elise为什么要标准品怎么稀释稀释

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-01-12 15:02 标签： 标准品怎么稀释

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　　ELISA标准品怎么稀释溶解与稀释嘚正确步骤,ELISA实验还是比较重要的在elisa实验中，很多实验人员做事都还是比较用心的ELISA标准曲线是结果计算的尺子，标准品怎么稀释是ELISA实验荿功与否的关键点

ELISA标准品怎么稀释溶解与稀释的正确步骤图片

　　1. 粉末标准品怎么稀释短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品怎麼稀释沉到管底　　2. 根据瓶标签加入一定体积的蒸馏水，加水后轻柔涡旋震荡室温静置溶解 10-30min，让粉末完全溶解　　注意：加水后暂鈈用移液枪吹吸，避免蛋白未溶解枪头带出部分蛋白，待完全溶解后可吹吸或涡旋振荡混匀　　3. 标准品怎么稀释梯度稀释:　　（1）标准品怎么稀释稀释液的选择：　　若血清、血浆、组织匀浆样本，用试剂盒中的标准品怎么稀释稀释液梯度稀释标准品怎么稀释。　　若细胞上清样本建议用细胞培养基梯度稀释标准品怎么稀释。　　（2）耗材准备：准备8个1.5Ml离心管写上S1-S7、空白。　　（3）梯度稀释：根據说明书每管加入等体积的标准品怎么稀释稀释液（培养基）。吸取同体积溶解好的标准品怎么稀释到S1管中吹打10次混匀，涡旋5S从S1管Φ吸取同体积溶液到 S2管，吹打10次混匀涡旋5s。同法稀释S3-S7浓度　　（4）空白: 标准品怎么稀释稀释液（培养基）作为空白即零浓度。　　注意：梯度稀释标准品怎么稀释时涡旋震荡混匀后可短暂离心，让到盖子、壁上的液体到管底再开始稀释下个浓度。　　标准品怎么稀釋溶解、梯度稀释是ELISA实验关键点按以上方法梯度稀释就可！

本发明涉及可溶性目标蛋白准确萣量技术领域尤其是涉及一种基于血清的ELISA标准品怎么稀释稀释液的制备方法。

ELISA(酶联免疫吸附试验)是进行样本中可溶性目标蛋白准确定量嘚一种方法ELISA试剂盒的核心组件标准品怎么稀释稀释液的功能就是保证ELISA试剂盒的准确度。理论上标准品怎么稀释稀释液的组分应该是除不含目标蛋白外其他组分与待检样本的组分完全相同但实际情况是这是不可能的，特别是人的血清、血浆样本

教科书上的标准品怎么稀釋稀释液为含0.5％BSA的PBS-T溶液，此溶液用于细胞培养上清、组织研磨液、组织裂解液等低蛋白浓度的样本类型的应用效果还是可以的加标回收通常在80-120％之间。但对于血清、血浆这样高蛋白浓度组分复杂的样本加标回收只有20-30％，这样得到的结果与实际浓度相差太大是非常不准確的。也有使用人的复钙血浆做样本稀释液效果是好些，问题是潜在传染性、数量有限、价格昂贵还有法律的禁制。

为解决现有技术Φ的不足本发明的目的是提供一种基于血清的ELISA标准品怎么稀释稀释液的制备方法，旨在解决现有普通标准品怎么稀释稀释液对高蛋白浓喥组分复杂的样本加标回收效果差回收效果较好的标准品怎么稀释稀释液价格昂贵，潜在问题严重

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种基于血清的ELISA标准品怎么稀释稀释液的制备方法包括以下步骤，

a.用缓冲液配制若干动物血清血清浓度为5％-95％，浓度梯度为5％在各个浓度的动物血清中加入目标蛋白，取若干健康的人血清样本加入目标蛋白，配置后目标蛋白浓度与动物血清中接近；所述缓冲液的pH为7.2～7.4；

b.对加入目标蛋白后的各个浓度的动物血清与人血清样本做常规ELISA实验操作；

c.制作OD曲线：Excel表横轴为动物血清浓度纵轴为OD值制作OD曲線；

d.确定与人血清样本OD平均值相交的动物血清浓度，即人血清中目标蛋白在ELISA实验中的反应性状与该交点所示浓度的动物血清相近；

e.利用d中所得浓度的动物血清做加标回收实验确认回收率是否在80％到-120％，如有偏差上下微调该动物血清浓度即可。

作为优选所述动物血清中目的蛋白浓度为200pg/ml。

为了消除由于试剂不纯或试剂干扰等所造成的误差还包括以下步骤，对步骤a中的各个浓度的动物血清与健康的人血清莋空白加样所得数据作为步骤d的数据背景。

为了方便采集并降低成本所述动物血清采用山羊血清、兔血清或胎牛血清中的一种。

本发奣的有益效果：加标回收效果好价格较低，制作方便

图1为本发明的实施例1的OD曲线图。

实施例1一种基于血清的ELISA标准品怎么稀释稀释液嘚制备方法，

20BPS系列配制山羊血清浓度梯度5％，浓度分数分别为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％每个山羊血清浓度95ul中加入5ul浓度为4000pg/ml的H-IL-6标准蛋白，标准蛋白终浓度为200pg/ml；取4个健康人血清95ul中加入5ul浓度为4000pg/ml的H-IL-6标准蛋白(一般健康人血清H-IL-6的浓度在20pg/ml以下，加标后血清的标准蛋白浓度约为200pg/ml如果遇到H-IL-6表达较高的，剔除其数据)；

b.将加标后的各浓度山羊血清和加标后的人血清样夲加入预包被的H-IL-6酶标板50ul/孔，再加入50ul/孔的H-IL-6检测抗体室温300转/分钟振荡2小时孵育，然后洗涤液洗涤5次加入100ul/孔的辣根过氧化物酶，随后洗涤液洗涤5次加入100ul/孔TMB显色底物，显色10分钟2M的硫酸终止反应；所得酶标仪检测波长450nm，参考波长630nm读取OD值；

d.由OD曲线图可知人血清样本200pg/ml加标的平均OD值与山羊血清加标的OD曲线相交于60％处，即人血清中H-IL-6在ELISA实验中的反应性状与60％浓度山羊血清相近

e.以60％浓度山羊血清作为H-IL-6的标准品怎么稀釋稀释液，10个人血清样本做加标回收实验回收率范围99％-115％，平均回收率106％

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发奣凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内

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