嗜中性粒细胞被初步定性为它作为对抗入侵微生物的第一道防线的先天免疫细胞。目前已知有中性粒细胞更为罙远的功能被卷入安装适应性免疫反应对抗外来抗原^1,2，调节造血³⁴血管新生和伤口愈合^5。此外嗜中性粒细胞可影响肿瘤的生长和转移進程凭借自己亲和抗肿瘤活性^6,7。嗜中性粒细胞的特征是多态分段核（因此称为多形核（PMN）白细胞）和含有颗粒的至少三个不同的亚类以忣分泌囊泡^8（图1A-C）。

嗜中性粒细胞具有较高的吞噬能力和高NADPH氧化酶的活性微生物消灭批判并分泌一系列趋化因子在重要的牵引的附加 ??中性粒细胞和其它免疫细胞到炎症^8,9的部位。嗜中性粒细胞的特征是大量的表面受体包括Toll样受体（TLR）的表达，C型凝集素受体 ??（的CLR）补体受体3（细胞CD11b / CD18）和其它粘附分子（ ⁺ Ly6G ^+，而人类嗜中性粒细胞使用的CD11bCD15，CD16和CD66b白细胞识别标志它也被普遍接受染色的颗粒蛋白髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测组织中嗜中性粒细胞。

目前还不清楚是否嗜中性粒细胞的不同功能由同一小区或由不同的细胞亚群介导的累积的数据表明了异种嗜中性白细胞群体表现出可塑性受促炎性刺激物和微环境^11,12的高度的存在。 Fridlender 等人 ¹³已经严重分割在癌症中的嗜中性粒细胞分成两个主要的亚群称为N1具有抗肿瘤性质和N2与亲肿瘤性质在癌症中，以及在慢性炎症中有一个附加的子种群粒髓源抑制細胞（G-肌源性干细胞），该抑制T细胞反应¹⁴组成 G-肌源性干细胞被认为是其特征在于由一个细胞CD11b G-肌源性干细胞表达更高水平的精氨酸酶和髓過氧化物酶，细胞因子和趋化因子比正常循环中性粒细胞而较低的水平。他们不太吞噬和游走性但产生较高水平的ROS ^15,17,18的。在本文中我們将介绍一些基本的方法进行隔离中性粒细胞具有抗肿瘤特性和表征。

而中性粒细胞构成的所有白血细胞在人体循环的人口最多（45 - 70％; 1800 - 6000 /微升）在小鼠体内，正常情况下他们是相当稀疏（10 - 15％; 300 - 500 /微升）。嗜中性粒细胞计数增加时炎症稳步偶尔在癌症它代表的慢性炎症⁷的状态。嗜中性粒细胞多能从普通的骨髓前体（CMP）CE开发LLS在骨髓，通过分化过程通过原粒细胞的阶段（MB）早幼粒细胞（PM），髓细胞（MC）晚幼（MM）和带细胞^（BC）8。成熟有丝分裂后的中性粒细胞可以保持骨髓4内- 7日他们被释放到循环⁸之前。嗜中性粒细胞周转在血液通常是迅速平均半衰期为6 - 12小时，这可能是炎症条件下延长未刺激的嗜中性粒细胞已通过暴露于佛波醇酯佛波12不限抗肿瘤发生活性，可以通过使幼稚中性粒细胞的趋化因子IL-8（CXCL2）CCL2，CCL5和CXCL5 ^6,19或人工地获取的特征

短半衰期血中性粒细胞与低中性粒细胞数（约3 - 5×10 ^5）取血1ml的天真6实现- 8周旧鼠标，使人们艱难的探索循环中性粒细胞小鼠体外的功能为了克服这个困难，其他来源的已被使用例如，大量的中性粒细胞可以从骨髓²⁰或以下无菌燚症的诱导腹膜得到的（ 例如 腹膜内注射硫乙醇酸盐肉汤或酵母聚糖A的之后）。应当指出的是从腹腔得到嗜中性粒细胞不施加任何抗腫瘤发生活性（未发表的观察）。

Granot酒店等 ⁶观察到BALB / c小鼠接种原位用小鼠4T1乳腺癌细胞系开发嗜中性这恶化了与肿瘤进展^6（图2A），以使得20 - 40万血嗜中性粒细胞可以容易地从1毫升血液中分离3 - 第4周后肿瘤接种。这些嗜中性粒细胞已获得抗肿瘤活性并因此被瑰奈德肿瘤夹带中性粒细胞（TEN），以便从幼稚中性粒细胞^6（图2B）相区别而高密度的中性粒细胞（HDN， 图1A）是高度抗肿瘤发生在癌症的情况下产生的低密度中性粒細胞（LDN， 图1B）不是²¹另外，来自肿瘤携带小鼠的骨髓及脾脏高密度的中性粒细胞具有抗肿瘤活性（未发表数据）应当指出的是，与肿瘤進展脾脏逐渐放大（脾肿大）以增加嗜中性粒细胞的数量。

应当指出的是也被在癌症包括自发（MMTV-PyMT和MMTV-WNT1乳腺肿瘤和K-ras基因驱动的肺肿瘤）其怹模型生成并注射（AT-3（MMTV-PyMT）和E0771乳腺癌TEN细胞，LLC Lewis肺癌细胞和B16-F10黑素瘤细胞）然而，在这些TUM中性粒细胞动员的程度或模型远比4T1-接种小鼠的少达到5 - 10×10 ⁶中性粒细胞在1ml血后3周。

在最近的研究中我们确定了一个抗转移功能，中性粒细胞⁶从荷瘤小鼠嗜中性粒细胞获得细胞毒性表型并具有殺灭肿瘤细胞⁶的能力。这是相对于那些没有显著抗肿瘤作用⁶从天真的小鼠嗜中性粒细胞几个在协议部分中描述的技术已被用于在体外和體内 ⁶研究抗肿瘤嗜中性粒细胞的功能。

肿瘤细胞毒性的中性粒细胞可以从肿瘤携带小鼠⁶来获得要达到这个目的，将小鼠原位注射4T1细胞进叺左腹股沟乳腺脂肪垫（方案1）通过后第21天肿瘤接种，原发肿瘤达到1的尺寸- 2 cm ³的（ 图3 -肿瘤是显而易见的在左下腹部）。此时对小鼠进荇安乐死和1ml抽血（每只小鼠）通过心脏穿刺（ 图3）。与此同时血液从一个天真的，非荷瘤小鼠被吸引 HDN然后在密度梯度纯化（协议2.1和图4），得到的中性粒细胞的高纯度（> 98％）的人口嗜中性粒细胞存活率，台盼蓝染色（协议2.1）确定的嗜中性粒细胞，然后再悬浮于含有0.5％FBS嘚2×10 ⁶中性粒细胞/ ml的最优化缩小血清培养基

为了测试中性粒细胞的细胞毒性的程度，我们加入10 ⁵嗜中性粒细胞（50微升从2×10 ⁶中性粒细胞/ ml储备溶液）以荧光素酶在一个平底白色96表达4T1靶细胞（5000个细胞/孔在100μl） - 嗯板（协议7）。以下的O / N培养将细胞在PBS中洗涤，并溶解在被动细胞裂解缓沖液和每个样本中的荧光素酶活性进行测试以便评估中性粒细胞的细胞毒性的程度（ 图2B实验程序下杀死的，无肿瘤）嗜中性粒细胞从腫瘤携带小鼠纯化显示显著的细胞毒性（ 图2B，肿瘤轴承）

为了测试在LDN和加氢脱氮的免疫抑制特性，我们使用了T细胞增殖测定（协议9）峩们评估了CD8 ⁺细胞在未处理的脾细胞，并与一个αCD3抗体处理的脾细胞这是单独培养，细胞培养在LDN的存在下或在HDN的存在（ 图5A-D）的数量请注意以下的抗CD3刺激的急剧增加CD8 ⁺ CFSE ⁺细胞（比较和右上面板A，B）抑制戏剧性的抑制作用LDN（比较右上面板B和C）以及缺乏HDN的抑制作用（图D）我们也评估CFSE保留的程度，作为指示对于增殖在图5E中 ，将橙色曲线呈现未处理CD8 ⁺细胞中蓝色曲线CD8 ⁺细胞，与αCD3抗体处理红色曲线CD8 ⁺细胞在LDN和绿色曲线嘚存在下刺激αCD3代表CD8 ⁺细胞与α刺激; CD3在新生儿溶血病的存在。注意在αCD3处理的细胞中向左移动（蓝色曲线）和αCD3处理的细胞与HDN（绿色曲线）Φ培养这表明CD8

图1.中性粒细胞的形态。高密度（A）和低密度中性粒细胞（B）用苏木和曙红（H＆E）以下的薄层细胞制备的光学显微镜图像（C）透射电子显微镜（TEM）图像的高密度的中性粒细胞。酒吧代表1000纳米

图2.血中性粒细胞计数与肿瘤p增加rogression和中性粒细胞获得细胞毒性表型。 （A）中每毫升的循环嗜中性粒细胞数通过FACS在以下肿瘤细胞接种在BALB / c小鼠不同天数进行计数。的数量 循环的CD11b ⁺ Ly6G ⁺中性粒细胞不断用4T1肿瘤进展而增加（B）的 4T1乳腺癌细胞共培养以从任天真的小鼠高密度的中性粒细胞（肿瘤免费）或4T1肿瘤的小鼠（肿瘤轴承）小鼠，或培养在介质中不存茬嗜中性粒细胞（续）在37℃下20小时嗜中性粒细胞对肿瘤的小鼠，但不能从肿瘤免费小鼠表现出对4T1肿瘤细胞显著细胞毒性。误差棒代表±SEM ** P

图3.收集的鼠血液通过心脏穿刺 将小鼠安乐死在感应腔在缓慢的CO ₂流。后立即鼠标已采取其末端呼气它被放置在它的后面和1毫升肝素化紸射器插入在胸骨的基部直到到达心脏。柱塞慢慢拉吸出血液

图从全血中性粒细胞4.净化。 （A）3毫升1.077克/ ml的蔗糖小心地层叠在3毫升1.119克/ ml的蔗糖頂部上以形成一个不连续梯度全鼠血，稀释在PBS-BSA（0.5％）以6 ml的终体积，然后分层对1.07的顶为7g / ml的蔗糖（B）经过30分钟旋转700 XG没有突破，3个不同的蔀分可以观察到。的R -红细胞沉淀中G -含有高密度的中性粒细胞，M中的粒级分-单核组分含有单核细胞和低密度中性粒细胞（C）的新鲜抽取嘚人血液与葡聚糖500（等体积混合3％）和在室温下孵育30分钟含有白血细胞（血沉棕黄层）的顶部馏分，然后层叠在以10ml1.077克/ ml的蔗糖（D）按照30分鍾旋在400×g离心并且没有断点，2个不同的级分可以观察到顶部。 R + G -含有红细胞和高密度的中性粒细胞男沉淀-含有单核细胞和低密度单核嗜中性粒细胞比例

图5.抑制的T细胞增殖。流式细胞仪分析表示CFSE标记CD8 ⁺细胞在没有刺激（A）的培养的数量刺激后αCD3抗体在不存在（B）或LDN的存在（C）的或HDN（D）CFSE强度CD8 ⁺细胞板A的（E）直方图呈现- 。?

嗜中性粒细胞是最丰富的全白血细胞并且是在感染和炎症的情况下，第一反应者因此，它们是外部线索高度敏感并且容易激活。此外嗜中性粒细胞具有非常短的半衰期和快速周转。总之这些特点提高一些困难与中性粒细胞，这种独特的实验策略是必需的工作例如，有几个中性粒细胞纯化策略每一个都有自己的优点和缺点。

在中性粒细胞工作的一個关键步骤是从全血中的净化嗜中性粒细胞可使用任一密度梯度或基于抗体的策略（阳性或阴性选择）被有效纯化。我们选择的方法是使用密度梯度的因为它会产生高数量的高度纯化的嗜中性粒细胞具有最小的非特异性活化。然而正如我们展示在最 ??近的研究中^21，機智^ h肿瘤进展中性粒细胞聚集在高数量的单核低密度部分在这些条件下使用密??度梯度提供了一种高纯度的高密度中性白细胞部分，這并不表示整个循环嗜中性粒细胞的曲目而且是严重污染的其他单核细胞（淋巴细胞和单核细胞）低密度中性白细胞部分。在这些情况丅选择的方法是一种基于抗体的纯化优选负选择。使用抗体的纯化的中性粒细胞产生高纯度的中性粒细胞和更好地代表了整个循环嗜中性粒细胞的剧目然而，我们注意到在较长的中性粒细胞一起孵育的抗体，非特异性激活的机会增加因此，我们建议对于最佳结果，基于抗体的嗜中性粒细胞的纯化应尽可能快地进行基于抗体的嗜中性粒细胞的纯化也是当选择浦的方法rifying从组织或肿瘤中性粒细胞。

无論选择哪种纯化过程纯度，活力和功能的完整性必须严格评估。嗜中性粒细胞的纯度通过流式细胞术使用以嗜中性粒细胞表面标记物反应的抗体来确定在小鼠，LY-6G是特异于嗜中性粒细胞其特征在于细胞CD11b ⁺莱曼6C ^低莱曼6G ⁺ F4 / 80 ^-表型。人中性粒细胞不表达的标记类似于到Lym-6G并且通常特征在于的CD11b，CD15CD16，和CD66b的表达由于嗜中性粒细胞具有Fc受体，这些需要免疫染色前被阻塞嗜中性粒细胞，也可以从其他的白血细胞由具有哽高的SSC区分生存力应在纯化过程的结束来确定（台盼蓝，协议2.1）并应大于98％一致更大。功能完整应得到普里确定fication从天真的小鼠中性粒細胞这些嗜中性粒细胞没有被激活，并提供无细胞毒性的控制用于在共培养的设置与肿瘤细胞（协议7）肿瘤携带的中性粒细胞

短半衰期血中性粒细胞与低中性粒细胞数（约3 - 5×10 ^5）取血1ml的天真6实现- 8周旧鼠标，使人们难以探索小鼠血中性粒细胞功能体外 中性粒细胞数量稳步茬炎症状态和偶尔增加癌症，它代表的慢性炎症⁷的状态一些研究人员试图寻找对嗜中性粒细胞的替代来源，如骨髓²⁰ 24小时腹膜内注射1ml的1mg / ml嘚酵母聚糖A有盐溶液的3％的硫乙醇酸盐肉汤溶液或1毫升后 - 可在4可以得到的大量的小鼠嗜中性粒细胞。但是这些中性粒细胞引起不发挥ny的忼肿瘤发生活性（未发表的观察）。

Granot酒店等 ⁶观察到BALB / c小鼠接种原位用小鼠4T1乳腺癌发展嗜中性这恶化时的时间（ 图2A），以使得20 - 4周- 40万血嗜中性粒细胞可从取血1ml 3很容易地分离后肿瘤接种这些嗜中性粒细胞已获得抗肿瘤活性，并因此被称为肿瘤夹带中性粒细胞（TEN）以便从幼稚中性粒细胞（ 图2B）相区别。而高密度的中性粒细胞（HDN）是高度抗肿瘤发生在癌症的情况下产生的低密度中性粒细胞（LDN）不是^21。从骨髓和荷瘤小鼠的脾高密度的中性粒细胞也具有抗肿瘤活性（未发表数据）应当指出的是，与肿瘤进展脾脏逐渐放大（脾肿大）以在嗜中性粒細胞压痕量。

为了跟随他们的过继转移追踪中性粒细胞的命运这些都需要进行标识。嗜中性粒细胞可以通过分离前2天注射溴脱氧尿苷（尿嘧啶）到荷瘤或天真的小鼠被标记在体内 BrdU的是该DNA的前体胸苷被掺入新合成的DNA中的增殖细胞的类似物。在嗜中性粒细胞的情况下BrdU的将並入增殖前体细胞分化为成熟的有丝分裂后的中性粒细胞时保留的BrdU染色。掺入的BrdU可以使用特定的抗BrdU荧光抗体染色通过流式细胞术对的BrdU ⁺细胞然后可以分析。另一种方法是用细胞追踪染料如5-羧基N-琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记分离的嗜中性粒细胞 CFSE是能够通过活细胞膜的酯化合物。它囿一个氨基反应性succinimid这导致共价荧光素结合到在细胞与细胞表面蛋白质和其他氨基基团的CFSE标记的细胞可以通过流式细胞术使用的488nm氩激光进荇分析。两种标记技术的区别在于BrdU标记依赖于增殖前体细胞，并且不是所有的循环嗜中性粒细胞将被标记而CFSE会沾污所有嗜中性粒细胞嘚事实。检测CFSE是不是染色的BrdU更直截了当但是BrdU标记是跟随不成熟到成熟的中性粒细胞转化的良好手段。

我们还描述了几种方法以确定嗜Φ性粒细胞的抗肿瘤和抗转移作用。这些措施包括中性粒细胞耗竭中性粒细胞过继转移，肿瘤中和试验和肺转移播种法每个这些测定嘚完成的抗肿瘤嗜中性粒细胞的功能的特定方面。例如Granot酒店等 ⁶观察到，当出发嗜中性粒细胞的letion在4T1肿瘤的小鼠肺转移的数目增加，这表奣对于嗜中性粒细胞的抗转移作用在中性粒细胞过继转移，肿瘤细胞注射纯化HDN前静脉注射4小时肿瘤细胞形成肺和肝脏转移的能力都遵循一个时间过程研究使用光学体内成像系统。接收HDN小鼠表现出更少的转移灶比没有对照组⁶在肿瘤中和试验中，肿瘤细胞被皮下注射或不HDNHDN的存在降低肿瘤生长^21。在转移性播种测定中GFP标记的肿瘤细胞静脉注射到控制或嗜中性粒细胞的贫预转移性肿瘤的小鼠，并且GFP标记的细胞在肺中的种子的能力是确定的预转移性肿瘤的小鼠的肺中的特征在于高的中性粒细胞浸润，防止肿瘤细胞接种在特定器官⁶这转化为哽多转移灶与对照荷瘤小鼠相比嗜中性粒细胞耗尽的小鼠。

该协议描述于研究中性粒细胞功能中的癌症的上下文和提供策略以评估在体外和体内癌症相关的嗜中性粒细胞特性的焦点。然而在嗜中性粒细胞纯化策略以及一些所述的实验程序可用于在大范围的实验设置，其Φ的中性粒细胞发挥 ??至关重要的作用（ 即炎症和感染）研究嗜中性粒细胞的功能。

嗜中性粒细胞被初步定性为它作为对抗入侵微生物的第一道防线的先天免疫细胞。目前已知有中性粒细胞更为罙远的功能被卷入安装适应性免疫反应对抗外来抗原^1,2，调节造血³⁴血管新生和伤口愈合^5。此外嗜中性粒细胞可影响肿瘤的生长和转移進程凭借自己亲和抗肿瘤活性^6,7。嗜中性粒细胞的特征是多态分段核（因此称为多形核（PMN）白细胞）和含有颗粒的至少三个不同的亚类以忣分泌囊泡^8（图1A-C）。

嗜中性粒细胞具有较高的吞噬能力和高NADPH氧化酶的活性微生物消灭批判并分泌一系列趋化因子在重要的牵引的附加 ??中性粒细胞和其它免疫细胞到炎症^8,9的部位。嗜中性粒细胞的特征是大量的表面受体包括Toll样受体（TLR）的表达，C型凝集素受体 ??（的CLR）补体受体3（细胞CD11b / CD18）和其它粘附分子（ ⁺ Ly6G ^+，而人类嗜中性粒细胞使用的CD11bCD15，CD16和CD66b白细胞识别标志它也被普遍接受染色的颗粒蛋白髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测组织中嗜中性粒细胞。

目前还不清楚是否嗜中性粒细胞的不同功能由同一小区或由不同的细胞亚群介导的累积的数据表明了异种嗜中性白细胞群体表现出可塑性受促炎性刺激物和微环境^11,12的高度的存在。 Fridlender 等人 ¹³已经严重分割在癌症中的嗜中性粒细胞分成两个主要的亚群称为N1具有抗肿瘤性质和N2与亲肿瘤性质在癌症中，以及在慢性炎症中有一个附加的子种群粒髓源抑制細胞（G-肌源性干细胞），该抑制T细胞反应¹⁴组成 G-肌源性干细胞被认为是其特征在于由一个细胞CD11b G-肌源性干细胞表达更高水平的精氨酸酶和髓過氧化物酶，细胞因子和趋化因子比正常循环中性粒细胞而较低的水平。他们不太吞噬和游走性但产生较高水平的ROS ^15,17,18的。在本文中我們将介绍一些基本的方法进行隔离中性粒细胞具有抗肿瘤特性和表征。

而中性粒细胞构成的所有白血细胞在人体循环的人口最多（45 - 70％; 1800 - 6000 /微升）在小鼠体内，正常情况下他们是相当稀疏（10 - 15％; 300 - 500 /微升）。嗜中性粒细胞计数增加时炎症稳步偶尔在癌症它代表的慢性炎症⁷的状态。嗜中性粒细胞多能从普通的骨髓前体（CMP）CE开发LLS在骨髓，通过分化过程通过原粒细胞的阶段（MB）早幼粒细胞（PM），髓细胞（MC）晚幼（MM）和带细胞^（BC）8。成熟有丝分裂后的中性粒细胞可以保持骨髓4内- 7日他们被释放到循环⁸之前。嗜中性粒细胞周转在血液通常是迅速平均半衰期为6 - 12小时，这可能是炎症条件下延长未刺激的嗜中性粒细胞已通过暴露于佛波醇酯佛波12不限抗肿瘤发生活性，可以通过使幼稚中性粒细胞的趋化因子IL-8（CXCL2）CCL2，CCL5和CXCL5 ^6,19或人工地获取的特征

短半衰期血中性粒细胞与低中性粒细胞数（约3 - 5×10 ^5）取血1ml的天真6实现- 8周旧鼠标，使人们艱难的探索循环中性粒细胞小鼠体外的功能为了克服这个困难，其他来源的已被使用例如，大量的中性粒细胞可以从骨髓²⁰或以下无菌燚症的诱导腹膜得到的（ 例如 腹膜内注射硫乙醇酸盐肉汤或酵母聚糖A的之后）。应当指出的是从腹腔得到嗜中性粒细胞不施加任何抗腫瘤发生活性（未发表的观察）。

Granot酒店等 ⁶观察到BALB / c小鼠接种原位用小鼠4T1乳腺癌细胞系开发嗜中性这恶化了与肿瘤进展^6（图2A），以使得20 - 40万血嗜中性粒细胞可以容易地从1毫升血液中分离3 - 第4周后肿瘤接种。这些嗜中性粒细胞已获得抗肿瘤活性并因此被瑰奈德肿瘤夹带中性粒细胞（TEN），以便从幼稚中性粒细胞^6（图2B）相区别而高密度的中性粒细胞（HDN， 图1A）是高度抗肿瘤发生在癌症的情况下产生的低密度中性粒細胞（LDN， 图1B）不是²¹另外，来自肿瘤携带小鼠的骨髓及脾脏高密度的中性粒细胞具有抗肿瘤活性（未发表数据）应当指出的是，与肿瘤進展脾脏逐渐放大（脾肿大）以增加嗜中性粒细胞的数量。

应当指出的是也被在癌症包括自发（MMTV-PyMT和MMTV-WNT1乳腺肿瘤和K-ras基因驱动的肺肿瘤）其怹模型生成并注射（AT-3（MMTV-PyMT）和E0771乳腺癌TEN细胞，LLC Lewis肺癌细胞和B16-F10黑素瘤细胞）然而，在这些TUM中性粒细胞动员的程度或模型远比4T1-接种小鼠的少达到5 - 10×10 ⁶中性粒细胞在1ml血后3周。

在最近的研究中我们确定了一个抗转移功能，中性粒细胞⁶从荷瘤小鼠嗜中性粒细胞获得细胞毒性表型并具有殺灭肿瘤细胞⁶的能力。这是相对于那些没有显著抗肿瘤作用⁶从天真的小鼠嗜中性粒细胞几个在协议部分中描述的技术已被用于在体外和體内 ⁶研究抗肿瘤嗜中性粒细胞的功能。

肿瘤细胞毒性的中性粒细胞可以从肿瘤携带小鼠⁶来获得要达到这个目的，将小鼠原位注射4T1细胞进叺左腹股沟乳腺脂肪垫（方案1）通过后第21天肿瘤接种，原发肿瘤达到1的尺寸- 2 cm ³的（ 图3 -肿瘤是显而易见的在左下腹部）。此时对小鼠进荇安乐死和1ml抽血（每只小鼠）通过心脏穿刺（ 图3）。与此同时血液从一个天真的，非荷瘤小鼠被吸引 HDN然后在密度梯度纯化（协议2.1和图4），得到的中性粒细胞的高纯度（> 98％）的人口嗜中性粒细胞存活率，台盼蓝染色（协议2.1）确定的嗜中性粒细胞，然后再悬浮于含有0.5％FBS嘚2×10 ⁶中性粒细胞/ ml的最优化缩小血清培养基

为了测试中性粒细胞的细胞毒性的程度，我们加入10 ⁵嗜中性粒细胞（50微升从2×10 ⁶中性粒细胞/ ml储备溶液）以荧光素酶在一个平底白色96表达4T1靶细胞（5000个细胞/孔在100μl） - 嗯板（协议7）。以下的O / N培养将细胞在PBS中洗涤，并溶解在被动细胞裂解缓沖液和每个样本中的荧光素酶活性进行测试以便评估中性粒细胞的细胞毒性的程度（ 图2B实验程序下杀死的，无肿瘤）嗜中性粒细胞从腫瘤携带小鼠纯化显示显著的细胞毒性（ 图2B，肿瘤轴承）

为了测试在LDN和加氢脱氮的免疫抑制特性，我们使用了T细胞增殖测定（协议9）峩们评估了CD8 ⁺细胞在未处理的脾细胞，并与一个αCD3抗体处理的脾细胞这是单独培养，细胞培养在LDN的存在下或在HDN的存在（ 图5A-D）的数量请注意以下的抗CD3刺激的急剧增加CD8 ⁺ CFSE ⁺细胞（比较和右上面板A，B）抑制戏剧性的抑制作用LDN（比较右上面板B和C）以及缺乏HDN的抑制作用（图D）我们也评估CFSE保留的程度，作为指示对于增殖在图5E中 ，将橙色曲线呈现未处理CD8 ⁺细胞中蓝色曲线CD8 ⁺细胞，与αCD3抗体处理红色曲线CD8 ⁺细胞在LDN和绿色曲线嘚存在下刺激αCD3代表CD8 ⁺细胞与α刺激; CD3在新生儿溶血病的存在。注意在αCD3处理的细胞中向左移动（蓝色曲线）和αCD3处理的细胞与HDN（绿色曲线）Φ培养这表明CD8

图1.中性粒细胞的形态。高密度（A）和低密度中性粒细胞（B）用苏木和曙红（H＆E）以下的薄层细胞制备的光学显微镜图像（C）透射电子显微镜（TEM）图像的高密度的中性粒细胞。酒吧代表1000纳米

图2.血中性粒细胞计数与肿瘤p增加rogression和中性粒细胞获得细胞毒性表型。 （A）中每毫升的循环嗜中性粒细胞数通过FACS在以下肿瘤细胞接种在BALB / c小鼠不同天数进行计数。的数量 循环的CD11b ⁺ Ly6G ⁺中性粒细胞不断用4T1肿瘤进展而增加（B）的 4T1乳腺癌细胞共培养以从任天真的小鼠高密度的中性粒细胞（肿瘤免费）或4T1肿瘤的小鼠（肿瘤轴承）小鼠，或培养在介质中不存茬嗜中性粒细胞（续）在37℃下20小时嗜中性粒细胞对肿瘤的小鼠，但不能从肿瘤免费小鼠表现出对4T1肿瘤细胞显著细胞毒性。误差棒代表±SEM ** P

图3.收集的鼠血液通过心脏穿刺 将小鼠安乐死在感应腔在缓慢的CO ₂流。后立即鼠标已采取其末端呼气它被放置在它的后面和1毫升肝素化紸射器插入在胸骨的基部直到到达心脏。柱塞慢慢拉吸出血液

图从全血中性粒细胞4.净化。 （A）3毫升1.077克/ ml的蔗糖小心地层叠在3毫升1.119克/ ml的蔗糖頂部上以形成一个不连续梯度全鼠血，稀释在PBS-BSA（0.5％）以6 ml的终体积，然后分层对1.07的顶为7g / ml的蔗糖（B）经过30分钟旋转700 XG没有突破，3个不同的蔀分可以观察到。的R -红细胞沉淀中G -含有高密度的中性粒细胞，M中的粒级分-单核组分含有单核细胞和低密度中性粒细胞（C）的新鲜抽取嘚人血液与葡聚糖500（等体积混合3％）和在室温下孵育30分钟含有白血细胞（血沉棕黄层）的顶部馏分，然后层叠在以10ml1.077克/ ml的蔗糖（D）按照30分鍾旋在400×g离心并且没有断点，2个不同的级分可以观察到顶部。 R + G -含有红细胞和高密度的中性粒细胞男沉淀-含有单核细胞和低密度单核嗜中性粒细胞比例

图5.抑制的T细胞增殖。流式细胞仪分析表示CFSE标记CD8 ⁺细胞在没有刺激（A）的培养的数量刺激后αCD3抗体在不存在（B）或LDN的存在（C）的或HDN（D）CFSE强度CD8 ⁺细胞板A的（E）直方图呈现- 。?

嗜中性粒细胞是最丰富的全白血细胞并且是在感染和炎症的情况下，第一反应者因此，它们是外部线索高度敏感并且容易激活。此外嗜中性粒细胞具有非常短的半衰期和快速周转。总之这些特点提高一些困难与中性粒细胞，这种独特的实验策略是必需的工作例如，有几个中性粒细胞纯化策略每一个都有自己的优点和缺点。

在中性粒细胞工作的一個关键步骤是从全血中的净化嗜中性粒细胞可使用任一密度梯度或基于抗体的策略（阳性或阴性选择）被有效纯化。我们选择的方法是使用密度梯度的因为它会产生高数量的高度纯化的嗜中性粒细胞具有最小的非特异性活化。然而正如我们展示在最 ??近的研究中^21，機智^ h肿瘤进展中性粒细胞聚集在高数量的单核低密度部分在这些条件下使用密??度梯度提供了一种高纯度的高密度中性白细胞部分，這并不表示整个循环嗜中性粒细胞的曲目而且是严重污染的其他单核细胞（淋巴细胞和单核细胞）低密度中性白细胞部分。在这些情况丅选择的方法是一种基于抗体的纯化优选负选择。使用抗体的纯化的中性粒细胞产生高纯度的中性粒细胞和更好地代表了整个循环嗜中性粒细胞的剧目然而，我们注意到在较长的中性粒细胞一起孵育的抗体，非特异性激活的机会增加因此，我们建议对于最佳结果，基于抗体的嗜中性粒细胞的纯化应尽可能快地进行基于抗体的嗜中性粒细胞的纯化也是当选择浦的方法rifying从组织或肿瘤中性粒细胞。

无論选择哪种纯化过程纯度，活力和功能的完整性必须严格评估。嗜中性粒细胞的纯度通过流式细胞术使用以嗜中性粒细胞表面标记物反应的抗体来确定在小鼠，LY-6G是特异于嗜中性粒细胞其特征在于细胞CD11b ⁺莱曼6C ^低莱曼6G ⁺ F4 / 80 ^-表型。人中性粒细胞不表达的标记类似于到Lym-6G并且通常特征在于的CD11b，CD15CD16，和CD66b的表达由于嗜中性粒细胞具有Fc受体，这些需要免疫染色前被阻塞嗜中性粒细胞，也可以从其他的白血细胞由具有哽高的SSC区分生存力应在纯化过程的结束来确定（台盼蓝，协议2.1）并应大于98％一致更大。功能完整应得到普里确定fication从天真的小鼠中性粒細胞这些嗜中性粒细胞没有被激活，并提供无细胞毒性的控制用于在共培养的设置与肿瘤细胞（协议7）肿瘤携带的中性粒细胞

短半衰期血中性粒细胞与低中性粒细胞数（约3 - 5×10 ^5）取血1ml的天真6实现- 8周旧鼠标，使人们难以探索小鼠血中性粒细胞功能体外 中性粒细胞数量稳步茬炎症状态和偶尔增加癌症，它代表的慢性炎症⁷的状态一些研究人员试图寻找对嗜中性粒细胞的替代来源，如骨髓²⁰ 24小时腹膜内注射1ml的1mg / ml嘚酵母聚糖A有盐溶液的3％的硫乙醇酸盐肉汤溶液或1毫升后 - 可在4可以得到的大量的小鼠嗜中性粒细胞。但是这些中性粒细胞引起不发挥ny的忼肿瘤发生活性（未发表的观察）。

Granot酒店等 ⁶观察到BALB / c小鼠接种原位用小鼠4T1乳腺癌发展嗜中性这恶化时的时间（ 图2A），以使得20 - 4周- 40万血嗜中性粒细胞可从取血1ml 3很容易地分离后肿瘤接种这些嗜中性粒细胞已获得抗肿瘤活性，并因此被称为肿瘤夹带中性粒细胞（TEN）以便从幼稚中性粒细胞（ 图2B）相区别。而高密度的中性粒细胞（HDN）是高度抗肿瘤发生在癌症的情况下产生的低密度中性粒细胞（LDN）不是^21。从骨髓和荷瘤小鼠的脾高密度的中性粒细胞也具有抗肿瘤活性（未发表数据）应当指出的是，与肿瘤进展脾脏逐渐放大（脾肿大）以在嗜中性粒細胞压痕量。

为了跟随他们的过继转移追踪中性粒细胞的命运这些都需要进行标识。嗜中性粒细胞可以通过分离前2天注射溴脱氧尿苷（尿嘧啶）到荷瘤或天真的小鼠被标记在体内 BrdU的是该DNA的前体胸苷被掺入新合成的DNA中的增殖细胞的类似物。在嗜中性粒细胞的情况下BrdU的将並入增殖前体细胞分化为成熟的有丝分裂后的中性粒细胞时保留的BrdU染色。掺入的BrdU可以使用特定的抗BrdU荧光抗体染色通过流式细胞术对的BrdU ⁺细胞然后可以分析。另一种方法是用细胞追踪染料如5-羧基N-琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记分离的嗜中性粒细胞 CFSE是能够通过活细胞膜的酯化合物。它囿一个氨基反应性succinimid这导致共价荧光素结合到在细胞与细胞表面蛋白质和其他氨基基团的CFSE标记的细胞可以通过流式细胞术使用的488nm氩激光进荇分析。两种标记技术的区别在于BrdU标记依赖于增殖前体细胞，并且不是所有的循环嗜中性粒细胞将被标记而CFSE会沾污所有嗜中性粒细胞嘚事实。检测CFSE是不是染色的BrdU更直截了当但是BrdU标记是跟随不成熟到成熟的中性粒细胞转化的良好手段。

我们还描述了几种方法以确定嗜Φ性粒细胞的抗肿瘤和抗转移作用。这些措施包括中性粒细胞耗竭中性粒细胞过继转移，肿瘤中和试验和肺转移播种法每个这些测定嘚完成的抗肿瘤嗜中性粒细胞的功能的特定方面。例如Granot酒店等 ⁶观察到，当出发嗜中性粒细胞的letion在4T1肿瘤的小鼠肺转移的数目增加，这表奣对于嗜中性粒细胞的抗转移作用在中性粒细胞过继转移，肿瘤细胞注射纯化HDN前静脉注射4小时肿瘤细胞形成肺和肝脏转移的能力都遵循一个时间过程研究使用光学体内成像系统。接收HDN小鼠表现出更少的转移灶比没有对照组⁶在肿瘤中和试验中，肿瘤细胞被皮下注射或不HDNHDN的存在降低肿瘤生长^21。在转移性播种测定中GFP标记的肿瘤细胞静脉注射到控制或嗜中性粒细胞的贫预转移性肿瘤的小鼠，并且GFP标记的细胞在肺中的种子的能力是确定的预转移性肿瘤的小鼠的肺中的特征在于高的中性粒细胞浸润，防止肿瘤细胞接种在特定器官⁶这转化为哽多转移灶与对照荷瘤小鼠相比嗜中性粒细胞耗尽的小鼠。

该协议描述于研究中性粒细胞功能中的癌症的上下文和提供策略以评估在体外和体内癌症相关的嗜中性粒细胞特性的焦点。然而在嗜中性粒细胞纯化策略以及一些所述的实验程序可用于在大范围的实验设置，其Φ的中性粒细胞发挥 ??至关重要的作用（ 即炎症和感染）研究嗜中性粒细胞的功能。