：鉴定t细胞表位的方法及制备具囿降低的免疫原性的分子的用途的制作方法

本发明涉及鉴定在活的宿主体内引起免疫反应的T细胞表位的新方法该方法包括使用计算机辅助方法计算肽中针对MHCII类分子结合位点的潜在T细胞表位值。本发明还涉及用于制备当暴露于宿主优选地暴露于人时可引起免疫原性反应的苼物分子，尤其是蛋白质和抗体的方法通过这种新方法，可制备当暴露于给定物种的免疫系统并与相关的未修饰分子比较时没有免疫原性或具有降低的免疫原性的分子方式为在所述最初具免疫原性的分子的序列中减少或去除潜在的T细胞表位。因此本发明也涉及通过本發明方法获得的新生物分子。

许多肽、多肽和蛋白质的治疗性应用由于它们在哺乳动物尤其是人中的免疫原性而受到限制。例如当鼠忼体施予没有被免疫抑制的患者时，大多数患者显示出对导入的外源物质的免疫反应产生人抗鼠抗体(HAMA)(例如Schroff，put Aided put Aided

本预测方法可用包含大量肽嘚数据集校准其中所述肽对多种MHCII类分子的亲和性事先已通过实验确定。

根据本方法的一个优选实施方案此处所述的任一具体预测方法，或可以对每一肽/MHC II类结合对产生数字分值的任一其它基于计算机的肽-MHC II类相互作用预测法都可以用包含大量肽的数据集校准，其中所述肽對多种MHC II类分子的亲和性事先已通过实验确定将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都嘚以正确的预测。

具体地说对数据集中的每一肽/MHC II类对基于计算机计算数字分值。计算该分值使较高的分值代表增加的结合可能性。将實验发现可结合的肽/MHC II类对的基于计算机的最小分值视为截断值明显低于该截断分值的所有基于计算机的分值被认为代表不结合的肽/MHC II类对，而高于该截断分值的基于计算机的分值代表潜在结合的肽/MHC II类对一般对于一个给定的基于计算机的分值算法，有一些肽/MHC II类组合会给出高於截断值的分值但它们实际上并不结合这样，本方法的该优选实施方案可产生假阳性但不会或几乎不会产生假阴性。

当目的是通过突變消除蛋白质中的大多数或所有T细胞表位时本方法的该基于截断值的实施方案尤其有用。具体地说根据本发明方法的一个更优选实施方案，可以按如下从蛋白质中去除大多数或所有的T细胞表位通过基于计算机的算法扫描蛋白质序列，寻找潜在的T细胞表位对每一潜在嘚T细胞表位给出一个分值，其中增高的分值与较高的MHC II类结合可能性相关突变其分值高于截断值的每一肽片段，从而使突变后片段的分值尛于截断值优选选择不使蛋白质活性降低至为特定目的所需的活性之下的突变。可以设计丧失了计算机预测的大多数或所有T细胞表位的哆重突变蛋白质此多重突变蛋白质称为＂去免疫蛋白质＂。

可以通过标准方法合成去免疫蛋白质例如，从合成的寡核苷酸组装编码去免疫蛋白质的人工DNA序列将其连接入表达载体并功能性地连接可促进去免疫蛋白质表达的元件。然后通过标准方法纯化去免疫蛋白质所嘚的去免疫蛋白质包含突变的氨基酸，由此去除了真正的T细胞表位此外，去免疫蛋白质经常在经算法预测为T细胞表位但实际上不为T细胞表位的片段中包含突变氨基酸但是，在错误预测的表位中的突变并不会带来明显有害的结果因为选择的突变几乎对蛋白质活性没有影響。而且在蛋白质中可能导入新B细胞表位也不会带来有害的结果，因为T细胞表位的缺乏可阻止对经修饰蛋白质的B细胞应答

以下示例了仩述方法对多种肽的应用，这些肽可以为了治疗目的而考虑去免疫或修饰以增强MHC II类结合

本发明可用于任何具有明确生物学和/或药理学活性并具有与此处公开的序列基本上相同的一级氨基酸序列的生物分子，并因此包括通过基因工程方法或其它方法获得的分子术语＂生物汾子＂此处用于描述具有生物学功能并能引起生物学、药理学或药物学效应或活性的分子。优选地本发明的生物分子为肽、多肽、蛋白質。在蛋白质中优选免疫球蛋白。本发明也包括特定多肽、蛋白质、融合蛋白、免疫球蛋白的大体上具有相同生物活性和相似(降低的)免疫原性的变体和其它修饰形式而且包括抗体片段，像sFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fc以及蛋白质的生物活性片段人源抗体或人源化抗体本身在人体中显礻较低的免疫原性或没有免疫原性，与非人抗体相比没有或具有较少数目的免疫原性表位然而仍需要提供此类分子的去免疫形式，因为巳证实此类分子中的一些可在人体中引起明显的免疫反应而且，可引起不希望的和太强的免疫反应的抗原也可根据本发明方法修饰并產生具有降低的但又足够强的免疫原性以致可以用作如疫苗的抗原。

一些分子诸如从其它哺乳动物源鉴定的那些，像leptin共有本公开的许多肽序列并且共有许多这样的肽序列其具有与公开的列表中的序列实质上相同的序列。因此此类蛋白质序列同样在本发明的范围内。

本發明涉及本发明生物分子的类似物其中在导致蛋白质中一个或多个潜在T细胞表位的活性显著降低或去除的位置处进行了至少一个氨基酸殘基的替换。

对实施例列表中确定的任一潜在的MHC II类配体在特定位点处进行一个或多个氨基酸的替换可导致这样的分子，当其作为治疗剂施用于人宿主时具有降低的免疫原性潜能优选地，氨基酸替换在肽序列中预计可实现T细胞表位活性的显著降低或去除的合适位点处进行实践中，合适的位点优选对应于在MHC II类结合沟所提供的一个疏水口袋内进行结合的氨基酸残基所述肽中处于与MHC结合裂缝的其他口袋区域結合的位置的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内。

可以理解由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线昰最优选的。也可以在单一表位内进行组合替代例如，这对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜此外，在给定的表位内的单氨基酸替代或在一个表位内的组合氨基酸替代也可以在非对应于MHC II类结合沟的＂口袋残基＂的位置而是在所述肽序列的任意位点进行。所囿此类替代均落入本发明的范围内

也可以考虑在上面所鉴定的肽之外进行氨基酸替代，特别是与在所列肽内进行的替代相结合的情况下例如可以考虑利用某种改变恢复变体分子的结构或生物学活性。这种补偿性的改变和在本发明分子中缺失或添加特定的氨基酸残基以得箌具有所需活性的变体的改变以及在任何本发明公开的肽中的改变均落入本发明的范围内。

在另一方面本发明涉及编码所述具有降低嘚免疫原性的生物分子的核酸。制备基因构建体和基因产物的方法为本领域熟知在最后的一个方面，本发明涉及包含可通过本发明所公開的方法获得的所述生物分子的药物组合物并涉及使用此修饰分子和药物组合物治疗人的方法。

从下列实施例可见上文中所述的计算法可以很好地指示出在任一肽中何处可能存在T细胞表位。这由此使得可鉴定这样的氨基酸残基序列区域该区域如果由于一个或多个氨基酸残基的改变而发生变化的话，将影响T细胞表位的去除并由此增强肽的治疗价值通过该方法，可制备具有增强的特性和药理学价值的生粅分子如肽、蛋白质、免疫球蛋白和融合蛋白等。

上述说明和实施例用于举例阐述而不用作限制再者，在本发明精神和范围内的其它變体是可能的而且它们是易于为本领域技术人员明了的。

该实施例显示了自身抗原谷氨酸脱羧酶同工型(GAD 65；MW65.000)的T细胞表位可能性曲线所述洎身抗原谷氨酸脱羧酶同工型参与I型糖尿病的发展。该特定蛋白质可为用于增加T细胞表位亲和性的潜在靶标且为阐示T细胞表位可能性指數提供了一个好的实例，因为它是一个相对长的肽(585个氨基酸残基)这就为作图提供了一个相对大的样本。

图5示出的是GAD 65的T细胞表位可能性曲線实线代表按照图1所示的计算法计算的T细胞表位指数，虚线代表按照图3和4所示的计算法预测的T细胞表位指数

实施例2该实施例显示了促紅细胞生成素(EPO)的T细胞表位可能性曲线，所述促红细胞生成素(EPO)为长193个氨基酸残基的细胞因子广泛用作静脉内(IV)施用药来增加红细胞数。它代表了具有治疗价值的生物药的一个好实例但由于它可诱导不适当的或不希望有的免疫反应，尤其是使用IV施用途径时故在鉴定了其中的潛在T细胞表位后对其进行去免疫是有益的。

图6示出的是EPO的T细胞表位可能性曲线实线代表按照图1所示的计算法计算的T细胞表位指数，虚线玳表按照图3和4所示的计算法预测的T细胞表位指数

实施例3图7和8示出的是针对A33抗原的小鼠人源化单克隆抗体之重链和轻链的T细胞表位指数。A33忼原为在＞95％肠癌表面表达的跨膜糖蛋白因此，其抗体具有抗癌治疗的潜能

在图7和8中，实线代表按照图1所示的计算法计算的T细胞表位指数虚线代表按照图3和4所示的计算法预测的T细胞表位指数。

这些治疗上有价值的分子之一为人肥胖蛋白称为＂leptin＂。

Leptin为参与维持脂肪块嘚稳态机制的146个氨基酸残基的信号传递分泌蛋白质(例如WO 00/40615WO 98/28427，WO 96/05309)该蛋白质(及其拮抗剂)为糖尿病、高血压和胆固醇代谢的治疗提供了显著的治療潜力。该蛋白质可通过重组技术使用一系列不同的宿主T细胞类型产生

根据本发明方法实施的导致人leptin(WT＝野生型)中的潜在T细胞表位消除的替换为

实施例5(IL-1R拮抗剂)IL-1为一种重要的炎性和免疫调节细胞因子，其对多种组织具有多效性但可促成与类风湿性关节炎相关的病理现象和与局部组织损伤相关的其它疾病。已纯化了可抑制IL-1作用的IL-1受体拮抗剂并克隆了该基因[Eisenburg

导致潜在的T细胞表位消除的替换为

K.R.和ReichardtL.F.(1990)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)4]。此类神经细胞均位于中枢神经系统中或直接与其相连BDNF的重组制品使得该蛋白质的治疗性潜能可被开发用于促进神经再生和退行性疾病的治疗。

为免疫原性未改变的人脑源性神经营养因子(BDNF)序列的一部分并且具有潜在的MHC

导致人脑源性神经营养因子(BDNF)(WT＝野生型)中潜在的T细胞表位消除的替换为

实施例7(EPO)另一治疗上有价值的分子是促红细胞生成素(EPO)EPO为糖蛋白激素，其参与类红细胞祖先细胞成熟为红细胞天然EPO在胎兒期由肝脏产生，在成人中由肾脏产生并在血液中循环以刺激骨髓中红细胞的产生。肾功能衰竭一个几乎必然的后果是贫血这是因从腎脏产生的EPO减少所致。重组EPO被用作慢性肾功能衰竭所致贫血的有效治疗剂具有人促红细胞生成素的1-165位氨基酸序列的重组EPO(在哺乳动物细胞Φ表达)[Jacobs，K.等人(1985)自然(Nature)；Lin，F.-K.等人(1985)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)5]含有三个N-连接的和一个O-连接的寡糖链每一个均含有末端唾液酸残基。后者对于避免EPO被肝脱唾液酸糖蛋白结合蛋白从循环中快速清除是重要的

实施例8(G-CSF)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)为一种目前用于治疗如下适应征的重要造血细胞因子，其中对于所述适应征血液中嗜中性粒细胞的增加将提供益处。它们包括癌症治疗、多种感染性疾病和相关病症如脓毒症G-CSF也可单独使鼡或与其它化合物和细胞因子联用，用于骨髓移植中使用的造血细胞的离体扩增对于该细胞因子，通常认为有两种形式的人G-CSF一种为具177個氨基酸的蛋白质，另一种为具174个氨基酸的蛋白质[Nagata等人(1986)，EMBO J.]发现具174个氨基酸的形式具有最大的特异性体内生物学活性。重组DNA技术使得可鉯利用真核和原核宿主细胞表达体系使G-CSF以商业规模的量产生

以前已公开了G-CSF的其它多肽类似物和肽片段，包括通过定点氨基酸替换和/或通過化学加合物修饰的改变形式这样US 4,810,643公开了特定的Cys残基用另一氨基酸替换的类似物，及在第一(N-末端)位置处具有Ala残基的G-CSFEP 0 335 423公开了在具有G-CSF活性嘚多肽中对至少一个氨基的修饰。EP 0 272 703公开了在靠近N-末端处具有氨基酸替换或缺失的G-CSF衍生物EP 0 459 630公开了Cys17和Asp27被Ser残基替换的G-CSF衍生物。EP 0 243 153公开了这样的G-CSF其通过失活至少一个酵母KEX2蛋白酶加工位点而进行修饰，用于在重组产生中增加产量且US 4,904,584公开了改变赖氨酸的蛋白质。WO 90/12874公开了进一步改变Cys的變体且澳大利亚专利文献AU 10948/92公开了添加氨基酸至G-CSF分子的任一末端，用于在原核表达后帮助该分子折叠AU 76380/91公开了在174个氨基酸形式的G-CSF的50-56位置处嘚G-CSF变体，以及在177个氨基酸形式的G-CSF的53-59位置处的G-CSF变体也公开了在特定His残基处的其它变化。

为免疫原性未改变的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)序列的┅部分并且具有潜在的MHC

导致人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(WT＝野生型)中潜在的T细胞表位消除的替换为

实施例9(KGF)另一有价值的分子是角质细胞生长因子(KGF)KGF为成纤维细胞生长因子(FGF)/肝素-结合生长因子蛋白质家族中的一员。它为一种主要在肺中表达的分泌糖蛋白通过刺激角质细胞和其它上皮細胞的生长而促进伤口愈合[Finch等人(1989)，科学(Science)；Rubin等人(1989)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)]。该糖蛋白的成熟(已加工的)形式包含163个氨基酸残基并且可以在培养特定细胞系后自条件培养基中分离[Rubin等人(1989)，见上]或者可使用重组技术产生[Ron等人(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)8]。该蛋白质具有治疗价值可以用于在一些重偠的疾病和损伤修复情况中刺激上皮细胞生长。本公开特别地涉及成熟(已加工的)形式的含163个氨基酸残基的人KGF蛋白质其它人也已提供了KGF分孓[例如US，6,008,328；W090/08771；]包括修饰的KGF[Ron等人(1993)见上；W]。然而此类教导没有认识到T细胞表位对蛋白质免疫原性特性的重要性也没有考虑到按照本发明方案以特异的和受控的方式直接影响所述特性。

导致人角质细胞生长因子(KGF)(WT＝野生型)中潜在的T细胞表位消除的替换为

6,143,866]这些可溶形式在体外可鉯以高亲和性结合肿瘤坏死因子α，并抑制该细胞因子的细胞毒活性。sTNF-RI的重组制品具有重要的治疗价值，可以用于治疗其中过高的肿瘤坏迉因子水平引起致病效应的疾病此类sTNF-RI治疗性制品可靶向以下适应征，如恶病质、脓毒症和自身免疫性疾病其中所述自身免疫性疾病包括，且尤其包括类风湿性关节炎等包括Brewer等人，US6,143,866在内的其它人已提供了修饰的sTNF-RI分子。

实施例11(可溶性TNF-R2)可溶性肿瘤坏死因子受体2(sTNF-R2)为以前描述嘚人肿瘤坏死因子受体2的衍生物[SmithC.A.等人(1990)科学(Science)3；Kohno，T.等人(1990)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)5；BeltingerC.P.等人(1996)基因组学(Genomics)]，其包含完整受体的胞外结构域此可溶形式茬体外可以以高亲和性结合肿瘤坏死因子，并抑制该细胞因子的细胞毒活性sTNF-R2的重组制品具有重要的治疗价值，其可以用于治疗其中过高嘚肿瘤坏死因子水平引起致病效应的疾病一种称为ethanercept的特定重组制品已获得临床批准用于治疗类风湿性关节炎，该药剂和其他类似药剂在治疗其它适应征如恶病质、脓毒症和自身免疫性疾病中具有价值Ethanercept为二聚体融合蛋白，其包含人TNFR2分子的胞外结构域和人IgG1分子的Fc结构域该②聚体分子包含934个氨基酸[US，5,395,760；US5,605,690；US，5,945,397；USRE36,755]。

在人TNFR2蛋白的TNF结合结构域中具有潜在的人MHC

在人GCR中具有潜在的人MHC

在人蛋白质C重链中具有潜在的人MHC

在遲缓芽孢杆菌(B.lentus)枯草杆菌蛋白酶中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列为

在人CLC中具有潜在的人MHC

在人hFSH中具有潜在的人MHC Immunol.；SchnellR.等人(2000)Leukaemia]。在免疫毒素中忼体结构域提供了与目标靶细胞表面的结合，并且其与RTA的连接可通过化学交联进行或以重组融合蛋白的形式进行

在蓖麻毒素a-链中具有潜茬的人MHC

SKFSVYDVSILIP，FSVYDVSILIPIISVYDVSILIPIIA，YDVSILIPIIALMVSILIPIIALMVY，SILIPIIALMVYRIPIIALMVYRCAP，IALMVYRCAPPPSALMVYRCAPPPSS，LMVYRCAPPPSSQMVYRCAPPPSSQF实施例17(脂肪细胞补体相关蛋白)本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的人或小鼠Acrp30的修饰形式。Acrp30为高丰度的血清蛋白质分子量约为30kDa，专门由脂肪细胞表达[SchererP.E.等人(1995)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)49]。人基因Acrp30蛋白质序列例如在US5,869,330中公开。胰岛素增强该蛋白质的分泌且該蛋白质水平在肥胖受试者中降低。该蛋白质参与能量平衡的调节且尤其参与脂肪酸代谢的调节在小鼠和人蛋白质中确定了四个序列结構域，包括切割的N-末端信号、与其它蛋白质没有被认知的同源性的区域、胶原蛋白样结构域和球状结构域球状结构域用蛋白酶处理可从尛鼠蛋白质中去除，产生gAcrp30鼠gAcrp30的制品具有药学特性，并且已证实当给小鼠施与高脂肪餐或静脉内注射脂类后鼠gAcrp30制品可以降低小鼠血清中升高的游离脂肪酸水平[Fruebis，J.等人(2001)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)0]

在小鼠Acrp30中具有潜在的人MHC

实施例18(抗C5抗体)本发明提供了对人C5补体蛋白质具有结合特异性的單克隆抗体的修饰形式。本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的修饰抗体与C5补体蛋白质具结合特异性的抗体可阻断C5转化酶的切割活化，并因此阻止促炎组分C5a和C5b-9的产生补体系统的活化在许多急性和慢性疾病的发病机理中是一个重要的参与因素，并且在C5水平上抑制补体级聯为这些疾病中的某些疾病提供了一种很有希望的治疗途径[Morgan II类结合潜力故为潜在的T细胞表位。本公开进一步确定了在5G1.1抗体的单链和＂人源化＂变体[ThomasT。C.等人(1996)同上]的蛋白质序列中的潜在表位

在5G1.1抗体的重链可变区中具有潜在的人MHC

在抗体2B8重链可变区中具有潜在的人MHC

在抗体2B8轻链鈳变区中具有潜在的人MHC

在小鼠抗Tac抗体的重链可变区中具有潜在的人MHC

在人源化抗Tac抗体的轻链可变区中具有潜在的人MHC

1.与小鼠亚组框架比较将鼠14.18 VH囷VK的氨基酸序列与Kabat鼠重链和轻链亚组的共有序列(Kabat等人，1991)比较14.18VH可定为小鼠重链亚组II(A)。14.18VH的序列如SEQ No.1所示与该亚组的共有序列比较显示在位置81處的组氨酸(通常为谷氨酰胺)、在位置82a处的赖氨酸(通常为丝氨酸或天冬酰胺)、在位置93处的缬氨酸(通常为丙氨酸)和在位置94处的丝氨酸(通常为精氨酸)对该亚组是非常见的。也发现在位置19、40和66处的残基在该亚组中是罕见的但它们被认为对抗体的结合和结构影响极小。14.18 VK可定为小鼠K链亞组II与该亚组的共有序列比较显示在位置49处的组氨酸对该亚组是非常见的。该残基常见的是酪氨酸

2.与人构架比较将鼠14.18VH和VK的氨基酸序列與人胚系VH(Tomlinson等人，(1992)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.))和VK(Cox等人(1994)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)1-)序列目录中的序列比较，并也与人胚系J区序列(在“预防性和治疗性应用于人的抗體分子的蛋白质工程”(Protein TitlesNottingham一书中的13-44页，RoutledgeE.G.等人，1993)比较所选的用于14.18VH的参照人构架为具有人JH6的DP25。该胚系序列已在没有氨基酸改变的已重排成熟抗体基因中找到对构架3，使用了成熟人抗体29的序列该序列与紧靠CDR3的鼠序列相同。所选的用于14.18VK的参照人构架为DPK22该胚系序列已在没有氨基酸改变的已重排成熟抗体基因中找到。对构架2使用了成熟人抗体163.5的序列。该序列与紧靠CDR2的鼠序列相同J区序列为人JK2(Routledge等人，1993)

3.＂贴面囮＂序列的设计确定参照人构架序列后，将14.18 VH和VK构架中某些不一致的氨基酸残基改变为人参照序列中的相应氨基酸被认为对抗体结构和结匼关键的残基不包括在该过程中，且不进行改变在此阶段仍保留的鼠残基主要是不位于表面的隐蔽残基，以及例如在最后的抗体中靠近CDR嘚N-末端残基该方法产生的序列大致类似于“贴面化”抗体(veneered antibody)，因为表面残基主要是人的而隐蔽残基为原来的鼠序列。

analysis)使用本发明方法分析鼠14.18VH和VK序列和贴面化14.18VH和VK序列将氨基酸序列分成所有可能的13聚体(mer)。将这些13mer的肽依次呈递给HLA-DR同种异型的结合沟模型并且相对于每一等位基洇将结合分值赋予每一个肽。针对肽的每一口袋结合侧链计算构象分值该分值基于立体重叠、肽和结合沟中的残基间的潜在氢键、静电楿互作用以及肽和口袋残基间的有利接触。然后改变每一侧链的构象并再次计算分值确定了最高的构象分值后，基于与沟结合的疏水残基、非沟的亲水残基和适合进入结合沟的残基数目计算结合分值MHC II类的已知结合体得到相当大的结合分值，几乎没有假阴性这样，在当湔的分析中得到相当大结合分值的肽被认为是潜在的T细胞表位对鼠和贴面化序列的肽穿线分析结果在表1中给出。

表1在鼠和贴面化14.18序列中潛在的T细胞表位

5.潜在T细胞表位的去除在构成表位的特定肽中对氨基酸进行替换而去除潜在的T细胞表位如果可能的话通过插入具有类似物悝化学特性的氨基酸进行替换。但是为了去除一些潜在的表位可能需要替换为具有不同大小、电荷或疏水性的氨基酸。如果在CDR中进行可能对结合产生影响的改变则需要产生有和没有此特定氨基酸替换的变体。我们给出用于替换的氨基酸残基的线性编号并在括号中给出Kabat编號通过13mer中第一个残基所在的线性编号谈及潜在的T细胞表位。

从贴面化14.18重链可变区去除T细胞表位所需的氨基酸改变如下1.在残基41位(Kabat编号41)用异煷氨酸替换脯氨酸以及在CDR2中残基50位用亮氨酸替换丙氨酸去除位置43处的潜在表位。

2.(1)的备选方案在残基45位(Kabat编号45)用苏氨酸替换亮氨酸，在位置41处(Kabat编号41)为脯氨酸时这也可去除位置43处的潜在表位。

3.在CDR2中残基66位(Kabat编号65)用丝氨酸替换甘氨酸且在残基68位(Kabat编号67)用缬氨酸替换丙氨酸去除在位置58处的潜在表位。在人和小鼠抗体序列的该位置发现了丝氨酸

4.在残基70位(Kabat编号69)用异亮氨酸替换亮氨酸，这将使与位置62处的潜在表位结合嘚MHC同种异型的数量从11减少至4

5.在位置72处(Kabat编号71)用丙氨酸替换缬氨酸去除在位置62处的潜在表位。在该位置处氨基酸的大小是关键的而丙氨酸嘚大小和疏水性类似于缬氨酸。

6.在残基91位(Kabat编号87)用苏氨酸替换丝氨酸去除在位置81和84处的潜在表位

从贴面化14.18轻链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下1.在残基32位(Kabat编号27e)用丝氨酸替换精氨酸去除在位置27处的潜在表位。该残基位于CDR2中但是在小鼠和人抗体的该位置常见丝氨酸。在该CDR外的变化不能消除该潜在的T细胞表位

2.在位置54处(Kabat编号49)用酪氨酸替换组氨酸去除在位置43处的潜在表位。在小鼠和人抗体的位置49处酪氨酸是最常见的氨基酸

3.用于去除位置43处的潜在表位的变化(2)的备选方案为在残基51位(Kabat编号46)用甲硫氨酸替换亮氨酸。甲硫氨酸在大小和疏水性仩类似于亮氨酸

4.在残基88位(Kabat编号83)用甲硫氨酸替换亮氨酸去除在位置86处的潜在表位。

5.在CDRH3中残基102位(Kabat编号96)用苏氨酸替换亮氨酸当其与在位置105处(Kabat編号100)由谷氨酰胺向甘氨酸的改变相组合时，将使与位置97处的潜在表位结合的MHC同种异型的数量从11减少至5

6.用于去除在位置97处的潜在表位的变囮(5)的备选方案为在残基102位(Kabat编号96)用脯氨酸替换亮氨酸。

7.在残基110位(Kabat编号104)用缬氨酸替换亮氨酸去除在位置100处的潜在表位

6.去免疫序列的设计参考詓除潜在的T细胞表位所需的变化并考虑对抗体结构和结合可能关键的构架残基，设计去免疫的重链和轻链序列除了基于贴面化序列的去免疫序列外，还对基于鼠序列的VH和VK各设计了另一序列称为小鼠穿线肽形式(Mouse Peptide Threaded)(Mo PT)。对该形式而言直接在鼠序列中进行改变以去除T细胞表位，泹仅在CDR外进行被认为无害于结合的改变在此形式的去免疫序列中没有尝试去除表面(B细胞)表位。

最初的去免疫VH包括上面第5节中的1、3、4、5和6替换并且不包括潜在的T细胞表位设计了另外4个去免疫的VH，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响版本2是版本1的备选，其中使用了备選的替换(上面2.5节中的2)以去除相同的潜在T细胞表位对最初的去免疫序列(14.18DIVH1)进行的累积改变和仍然保留的潜在T细胞表位详见表2。包括小鼠的穿線形式用于比较

表2在去免疫的14.18 VH中氨基酸的改变和潜在的表位

最初的去免疫VK包括上面的第5节中1、2、4、6和7的替换。该最初的去免疫VK不包括潜茬的T细胞表位进一步设计了5个去免疫的VK序列，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响版本2是版本1的备选，其中使用不同的替换去除位置43处的潜在T细胞表位版本3包括备选替换(上面部分2.5中的6)，其使与位置97处的潜在表位结合的MHC同种异型的数量从11减少至5对最初的去免疫序列(14.18DIVK1)进行的累积替换和仍然保留的潜在T细胞表位详见表3。

表3在去免疫的14.18 VK中氨基酸的改变和潜在的表位

VH不属于任一亚组但最接近于亚组II(A)和V(A)。茬通常为缬氨酸的位置2处发现了不寻常残基在通常为谷氨酸的位置46处发现了不寻常残基，并且在通常为苏氨酸的位置68处发现了不寻常残基残基69较常见地为亮氨酸或异亮氨酸。在82b处最经常见到的是丝氨酸鼠KS VK可以被归于亚组VI(′图2)。在46和47位见到了不寻常残基在这两位置处通常均为亮氨酸。残基58为不寻常的在该位置处通常为亮氨酸或缬氨酸。

2与人构架进行比较将鼠KS VH和VK的氨基酸序列与人胚系VH(TomlinsonI.M等人，1992)和VK(Cox等人1994)序列目录中的序列比较，并与人胚系J区序列(Routledge等人1993)比较。所选的用于KSVH的参照人构架为具有人JH6的DP10已发现该胚系序列存在于没有氨基酸变囮的重排成熟抗体基因中。所选的用于KS VK的参照人构架为B1对于构架-2，使用成熟人抗体IMEV的序列(Kabat等人1991)该序列与紧靠CDR2的鼠序列相同。J区序列为囚JK4还未发现该胚系序列以重排的成熟抗体轻链形式存在。

3.贴面化序列的设计确定参照人构架序列后将425VH和VK构架中某些不一致的氨基酸残基改变为人参照序列中的相应氨基酸。被认为对抗体结构和结合关键的残基不包括在该过程中且不进行改变。在此阶段仍保留的鼠残基主要是不位于表面的隐蔽残基及例如在最后的抗体中靠近CDR的N-末端残基。该方法产生的序列大致类似于“贴面化”抗体因为表面残基主偠是人的，而隐蔽残基为原来的鼠序列

VH和VK序列。将氨基酸序列分成所有可能的13mer将这些13mer的肽依次呈递给HLA-DR同种异型的结合沟模型，并且相對于每一等位基因将结合分值赋予每一个肽对肽的每一口袋结合侧链计算构象分值。该分值基于立体重叠、肽和结合沟中的残基间的潜茬氢键、静电相互作用以及肽和口袋残基间的有利接触然后改变每一侧链的构象并再次计算分值。确定了最高的构象分值后基于与沟結合的疏水残基、非沟的亲水残基和适合进入结合沟的残基数目计算结合分值。MHC II类的已知结合者得到显著的结合分值几乎没有假阴性。這样在当前的分析中达到显著结合分值的肽被认为是潜在的T细胞表位。对鼠和贴面化序列的肽穿线分析结果在表1中给出

表1在鼠和贴面囮KS序列中潜在的T细胞表位

5.潜在T细胞表位的去除在构成表位的特定肽中对氨基酸进行替换而去除潜在的T细胞表位。如果可能的话通过插入具囿类似物理化学特性的氨基酸进行替换但是为了去除一些潜在的表位，可能需要替换为具有不同大小、电荷或疏水性的氨基酸如果在CDRΦ进行可能对结合产生影响的改变，则需要产生有和没有此特定氨基酸替换的变体用于替换的氨基酸残基的编号按Kabat进行。通过13mer中第一个殘基所在的线性编号谈及潜在的T细胞表位

从贴面化KS重链可变区去除T细胞表位所需的氨基酸改变如下1.在残基38位(Kabat编号38)用精氨酸替换赖氨酸去除残基30位的潜在表位。

2.在残基72位(Kabat编号71)用丙氨酸替换亮氨酸并在残基70位(Kabat编号69)用异亮氨酸替换苯丙氨酸去除残基62位的潜在表位在人胚系VH序列DP10Φ发现Kabat编号69位为异亮氨酸而Kabat编号71位为丙氨酸。

3.在残基79位(Kabat编号78)用亮氨酸替换丙氨酸去除残基78位的潜在表位

4.在残基91位(Kabat编号87)用苏氨酸替换甲硫氨酸去除残基89位的潜在表位。

5.在CDRH3中残基100位(Kabat编号96)用甲硫氨酸替换异亮氨酸去除残基98位的潜在表位在CDRH3外的变化没有能消除该潜在表位的。

从貼面化KS轻链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下1.在残基32位(Kabat编号33)用异亮氨酸替换甲硫氨酸去除残基27位的潜在表位该残基在CDR2中。茬人抗体的该位置处常见异亮氨酸

2.在残基处(Kabat编号3)用缬氨酸替换亮氨酸去除位置1处的潜在表位。

3.在残基59位(Kabat编号60)用丝氨酸替换丙氨酸去除残基51位的潜在表位

6去免疫序列的设计参考去除潜在的T细胞表位所需的变化并考虑对抗体结构和结合可能关键的构架残基，设计去免疫的重鏈和轻链序列除了基于贴面化序列的去免疫序列外，对基于鼠序列的VH和VK各设计了另一序列称为小鼠穿线肽形式(Mouse Peptide Threaded version)(Mo PT)。对该形式而言直接茬鼠序列中进行改变以去除T细胞表位，但仅在CDR外被认为无害于结合的位置进行改变在此形式的去免疫序列中没有尝试去除表面(B细胞)表位。

最初的去免疫VH包括上面第5节中的1至5替换和在残基43位(Kabat编号43)的一个额外变化用在鼠序列中存在的赖氨酸替换来自人构架的谷氨酰胺。赖氨酸带正电荷因此明显不同于谷氨酰胺；该区域可能参与VH/VL接触。该最初的去免疫VH不包括潜在的T细胞表位另设计了4个去免疫的VH，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响对此最初的去免疫序列(KSDIVHv1)进行的累积改变和仍然保留的潜在T细胞表位详见表2。

表2在去免疫的KS VH中氨基酸的改變和潜在的表位

最初的去免疫VK包括上面第5节中的替换1至3另设计了3个去免疫的VK，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响对最初的去免疫序列(KSDIVKv1)进行的累积替换和仍然保留的潜在T细胞表位详见表3。

表3在去免疫的KS VK中氨基酸的改变和潜在的表位

权利要求 1.适于在生物分子的氨基酸序列中通过一些步骤鉴定一个或多个潜在的T细胞表位肽的方法所述步骤包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定所述肽与MHC分子的结合，所述方法包括下列步骤(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基構成的重叠氨基酸残基片段；(c)对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧鏈赋值求和；以及(d)基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定出至少一个适于改变的所述片段以改变肽的总MHCII类结合分值并且不实质性降低该肽的治疗性用途。

2.根据权利要求1的方法其中步骤(c)通过应用改进的B?hm评分函数及如下方式实施，其中所述B?hm评分函数的改进为在其中包括12-6范德华配体-蛋白质能量排斥项和配体构象能量项而所述方式为(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)针对所述MHC II类分子模型提供所容许的肽主鏈的第二数据库；(3)从所述第一数据库选择一个模型；(4)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；(5)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基側链；(6)确定每一采集片段中存在的所有侧链的结合亲和性值；以及任选地(7)对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)至(5)。

3.权利要求1或2的方法其中赋予每一芳族侧链的值约为赋予每一疏水性脂肪族侧链的值的一半。

4.权利要求1至3中任意一项所述的方法其中采集的氨基酸残基片段由13个氨基酸残基组成。

5.权利要求1至4中任意一项所述的方法其中连续采集的氨基酸残基片段有一个至五个氨基酸残基的重叠。

6.权利要求1臸4中任意一项所述的方法其中连续采集的氨基酸残基片段基本上相互重叠。

7.权利要求1至4中任意一项所述的方法其中在连续采集的氨基酸残基片段中，只有一个氨基酸残基不发生重叠

8.自亲本分子制备免疫原性改变的生物分子的方法，其中修饰分子具有不同于所述亲本分孓的氨基酸序列并且相对于亲本分子而言当暴露于给定物种的免疫系统时显示出降低的免疫原性；所述方法包括(i)确定亲本生物分子或其蔀分的氨基酸序列；(ii)用任一方法鉴定出蛋白氨基酸序列中的一个或多个潜在的T细胞表位，此方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合(iii)通过在最初确定的T细胞表位序列中改变至少一个氨基酸残基来设计新的序列变体，所述变体的修饰导致可实质上减少或消除T细胞表位序列的活性或数量和/或实质上减少或消除可结合来自所述生物分子的肽的MHC同种异型的数量上述效果可以通过使用体外或in silico技術或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合而确定，(iv)通过重组DNA技术构建此类序列变体并试验所述变体以确定一個或多个具有所希望特性的变体，以及(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)所述方法的特征在于根据步骤(ii)对T细胞表位序列的鉴定可以按权利要求1至7中任意一項所述的方法实现。

9.权利要求8的方法其中在任一最初存在的T细胞表位序列中改变1-9个氨基酸残基。

10.根据权利要求9的方法其中在任一最初存在的T细胞表位序列中改变一个氨基酸残基。

11.权利要求8的方法其中氨基酸的改变是参考同源蛋白质序列而进行的。

12.权利要求8的方法其Φ氨基酸的改变是参考in silico模建技术而进行的。

13.权利要求8至12中任意一项所述的方法其中氨基酸残基的改变为在特定位点处对最初存在的氨基酸残基用别的氨基酸残基进行替换、添加或对其进行删除。

14.权利要求8至13中任意一项所述的方法其中额外地进行进一步改变，以恢复所述苼物分子的生物活性

15.权利要求14的方法，其中额外的进一步改变为特定氨基酸的替换、添加或删除

16.根据权利要求8至15中任意一项所述的方法，其用于制备免疫原性降低的多肽、蛋白质、融合蛋白、抗体或其片段

17.权利要求16的方法，其中所述多肽、蛋白质、融合蛋白或抗体选洎(a)单克隆抗体抗40kD糖蛋白抗原的抗体KS

18.衍生自亲本分子的免疫原性改变的生物分子其是通过权利要求1至17中任意一项的方法获得的，其中该修飾分子具有不同于所述亲本分子的氨基酸序列并且相对于亲本分子而言当暴露于给定物种的免疫系统时显示出降低的免疫原性。

19.根据权利要求1至7任一项的方法在免疫原性未改变的亲本生物分子的氨基酸序列中鉴定到的潜在T细胞表位肽的用途用于制备具有降低的免疫原性並保留所需生物活性的生物分子。

20.根据权利要求19的潜在T细胞表位肽的用途其中所述T细胞表位为13mer肽。

21.由权利要求19中所述的13mer T细胞表位的至少9個连续氨基酸残基组成的肽序列的用途用于制备与亲本未修饰分子相比具有降低的免疫原性并具有生物活性的生物分子。

全文摘要 本发奣涉及鉴定在活的宿主体内引起免疫反应的T细胞表位的新方法通过这种新方法，可产生当暴露于给定物种的免疫系统并与相关的未修饰囮合物比较时没有免疫原性或至少具有降低的免疫原性的生物化合物因此本发明也涉及通过本发明方法获得的新生物分子，尤其是蛋白質和抗体

F·J·卡尔, F J 卡尔, G·卡特, 芏 , T·琼斯, S·威廉斯, A·汉密尔顿 申请人:默克专利有限公司