请问DCFH-DA(芘荧光探针针用于ROS染色) 和PI能否双染

DCF法测定ROS
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|个人分类:|系统分类:|关键词:ROS,DCFH-DA|
(1)原理:DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测 DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
(2)材料与仪器
DCFH-DA购自Sigma公司,分子量487,用DMSO溶解,4.87 mg/ml 配成10 Mm,终浓度稀释成25&M; FLUOstarOPTIMA酶标仪。
① 接种细胞:96孔板,接种细胞数为每孔1.5万个细胞。
② DCFH-DA孵育:接种24小时后用有糖earle&s 液洗两遍,并换上终浓度为25&M DCFH-DA培养箱孵育30 min.
③ 处理:DCFH-DA孵育结束后,用有糖earle&s 液洗两遍给予处理(氧化应激或药物)。
④ 检测:FLUOstarOPTIMA酶标仪检测荧光,488nm激发波长,525nm发射波长。
(4)注意点
① 要有无DCFH-DA孵育的对照;
② 多次清洗,注意操作规范,不要将细胞洗掉。
③ 如果处理4小时以内,可以先孵育荧光染料,再处理后检测;如果处理超过4小时,建议先处理,再孵育染料检测。
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罗 莉,侯凤艳,严 军,梁华平. 活性氧与细胞核共染影响因素的实验研究[J]. 第三军医大学学报, ): 539-544
Luo Li, Hou Fengyan, Yan Jun, Liang Huaping. Influential factors for co-staining of reactive oxidative species and cell nucleus in vitro[J]. J Third Mil Med Univ, ): 539-544.
活性氧与细胞核共染影响因素的实验研究
罗 莉1, 侯凤艳1,2, 严 军1, 梁华平1&&&&
1. 400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室 2. 325035 浙江 温州,温州医科大学附属第一医院急诊科
基金项目:国家自然科学基金面上项目()
通信作者: 严 军,电话:(023),E-mail:
梁华平,电话:(023),E-mail:
摘要:目的 利用二氯荧光黄二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)探针和4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6′-diamidino-2-phenylindole,DAPI)探讨影响活性氧(reactive oxidative species,ROS)和细胞核共染的因素,以优化最佳的研究方案。方法 以RAW 264.7细胞株为研究对象,首先采用不同浓度的多聚甲醛分别固定10、30 min,1、2、4 h,进行ROS和DAPI检测;再用不同的固定试剂分别在ROS检测前和后固定,检测ROS荧光强弱;将DAPI在DCFH-DA探针加入前12、4、2、1 h,20 min加入和两者同时加入,检测DAPI染色情况;最后,DAPI在ROS检测前12 h加入,以不加DAPI组为对照,分别用LPS和H2O2刺激产生ROS并检测,计算其荧光数和平均荧光强度,利用SPSS 18.0软件进行t检验分析。结果 不同固定浓度、固定试剂、固定顺序的结果均表明,固定虽然会增强DAPI的染色,但同时会减弱ROS的荧光强度;活细胞DAPI染色时,随着染色时间的延长,核着色强度和均匀度都更好;DAPI染色12 h后检测ROS,对ROS的荧光数和平均荧光强度都没有统计学影响(P>0.05)。结论
DCFH-DA探针法检测ROS荧光时不能与细胞固定连用;DAPI在DCFH-DA探针孵育前12 h加入,并不影响ROS荧光的产生和检测,该研究方案可有效实现ROS与DAPI的共染。
活性氧&&&&
细胞核&&&&
影响因素&&&&
Influential factors for co-staining of reactive oxidative species and cell nucleus in vitro
Luo Li1, Hou Fengyan1,2,Yan Jun1, ,Wang Gang &&&&
1. State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Department 1, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University,
Chongqing, 400042 2. Department of Emergency, First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang Province, 325035, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China ().
Corresponding author: Yan Jun, E-mail: @163. Liang Huaping, E-mail:
Abstract:ObjectiveTo determine the influential factors of reactive oxidative species (ROS) and cell nucleus co-staining with 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) and 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI). MethodsRAW264.7 cells were fixed with paraformaldehyde (0%, 0.5%, 1%, 2% and 4%) for 10
and 30 min, and 1, 2 and 4 h. Then the ROS and DAPI were detected and the fluorescent signals were analyzed by ImageXpress XLS. Meanwhile, another fixing reagent, ethanol, was adopted to do the similar experiment, and ROS was detected before or after the cells were fixed for 20 min. Thereafter, DAPI staining was performed at 12, 4 and 1 h, 20 and 0 min before DCFH-DA incubation, and the fluorescent signals were detected via the same technology. In addition, LPS and H2O2 were used to induce ROS, and DAPI was stained in advance. Twelve h later, the number of fluorescent cells and the average fluorescence intensity of ROS were detected. All data was analyzed by t-test via SPSS18.0 software.
Results No matter which factors of cell fixation (fixing concentrations, fixing reagents and fixing sequences) were adopted, the fluorescent intensity of ROS was decreased while the fluorescent signals of DAPI was increased. Along with the dying time, the strength and uniformity of DAPI staining became better without fixation. ROS was detected after DAPI staining for 12 h, and there was no significant influence on the number of fluorescent cells and average fluorescence intensity of ROS (P>0.05).
Conclusion It is not suggested to carry out DCFH-DA incubation and cell fixation simultaneously to detect the fluorescence of ROS. However, the measuring effect of fluorescence intensity will not be impacted significantly if DAPI staining is accomplished at 12 h before DCFH-DA incubation. Thus, this proposal may obtain the optimal effect of ROS and DAPI co-staining.
Key words:
reactive oxidative species&&&&
cell nucleus&&&&
co-staining&&&&
influential factors&&&&
随着活性氧(reactive oxidative species,ROS)作为第二信使以及它在各种疾病中的广泛研究[, ],其测定方法得到了极大的发展,其中二氯荧光黄二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)(绿色荧光)探针法是最常用、最快捷、最直观的方法之一。另一方面,4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6′-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(蓝色荧光)作为一种常用的细胞核染料,可透过完整的细胞膜,常用于活细胞和固定细胞的染色,固定后效果更好。为了直观反映不同条件下ROS的变化情况,常规研究需要拍摄绿色荧光照片,同时为了排除非特异的荧光信号和分析数据,还需要拍摄白光或核染色以确定细胞的位置、大小和形态等[],但白光和绿光在合并时会遇到以下问题:白光太亮或绿光太弱,合并后荧光信号弱;白光太暗,图片不美观;另外利用白光图片定位细胞并不准确(可能有细胞重叠、融合等),也不利于高内涵成像分析系统的分析。由于实现ROS与核的共染能够解决上述问题,而探讨影响ROS与DAPI共染的因素(包括固定试剂的种类、浓度、作用时间、顺序以及活染条件等)对于研究结果的科学性又具有重要作用,因此我们以DCFH-DA探针法和DAPI染色为研究手段,对共染过程中出现的问题进行影响因素分析,以便指导和优化现有方法,为后续研究提供理论支持和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
RAW264.7细胞株来自第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室;DCFH-DA探针、DAPI染料、DMSO购自美国Sigma公司;0.25%胰蛋白酶、RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司;H2O2、多聚甲醛和乙醇由成都市科龙化工试剂厂提供。
1.2 多聚甲醛对共染荧光信号的影响
取RAW264.7细胞,弃RPMI1640培养基;用无菌PBS洗涤1次,加0.25%胰酶37 ℃消化3~5 min;用含10% FBS的RPMI1640培养基终止消化,计数;铺板,48孔板,5×104个细胞/孔,37 ℃,5% CO2培养4 h;10 μg/mL LPS刺激12 h,37 ℃,5% CO2培养过夜;PBS洗1次,用0%、0.5%、1%、2%、4%多聚甲醛固定10、30 min,1、2、4 h;PBS洗涤,加入DCFH-DA探针(终浓度20 μmol/L)和DAPI(终浓度1 μg/mL)染料孵育20 min;PBS洗涤2次。高内涵成像分析系统(ImageXpress XLS,Molecular Devices)观察和拍照。
1.3 不同固定方式及其顺序对ROS荧光信号的影响
取RAW264.7细胞,按1.2方法常规细胞铺板,37 ℃,5% CO2培养4 h;10 μg/mL LPS刺激12 h,37 ℃,5% CO2培养;次日,1组细胞先用4%多聚甲醛、95%乙醇、70%乙醇固定20 min,PBS洗涤后加入DCFH-DA探针和DAPI染料孵育20 min;另1组先加DCFH-DA探针孵育20 min,再用4%多聚甲醛、95%乙醇、70%乙醇固定20 min,再加DAPI染料孵育20 min;PBS洗涤2次。倒置荧光显微镜(IX71,OLYMPUS)观察和拍照。
1.4 DAPI染色时间对核染色荧光信号的影响
细胞培养和铺板方法同1.2。LPS(10 μg/mL)刺激12 h,将细胞分为6组,按DAPI(1 μg/mL)和DCFH-DA(20 μmol/L)顺序依次加样作用,表 1为各试剂加样后的间隔时间。DAPI和DCFH-DA探针孵育后,PBS洗涤2次,倒置荧光显微镜观察和拍照。
表 1 DAPI作用不同时间影响细胞核染色荧光信号的实验分组
组别DAPIDCFH-DA
112 h20 min
24 h20 min
32 h20 min
41 h20 min
520 min20 min
60 min20 min
1.5 DAPI长时间作用对ROS测定的影响
细胞培养和铺板方法同1.2。根据1.4的实验结果,选择最合适的DAPI染色时间(12 h),分别用LPS(10 μg/mL)进行长效(12 h)刺激或用H2O2(100 μmol/L)进行短效(5 min)刺激;以不加DAPI为对照组,最后加DCFH-DA探针孵育20 min,实验分组设计见表 2。PBS洗涤2次,高内涵成像分析系统进行拍照和数据分析。
表 2 最佳DAPI作用时间影响不同刺激方式产生ROS的实验分组
组别LPSH2O2DAPI
1.6 统计学分析
1.5实验中每组各设3个重复孔,每孔拍摄9个视野,计算荧光数和荧光强度,用x±s表示,利用SPSS 18.0统计学软件进行t检验。
2.1 多聚甲醛负向影响共染效果并呈明显的量效和时效依赖性
采用不同浓度(0%、0.5%、1%、2%、4%)多聚甲醛固定不同时间(10、30 min,1、2、4 h)后,高内涵成像分析系统荧光检测结果表明,随着多聚甲醛固定时间的延长和固定浓度的增加,DAPI染色越来越强,但ROS荧光信号越来越弱,甚至消失,两者共染效果极差,同时说明ROS荧光的减弱是由于多聚甲醛固定造成的,而非拍照时间过长自然衰减造成的(因为全部图片的采集仅用5 min),如图 1。
A:不同浓度多聚甲醛固定后DAPI染色结果;B:不同浓度多聚甲醛固定后ROS检测结果图 1
多聚甲醛影响DAPI和ROS荧光信号的量效和时效作用(×200)
2.2 荧光信号的减弱和消失只与细胞固定本身有关
采用3种固定液(4%多聚甲醛、95%冰乙醇、70%冰乙醇)和两种固定顺序(固定在DCFH-DA探针孵育之前和之后)作用细胞后,进行ROS荧光检测。图 2结果表明,无论采用哪种固定方式和固定顺序,只要细胞固定后ROS荧光信号都会减弱甚至消失。
A:不同浓度4%多聚甲醛固定后加探针检测ROS;B:不同浓度95%冰乙醇固定后加探针检测ROS;C:70%冰乙醇固定后加探针检测ROS;D:加探针后4%多聚甲醛固定再检测ROS;E:加探针后95%冰乙醇固定再检测ROS;F: 加探针后70%冰乙醇固定再检测ROS图 2
不同固定方式和顺序与ROS荧光信号的变化(×200)
2.3 DAPI染色时间正向影响核染色荧光信号
DAPI染料在DCFH-DA探针孵育前12、4、2、1 h,20 min以及同时加入后,进行DAPI荧光检测。图 3结果表明,DAPI染色时间越短,染色弱且弥散,而随着DAPI染色时间的延长,核染色信号越强且集中。
A: DAPI和探针同时加入染色20B: DAPI在探针加入前染色20 min;C: DAPI在探针加入前染色1 h;D:DAPI在探针加入前染色2 h;E: DAPI在探针加入前染色4 h;F:DAPI在探针加入前染色12 h图 3
DAPI染色时间与核染色荧光信号变化(×200)
2.4 DAPI染色12 h对ROS测定结果无影响
分别采用两种刺激方式(LPS长时间刺激和H2O2短时间刺激)产生ROS,同时进行加/不加DAPI染色12 h,再孵育DCFH-DA探针20 min,PBS洗涤后使用高内涵成像分析系统荧光检测。每个实验组3个重复孔,每孔9个视野。结果表明,DAPI染色12 h对两种刺激方式产生的ROS的平均荧光数和平均荧光强度均无统计学差异(P>0.05),即DAPI染色12h不影响ROS的产生和荧光信号的检测(图 4)。
A:荧光数;B:荧光强度图 4
DAPI对不同方式产生ROS荧光信号的影响
采用DAPI活细胞染色12 h后进行ROS检测,图 5结果显示,既能检测到ROS的荧光信号,同时细胞核也着色明显,该条件很好实现了二者的共染。
A: LPS刺激下,DAPI与ROS染色结果;B:H2O2刺激下,DAPI与ROS染色结果;a:白光观察;b: DAPI染色结果; c: ROS染色结果;d:白光和DAPI融合; e:白光和ROS融合; f: DAPI和ROS融合图 5 不同方式产生的ROS与DAPI的共染效果(×200)
ROS的检测对于及时了解正常或疾病条件下的机体生理/病理反应、预防疾病发生具有重要意义[, , , , , , , , ]。目前常用于ROS测定的荧光探针包括DCFH-DA、双氢罗丹明、氢化乙啡啶等,而DCFH-DA探针法因其简单、方便被广泛使用[],其原理包括酯酶的水解和活性氧的氧化两个过程[]。
按惯性思维在ROS检测时采用固定后DAPI染色(不同固定试剂、浓度、顺序),虽然可以染核,但ROS荧光信号减弱甚至消失,这个现象在A549和HeLa等细胞中也被观察到,分析其原因可能有:ROS检测主要针对细胞膜没有损坏的活细胞,而一经固定,细胞膜的通透性可能发生改变或者固定后导致细胞死亡,从而使活性氧消亡;因此,DCFH-DA探针法不宜与细胞固定一起使用。在不固定细胞的前提下,直接DAPI进行活染,则发现活细胞短时间染核存在荧光信号弱,弥散,漏染等问题,影响图片合并效果和定量分析,因此建议DAPI在染活细胞时,延长染色时间至4~12 h(相对固定细胞的10 min短染),且在探针孵育前染色,因为ROS的产生和消亡是一个比较快速的过程(20~30 min)。
由于本研究使用的高内涵成像系统是一款集速度、图像、数据为一体的荧光系统,耗时短(一般每孔扫描时间在几秒到几十秒之间),特别适合荧光反应迅速的样品检测,例如本研究完成全部孔荧光检测仅用5 min,有效避免常规研究中将“固定导致的荧光衰减”误判为是“拍照后期荧光的自然衰减”,另外可以对荧光信号进行定量分析,从而保证数据的可信度和结论的可靠性。
综上所述,DCFH-DA探针法检测ROS荧光时不能与细胞固定连用,这可能使它在免疫组化和免疫荧光中的应用受到一定限制;但是,DAPI在DCFH-DA探针孵育前12 h加入,并不影响ROS荧光的产生和检测,同时又能将细胞核染色,实现ROS与DAPI在活细胞水平的共染,有助于准确研究ROS在创伤、炎症和疾病组织及细胞中的表达和定位。
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中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,由第三军医大学主管、主办
罗 莉,侯凤艳,严 军,梁华平
Luo Li, Hou Fengyan, Yan Jun, Liang Huaping
活性氧与细胞核共染影响因素的实验研究
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请问ROS结果如何分析
& & 检测ROS时,同一种类细胞分不同批次用流式检测ROS时,不知为什么,有时是单峰,有时是双峰,但会发生右移;所以,关于ROS结果的分析,希望请教以下几个问题:
& & 1、ROS流式检测的图形,是以出现单峰好,还是双峰好?
& & 2、如果是以单峰分析,是用平均荧光强度还是中位数进行评价?为什么?
& & 3、如果以双峰进行分析,流式细胞仪收集细胞时是以不加DCFH-DA的细胞去调节电压以界定阴性细胞群,但是加了处理因素和DCFH-DA的细胞会发生右移,偏移程度不同,且都是两个峰,所以不知道,应该以总体的平均荧光强度进行评价;还是需要划个二分门,分别计算阳性区域和阴性区域的平均荧光强度,但是右移程度不同且双峰明显的图二分门不知怎么划?
& & 希望有老师能给予解答,谢谢您!
用DCFH去做,是否需要用一个已知或者公认的ROS诱导剂做阳性对照,比如说双氧水,然后把处理的细胞和阳性对照去比?
我的个人看法是。首先确认fsc-ssc圈的是同一类细胞,其次,如果出现双峰,应该把marker设置在两个峰中间
&&说的阳性对照也是一个办法。来自: Android客户端
& & 您好!在fsc-ssc图中,细胞团很集中,不会圈错。不知道如果是双峰,能否不划门,直接用总体的平均荧光强度进行分析?
sherry123 发表于
& & 您好!在fsc-ssc图中,细胞团很集中,不会圈错。不知道如果是双峰,能否不划门,直接用总体的平均荧光
最好设门看表达率,原则上如果能够用百分比比较,最好用百分比。来自: Android客户端
我做过的一般都是双峰或连续分布,如果发现是峰移很可能是处理时间过长或强度过大,需要重新做时效与量效。建议用SS/ROS双参划门,用未处理细胞做阴性确定闷得位置。ROS阳性的荧光强度会比较高,可能会用到ND滤片。
对,我也发现如果从处理好样本到上流式细胞仪检测时间超过半小时,就基本是单峰了;但不确定是不是就这个因素引起。您说的用“SS/ROS双参划门”,没理解是什么意思,能具体解释一下吗?还有,ND滤片是流式细胞仪的吗?怎么用荧光显微镜可用ND滤片?
sherry123 发表于
对,我也发现如果从处理好样本到上流式细胞仪检测时间超过半小时,就基本是单峰了;但不确定是不是就这个因 ...
ND就是减光滤片嘛,所有光学设备都可以用。有时候ROS会出现太强的情况(贴在右边),这个时候就需要用到ND滤片,或者把激光功率调小。不过很多分析型的机器不支持这么操作。不过介于你能看见阴阳性群两个峰,应该也就不需要了。
SS/ROS双参数门如下图(实验不是ROS,不过原理一样)。由于细胞形态、大小以及状态的问题,细胞的分布在单参图上的分布貌似是正态的,但在双参图上不是。对于阴阳性很明显的分群,影响不大,但是对于一些连续分布的细胞群可能单用单参图划门就会损失一些比例(如图例中第三行的紫色群)。这些一般都是由于细胞折光不均匀引起的(非正圆形),所以加入一个SS对比例的确定更加好。
didi_zhou 发表于
ND就是减光滤片嘛,所有光学设备都可以用。有时候ROS会出现太强的情况(贴在右边),这个时候就需要用到N ...
学习了,老师讲解的很详细,多谢啦
哦,您的图中SS INT就是指一般的SSC,就是做个FL1-SSC的图是吗?
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