免疫组化及特殊染色 如何复染（免疫组化及特殊染色，苏木精，盐酸，石

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-07-09 09:27 标签： 免疫组化染色是查什么
　　在上世纪30年代，免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）的原理就已经为人所知，但直到1942年，第一个IHC研究成果才正式发表。这也被誉为免疫荧光技术的里程碑。哈佛大学医学院的Albert Coons在《免疫学杂志》上发表文章，利用FITC标记的抗体来鉴定感染组织中的肺炎球菌抗原。1自那以后，组织固定方法、检测标记和显微镜都在不断改进，让免疫组化成为诊断和研究中的一个必备工具。
在病理科，利用特异的肿瘤标志物，医生通过IHC诊断肿瘤是良性还是恶性，确定肿瘤的分期和分级，并确定细胞类型和转移的来源，以便找到原发肿瘤的位置。同样，IHC也能用于药物开发，通过检测疾病靶点的上调或下调来判断药物疗效。
免疫组化指的是根据抗体与抗原特异结合的原理来检测组织切片中的抗原（如蛋白）。immuno的词根来自操作中所使用的抗体，而histo意味着组织。另一种类似的技术是免疫细胞化学（Immunocytochemistry，简称ICC）。这两个词大家经常混着用，看着好像差不多，但实际上还是有点区别。这里顺便说说。
IHC vs. ICC
对于IHC，组织是来自患者或动物，经过冷冻或石蜡包埋。将这些组织制成约4μm厚的切片，封片后再处理。通过这种方法，研究人员可观察细胞组分的定位，同时维持周围组织的原先结构。
对于ICC，大部分细胞外基质及其他基质组分被去除，只剩下整个细胞来染色。ICC的来源可以是细胞悬液，来自患者或动物（如血涂片、拭子等），或在实验室中进行的组织培养细胞系。
除了生物学来源，IHC和ICC在样品处理的程度上也有所不同。ICC需要透化，要么通过固定过程，要么是单独的透化步骤，这样抗体才能与细胞内的靶点相结合。而IHC可能不要单独的透化步骤，这取决于切片的厚度和固定方法。包埋在石蜡中的IHC切片必须进一步处理，才能进行抗体染色。一旦处理好样品，IHC和ICC的染色操作就几乎没什么差异了。当然，就染色而言，根据所使用的抗体来优化还是少不了的。
设计一个成功的IHC/ICC实验
从技术上讲，IHC的原理很简单。首先固定样品，以保留细胞完整性，之后与封闭液共同孵育，避免抗体的非特异结合。随后将样品先后与一抗和二抗孵育，并通过显微镜分析观察信号。
然而，这并不意味着实验很好做。最大的挑战在于如何确定最佳的实验条件，让每个抗原都产生强烈而特异的信号。如果是个高丰度蛋白，那么挺好办，需要的固定时间短，封闭时间短，可以用荧光标记一抗直接检测。但如果要检测冰冻切片中的磷酸化蛋白呢？那可能需要抗原修复，外加放大检测。
R&D Systems的网站列出了IHC/ICC实验设计和优化的变量，如下表。
看完这些，是不是觉得有些头晕呢，这么多地方需要优化。其实也没那么恐怖，生物通接下来会发布一些优化指南，包括如何制备样品，如何选择固定剂，如何优化抗体检测等，千万别错过。此外，R&D Systems等网站也公布了免疫组化的基本操作，以及检测特定抗原的具体条件，可供您参考。（生物通 薄荷）
1. Albert H. Coons, Hugh J. Creech, R. Norman Jones & Ernst Berliner. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody. J. Immunol. 9-170.
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细胞免疫组化的操作流程
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细胞免疫组化的操作流程在许多书中都可以找到，细胞爬片后续操作一样方便，主要如下：&1、细胞爬片制备&2、固定，常用固定液&1.95％酒精，可加入l％量的冰醋酸(按95％酒精99份，冰醋酸1份的比例)，以增强固定效果，并能对抗酒精固定的收缩作用。&乙醚酒精固定液&由95％酒精49.5ml，乙醚49.5ml，冰醋酸lml组成，固定效果较好。但乙醚易燃、易挥发，价格贵，临床使用较少。&Carnoy液&无水酒精：氯仿：冰醋酸：6:3:l。此固定液穿透力强，固定效果好。但价格贵，配制麻烦，一般只在核酸、糖原和粘蛋白等特殊染色中应用。&甲醇&固定效果好，核结构清晰，常用于瑞氏、MGG染色或免疫组化染色的自然干燥涂片预固定。一般滴加数滴铺满涂膜即可。&丙酮&穿透力强，对酶类固定效果好，常用于酶的组织化学染色固定。不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。&3、滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体&4、滴加&I抗50&l,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时&5、PBS洗3次每次2分钟&6、滴加Ⅱ抗45-50&l,室温静置或37℃1小时&7、Ⅱ抗中可加入0.05%的&tween-20.&8、PBS洗3次各5分钟&9、DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度&10、PBS或自来水冲洗10分钟&11、苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化&12、自来水冲洗10-15分钟&13、脱水、透明、封片、镜检。
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（求助）石蜡切片免疫组化显色后一定要复染吗？
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这个帖子发布于13年零197天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
显色后用苏木精复染的目的是什么啊？必须吗？
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显色后用苏木精复染的目的是使细胞的形态更清楚，可以复染一下,也可以不复染。苏木精复染后不会掩盖石蜡切片免疫组化阳性结果,但要注意复染的时间和程度,一般只要淡淡的复染一下就可以了。苏木精复染30s到1分钟，然后双蒸水或自来水中蓝化五分钟，多摸索一下。
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同意楼上,苏木素复染的目的是使背景结构更清晰,胞核及胞浆都可显示,便于对阳性染色在细胞内定位进行判断,从而分析免病组化的结果,毕竟作免疫组化真正的高明地在于对于结果的分析上,实验条件的摸索只是较复杂而已!另外,有些对于结果进行定量分析的图像分析软件是要求不进行复染的,所以建议楼主要根据最后的实验思路进先选择!我最近进行的免疫组化这样复染,苏木素1-2分钟,自来水蓝化,然后在1%盐酸在浸3-4秒(目的是对背景染色调整,防止不强的阳性结果被遮盖),自来水冲冼后过梯度酒精,吹干后封片!希望对你有所帮助!
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