加好化学试剂或准备 加入。 反应后，圆柱池可在光度计中直接 测定。吸收管架适用于气态样品带搅拌或不带搅拌的 恒温池架适用于酶动力学，例如：在 37℃。 用外置水浴控制温度用于微量池的可调解 池架适用于少量样品的微量池和超微量 池帕尔帖恒温池架及 PCT 控制单元适用于少量样品的微量池和超微量 池- 23 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术4.1.1 应用：快速测定池用于牛奶中钙的测定 方法 光度法测定乙二醛 - 双（2-羟基） ，按以下 Carrez 方法净化、消解。 试剂 Spectroquant? 钙试剂，Merck，试剂编号：No. 1. Bioquant? Carrez，Merck，试剂编号：No. 1. 氢氧化钠溶液 1 mol/L，Merck，试剂编号：No. 1. Neutralit? 条棒指示剂 pH 5-10，Merck，试剂编号：No. 1. Oxisolv? 消解试剂，Merck，试剂编号：No. 1. 消解基本试剂，Merck，Art. 1. 微波消解仪 MW 500，Merck，Cat. No. 1. 水 GR，Merck，Cat. No. 1. 样品制备 搅拌着分别加入 5 ml Carrez-1 和Carrez-2 溶液于 5 ml牛奶中。为便于分析，将生成的粘稠 溶液用少量水稀释，然后用 1 mol/L 氢氧化钠调节pH为 7.5 - 8.0（用Neutralit? 条棒指示剂 pH 5-10 检查） 。混匀，并转移至 250 ml容量瓶中，加入水定容。摇匀，不溶物用折叠滤纸 过滤，取 10 ml滤液和 500 mg (= 5 量匙) Oxisolv?一起放入消解罐。拧紧消解罐盖，在 500 瓦下消解 65 s，然后将消解罐冷却 5 分钟，摇匀后打开。此溶液即可用于钙的测定。 分析 在 550 nm 处测试样品 计算 含量计算 mg/l = 测定值 mg/l x 504.1.2 应用：微量池和可调池架用于 DNA 分析 尤其是对于生化样品， 通常只有几微升样品可以用于分析， 因为样品材料通常都是非常昂贵 的。为此，需要使用半微和微量池进行光度法分析。使用可调式池架，确定测定光束以最佳 状态通过排泄流通样品池，确保测定的可靠性。 要测定 DNA 浓度，在 260 nm 处测定吸收值，需要用非常纯的水做参比。要测定浓度，用 光程 1 cm 的比色池进行测定，等式中输入 500 的因数，用于双-线 DNA（ds） ，33 用于单线 DNA（ss）和 40 用于 RNA。 浓度[ng/μl] = A (260) * 因数 500 用上述等式测定 ds DNA 的浓度，并列于表 6 中：- 24 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术表6 吸收值 0.007 0.017 0.033 0.074 0.150 0.290 0.601 1.161 2.154 浓度[ng/μl] 3.50 8.50 16.67 37.17 75.17 145.17 300.33 580.50 1076.83 标准偏差[ng/μl] 0.50 1.00 0.29 2.02 1.76 2.36 7.18 9.64 13.294.2流通池测定适用于流通池吸样系统APG自动进样器和吸样系统4.2.1应用：用流通池定量测定磷酸盐绪论 磷酸盐的测定是水和废水分析中常用的方法。 由于废水的排放和农用肥料残留物的渗漏， 地 表水中可能会含有相当高含量的磷酸盐。 在磷酸盐的定量测定中，将钼酸铵、酒石酸锑钾和抗坏血酸混合反应试剂加入样品，用磷酸 氢钾做标准溶液。 定量分析包括绘制标准曲线和样品测量， 在常规测定中经常使用流通池， 以使工作量达到最 小。特殊附件吸样系统必须使用流通池才能工作，此系统包括用于 1、2、5cm 流通池的可 调支架和一个促进流通的泵单元。以下示意图说明了吸样系统是如何工作的。- 25 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术图 24：吸样系统的工作原理样品制备 准备下列溶液配制反应混合试剂： 溶液 1：溶解 40g 钼酸铵于 1L 蒸馏水中 溶液 2：溶解 2.6 g L(+) 抗坏血酸于 150 ml 蒸馏水中 溶液 3：溶解 2.7 g 酒石酸锑(111)钾于 1L 蒸馏水中 溶液 4：25％H2SO4 250 ml 溶液 4，75 ml 溶液 1，150 ml 溶液 2 和 25 ml 溶液 3 混合在一起制成反应溶液。该 反应溶液和溶液 2 应该每次现用现配。 取 40ml 样品或标准于 50 ml 容量瓶中，加入 8 ml 反应混合试剂，并滴加混合试剂至 50 ml。 10 分钟后，在 700 nm.处测定吸收值。 参数设置 名称 循环 显示 校正 换灯波长 测定模式 波长 积分时间[s] 附件 泵时[s] 磷酸盐 不 吸收 参比 320nm 波长 700nm 0.2 吸样系统 30 标准曲线- 26 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术4.36-联池多联池有 1, 2, 5 cm 池；带水浴或不带水浴； 帕尔帖温度控制；带搅拌或不带搅拌转盘式池架用 15 个 1cm 比色池8-联池带或不带温度控制（水浴或帕尔帖） ； 可选择搅拌；可使用双光束测定（2×8 联用）50-联池用于 50 个 1cm 比色池高通量样品测定4.3.1应用：多联池用于酶动力学绪论 在动力学测定中，时间随反应组分浓度的变化而变化，在一个波长处，以短的时间间隔进行 较长时间的测定，测定光度计可检测得到的特性。在某一时段内，吸收值的变化涉及的反应 速度。通过多联池的使用，可以同时进行几个动力学的测定。 多联池的运行模式 除常规模式外，这里也显示时间循环模式，用于样品的更换。标准运行模式图 25：多联池运行选择缓慢运行模式- 27 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术在常规运行中，单个样品的全部测定在下一个样品开始测定前完成。对于动力学测定而言， 就意味着一个样品的完全反应动力学测定要在开始下一个反应动力学以前完成。 然而，对于长的动力学测定，测定可以被优化，且以时间-间隔方式循环测定样品。在缓慢 的动力学运行模式中，且总是以相同的样品开始时，在下一个循环开始前，所有样品在其各 自的循环中连续测定着。 应用实例 在下面的实例中介绍了乳酸盐与氨基乙酸缓冲液中的乳酸脱氢酶和 NAD 的动力学反 应。测定乳酸盐的一个空白值和三个不同的浓度值。在 340nm 处进行测定，每个测定 点需要在 10 分钟的总测定时间上延长 30 秒。参比测量在仅靠着多联池的第一个位置 上的空池进行。样品表和有层次的动力学曲线在测定结束时以曲线图的格式自动在视 窗中形成。 样品 空白 浓度 1 浓度 2 浓度 3 开始 5 5 5 5 结束 30 30 30 30 因数 1 1 1 1 斜率 0.3 0.6 R2相关系数 0.4 0.4 结果 0.3 0.6图 26：用多联池测定动力学的结果表达任意可选范围可用于计算斜率，该斜率也可以用一个因数予以增加。R 相关系数表明以直 线测定时的线性相关性及其精度。2- 28 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术4.4固体样品测定附件4.1.1 固体样品架和反射附件 固体样品架 用于固体样品（比如玻璃）的透射测定绝对反射测定平滑表面 的反射可变角度反射 附件测定平滑表面 的反射， 测量层 厚度反射测量用积 分球粉末或固体粗 糙表面漫反射， 散射的测量4.4.2应用：SPECORD?透射测量法测定膜厚度设置下列参数，用于透射法测定胶片的膜厚度。 循环： 校正： 显示： 换灯波长： 狭缝： 不循环 参比 透射 320nm 0.5nm 测定模式： 范围[nm]： 阶梯宽度[nm]： 积分时间[s]： 附件： 阶梯模式 350－700 0.2 0.2 无用空气或一个未涂层的胶片做参比测量，在两个情形中，透射光谱在大约 535 nm 处显示干 涉图形。下图中的曲线显示了在相应的 530~700 nm 范围之间的光谱。- 29 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术图 27：胶片试样涂层以空气为背景的透射光谱（平滑的用 25 个采样点)图 28：胶片试样涂层以未涂层胶片为背景的透射光谱（平滑的用 25 个采样点)由于减少了未涂层胶片的透射, 用以空气做背景的参比测定获得其他透射值比用未涂 层胶片为背景的参比测定。然而，这一有意思的干涉光谱是自然的，是仅与样品有关 的。 通过光谱测定专用软件，应用公式 8 可以测定膜厚度。 以空气做背景 m λ1[nm] λ2[nm] n Θ d[μm] 27 535.0 535.2 1.5 0 20.6 以参比胶片做背景 26 698.4 690.4 1.5 0 20.64.4.3 应用：积分球用于牙齿表面白和黄指数的测定 Ulbricht 球体（积分球）特别适合用于固体、液体和粉末样品的透射和反射测量。在下面的 应用中，记述了一个分析牙齿表面的方法并予以评价。获得的结果是各自的反射光谱，由此 可以计算白色和黄色指数。 白色指数是要把类似的阴影与理想的白度作比较， 黄色指数描述 了一种光泽的缺失和颜色的灰度梯度（DIN 6167） 。- 30 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术操作规程 积分球可以和 SPECORD?一起使用。选择以下参数，用于不同牙齿样品的分析： 光谱范围 模式 显示 积分时间 步宽 速度 附件 循环 光谱带宽 380 C 780nm 扫描 反射 0.10s 1nm 10nm/s 积分球 不循环 4nm结果 从牙齿样品 A、B 和 C 获得如下光谱：反射图 29：用积分球测定牙齿样品的反射光谱评价 用Analytik Jena AG色度软件进行评价，该应用软件提供计算白色和黄色指数的选项。用 10o 的观察角度和D65 光源（符合自然光） ，使用以下计算公式。 白色和黄色指数 （ASTM 计算： 313-67） 白色= 4*B-3*Y； E ： 黄色= 100* （1-B/Y） B=0.8475*Z ， Y 和 Z 分别是 CIE 颜色系列中的标准色值。表7样品 A B C白色指数 46.53 31.66 41.62黄色指数 14.13 -2.25 -11.36有各种光泽的牙齿样品在白色和黄色指数的基础上可以分别在表格中和上述光谱中显示出 来。这种方法应用于牙齿表面的分析是非常成功的。 类似的白色指数的测定的应用还包括纺织品、纸张及其他材料。- 31 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术4.4.4 应用：防晒霜的测定 UVA防护的特性 在欧洲，至今也没有公认的测定 UVA 辐射的方法。因此，许多防晒霜的制造商使用的是澳 大利亚标准 2604:98。如果防晒霜产品在 320~360nm 范围内至少减少 90%的 UVA 辐射的透 射，就可以考虑用该澳大利亚标准进行测定。若在此范围内任一点透射值超出了，这个标准 就不能使用了。然而，自 2004 年以来，DIN 标准 67502 用于 UVA 防护的特性测定都是有 效的。这里，以 UVA 平衡计算 UVA 防护和如此好的不同的 UVA 防护效果。 仪器和材料 这里试验了六种欧洲市场上可以找到的防晒霜产品，将防晒因子（SPF）和防晒霜制造商使 用 UV 过滤系统的说明列于下表 8 中。均为油乳组分。表8样品编号 1 2类型 防晒液 防晒液SPF 值 6 12UV 过滤系统 octyl methoxycinnamate phenylbenzimidazole sulphonic acid ethylhexyl methoxycinnamate octocrylene buthyl methoxydibenzoylmethane ethylhexyl methoxycinnamate octocrylene buthyl methoxydibenzoylmethane ethylhexyl methoxycinnamate octocrylene buthyl methoxydibenzoylmethane ethylhexyl methoxycinnamate octocrylene buthyl methoxydibenzoylmethane octocrylene 氧化锌 ethylhexyl methoxycinnarnate phenylbenzimidazole sulphonic acid3防晒液154防晒喷雾剂155防晒霜206防晒霜30几乎所有被测试的防晒霜产品至少都会有一个 UVB 和 UVA 过滤系统。但是样品 1 只包括 一个 UVB 过滤，且它不是欧洲市场上有代表性的产品。 使用 SPECORD?和积分球（Ulbricht 球）附件测试防晒霜产品，该直径为 75 mm 的积分球 包括两个用于光束的输入和输出的 Spectralon? 半球，光束偏转光学器件，样品支架和用于 透射和反射测量的样品池。Spectralon? 是一种特富龙塑料，它在很宽的光谱范围内有着非 常高的反射率。 积分球均匀点亮光度计的检测器表面， 独立于样品造成的光束的任一影响 （散 射、偏离） ，因此增加了测定精度。测定固体、高厚度样品的透射，积分球的使用是避免由 于光束的影响造成的系统误差的唯一的方法。 操作规程 选择石英片作为样品的载体。先称量未涂层的样品基体，然后要使产品以 0.75 mg/cm2均匀 分布于石英片上， 要用无粉乳胶手套将样品均匀覆盖在石英片上， 大约 1 分钟样品就铺满了。- 32 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术再称量一次石英片以用于计算。15 分钟的平衡周期后，先测定样品。各样品进行两次这一 步骤，且各测定在不同的位置上重复两次。用SPECORD? 在 290～400 nm范围内完成透射 测定，用未涂层石英片作参比测量，也可以将甘油铺在载片上作参比测量用。图 30：SPF 为 15 的防晒液的透射光谱结果和讨论 该测量方法用于所有样品的测定都不困难。以样品 3 的透射光谱为例，发现所有样品在 320~360nm 之间的透射光谱中减少 60%的辐射。只有 SPF 6 的样品 1 的透射要高一些。样 品 1 的包装上没有说明该产品已经按照国际认证的澳大利亚标准 2604 测试过 UVA 防护值 了。对该光谱的评价并不可以得出有了较高的防护因数就有了较高的 UVA 防护的结论。因 为在 UVA 防护值和 SPF 之间没有相关关系。对于某些样品，保留 UVA 防护值和使用得越 来越多的 SPF 一样不违反标准。它还可以用于观察具有相同的 SPF（样品 3 和 4）的防晒霜 提供的不同的 UVA 防护值。应用 DIN 67502 可以改善防晒霜产品间的区分。4.5光纤探头光纤及可选探头 用于在光度计外面的在线测定4.5.1应用：ATR 探头用于颜料测定绪言 ATR 探头可用于分析光难穿透的介质的吸收特性。ATR 探头的工作原理（衰减全反射）是 基于 ATR 晶体（高反射率）和样品（低反射率）反射率 的不同。光束在 ATR 晶体和样品间的界面上完全反射。 一部分光束穿过样品至浅的深度并被吸收。因此，反射光 的量减弱了。以此获得样品的吸收光谱或透射光谱。 操作规程 ATR 探头可以和 SPECORD?一起使用。光通过光纤适配 器进入光缆，到达探测器。光被减弱后通过另一条光缆返 回光度计并被检测。 用 SPECORD?在 370~800 nm 间测定吸收光谱，可分析各 种颜料。- 33 -紫外可见分光光度计基本原理及分析技术结果 获得以下光谱：图 31：各种印刷油墨的吸收光谱发现最大吸收值红色在 528nm 和 562nm 处，黄色在 446nm 处，蓝色在 600nm 和 638nm 处。 评价 用 Analytik Jena AG 色度软件进行评价。该软件提供了计算不同颜色数值的可能性，并考虑 了光源和入射角度的不同的影响。 使用的色系是标准色值以及CIELAB系统。这里选择 10o观察角度和D65 光源（与自然光相 符） 。 标准色坐标 x, y, z 标明了颜色在 Cartesian 三维空间中的特性；在 CIELAB 系统里，用 L 值 表明颜色的光泽，'a'值代表红-绿组分，'b'值代表黄-蓝组分。 标准色坐标 颜色 红 黄 蓝 X 81.36 83.35 63.32 Y 74.23 83.35 72.27 Z 99.95 36.36 108.81 CIELAB L 89.03 93.17 88.10 a 22.42 8.44 -11.65 b -13.98 48.80 -21.43- 34 -
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