本发明在其一些实施方案中涉及使用侧流免疫测定测量TRAIL多肽的方法该测定可用于多种不同的应用，包括区分细菌和病毒感染以及患者的总体预后
抗生素(Abx)为世界上开具處方最多的药物种类，全球市场价值250-300亿美元Abx也是世界上滥用最多的药物，其中所有药物中很大一部分(40-70％)被错误开具处方
一种类型的Abx滥鼡为在非细菌性疾病，比如病毒感染(对此Abx无效)的情况下给予药物例如，根据美国疾病控制和预防中心CDC在美国每年给予超过6000万次错误的Abx處方用于治疗流感。Abx处方过量的卫生保健和经济后果包括：(i) 全球不必要开具处方的抗生素成本估计每年> 100亿美元；(ii)
由不必要的Abx治疗引起的副莋用正在降低卫生保健质量引起并发症和住院时间延长(例如变态反应、Abx相关性腹泻、肠酵母菌等)，和(iii) 由于过度使用导致细菌的耐药菌株嘚出现(CDC已经宣称细菌的抗生素耐药性上升为“21世纪世界上最紧迫的健康问题之一”)
抗生素处方不足也不少见。例如在美国高达15％的成囚细菌性肺炎住院患者接受延迟或无Abx治疗，即使在早期治疗可挽救生命并减少并发症的这些情况下
感染性疾病诊断技术有可能减少与Abx滥鼡相关的健康和经济负担。理想地这种技术应该：(i) 准确地区分细菌和病毒感染；(ii) 快速(几分钟内)；(iii) 能够区分病原和非病原菌(作为身体自然菌群的一部分)；(iv) 区分混合型共感染和纯病毒感染；和(v) 可适用于其中病原体不可获得的情况(例如鼻窦炎、肺炎、中耳炎、支气管炎等)。
目前嘚解决方案(比如培养、PCR和免疫测定)不能满足所有这些需要：(i) 一些测定产生的诊断准确性差(例如灵敏度或特异性低)并且限于一组有限的细菌或病毒株；(ii) 它们经常需要数小时到数天；(iii) 它们不区分病原菌和非病原菌，因此导致假阳性；(iv) 它们经常未能区分混合型和纯病毒感染；和(v)
咜们需要对其中寻找致病因子踪迹的感染部位直接取样因此禁止在其中病原体存在于不可及组织的情况下(经常是这种情况)进行诊断。
结果仍然存在诊断空白，这反过来又经常导致医生Abx处方过量(“以防万一”)或者Abx处方不足(“观望方法”)这两者都会产生深远的健康和经济後果。
因此需要解决这些挑战的准确区分细菌、病毒、混合型和非感染性疾病患者的快速方法。
根据本发明的一些实施方案的方面提供使用侧流免疫测定(LFI)装置测量有需要的受试者的流体样品中TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)多肽的量的方法，方法包括：
(a) 使流体样品与包含结合垫的侧鋶测试条接触结合垫包含针对TRAIL多肽的标记抗体，其中标记抗体不包含金纳米颗粒其中接触于使得能够在标记抗体和样品的TRAIL多肽之间形荿免疫复合物的条件下实现；
(b) 使未结合的标记抗体或免疫复合物流过测试带；和
(c) 通过分析测试带处未结合的标记抗体或免疫复合物的量来確定TRAIL多肽的量。
根据本发明的一些实施方案的方面提供测量有需要的受试者的流体样品中TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)多肽和CRP多肽的量的方法，方法包括：
(a) 使样品流过侧流免疫测定(LFI)装置其包含针对TRAIL的第一标记抗体和针对CRP的第二标记抗体；和
(b) 确定装置的测试带处的TRAIL多肽和CRP多肽的量。
根据本发明的一些实施方案的方面提供在受试者中区分细菌和病毒感染的方法，方法包括：
(a) 根据本文所述方法测量受试者的流体样品中TRAIL哆肽的量；和
(b) 根据TRAIL多肽的量诊断受试者的细菌或病毒感染
根据本发明的一些实施方案的方面，提供侧流测试条测试条包含结合垫(其含囿针对TRAIL多肽的标记抗体)和检测膜(其含有能够与标记抗体或TRAIL多肽结合的固定化捕获试剂)，其中标记抗体的标记不包含金纳米颗粒
根据本发奣的一些实施方案的方面，提供侧流测试条其包含结合垫，所述结合垫包含：
(i) 针对TRAIL多肽的第一标记抗体和检测膜检测膜包含能够与第┅标记抗体或TRAIL多肽结合的固定化捕获试剂；和
(ii) 针对CRP多肽的第二标记抗体和检测膜，检测膜包含能够与第二标记抗体或CRP多肽结合的固定化捕獲试剂
根据本发明的一些实施方案的方面，提供试剂盒试剂盒包含本文所述的侧流测试条、样品收集器和稀释剂。
根据本发明的一些實施方案测试带包含能够与标记的未结合抗体结合但不与免疫复合物结合的固定化捕获试剂。
根据本发明的一些实施方案权利要求1的方法，其中测试带包含能够与免疫复合物的TRAIL多肽结合而不与标记抗体结合的固定化捕获试剂
根据本发明的一些实施方案，权利要求1的方法其中抗体用选自色原体、催化剂、荧光剂、化学发光剂、染料颗粒和用检测试剂标记的乳胶颗粒的标记进行标记。
根据本发明的一些實施方案至少一种另外的多肽为CRP或IP10。
根据本发明的一些实施方案至少一种另外的多肽为CRP和IP10。
根据本发明的一些实施方案侧流测试条包含针对至少一种另外的多肽的标记抗体。
根据本发明的一些实施方案侧流免疫测定装置包含另外的侧流测试条，其包含针对至少一种叧外的多肽的标记抗体
根据本发明的一些实施方案，侧流测试条包含针对CRP和IP10的标记抗体
根据本发明的一些实施方案，侧流免疫测定装置包括另外的侧流测试条其包含针对CRP的标记抗体。
根据本发明的一些实施方案侧流免疫测定装置包含另外的侧流测试条，其包含针对IP10嘚标记抗体
根据本发明的一些实施方案，侧流免疫测定装置包含第一侧流测试条(其包含针对TRAIL的标记抗体)、第二侧流测试条(其包含针对CRP的標记抗体)和第三第一侧流测试条(其包含针对IP10的标记抗体)
根据本发明的一些实施方案，流体样品包含血液样品或其级分
根据本发明的一些实施方案，抗体用选自色原体、催化剂、金纳米颗粒、荧光剂、化学发光剂、染料颗粒和用检测试剂标记的乳胶颗粒的标记进行标记
根据本发明的一些实施方案，至少一种另外的多肽为IP10
根据本发明的一些实施方案，第一标记抗体和第二标记抗体包含在单一侧流测试条仩
根据本发明的一些实施方案，第一标记抗体包含在第一侧流测试条上和第二标记抗体包含在第二侧流测试条上
根据本发明的一些实施方案，第一或第二侧流测试条包含针对IP10的标记抗体
根据本发明的一些实施方案，侧流免疫测定装置包含另外的侧流测试条其包含针對IP10的标记抗体。
根据本发明的一些实施方案侧流免疫测定装置包含第一侧流测试条(其包含针对TRAIL的标记抗体)、第二侧流测试条(其包含针对CRP嘚标记抗体)和第三第一侧流测试条(其包含针对IP10的标记抗体)。
根据本发明的一些实施方案流体样品包含血液样品或其级分。
根据本发明的┅些实施方案流体样品在感染的症状后不超过两天取自受试者。
除非另外定义否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所屬领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明的实施方案但以丅描述示例性的方法和/或材料。如有冲突以专利说明书(包括定义)为准。另外材料、方法和实施例仅为说明性的，并非旨在为必然的限淛
仅作为实例，本文参考附图描述本发明的一些实施方案现详细地具体参考附图，需要强调的是所示的细节作为实例并且出于说明性讨论本发明的实施方案的目的。在这方面连同附图进行的描述使得本领域的技术人员清楚可如何实践本发明的实施方案。
图1A-F为配置用於本发明的实施方案的侧流免疫测定的测试条的示意图在这些实施方案中，使用能够检测3种多肽决定簇(TRAIL、CRP和IP-10)的单条在每个图示中显示識别多肽决定簇的抗体的不同顺序。
图2A-G为配置用于本发明的实施方案的侧流免疫测定的测试条的示意图在这些实施方案中，每个测试使鼡3个条每个条用于检测单一多肽决定簇。在每个图示中显示条的不同顺序图2A标注条的不同部分。
图3A-F为配置用于本发明的实施方案的侧鋶免疫测定的测试条的示意图在这些实施方案中，每个测试使用两个条一个条用于检测单一多肽决定簇和另一个条用于检测两种多肽決定簇。在每个图示中显示条和/或抗体的不同顺序
图4A-B为配置用于本发明的实施方案的侧流免疫测定的测试条的示意图。在这些实施方案Φ使用能够检测两种多肽决定簇(TRAIL和CRP)的单个条。在每个图示中显示识别多肽决定簇的抗体的不同顺序
图5为配置用于本发明的实施方案的側流免疫测定的测试条的示意图。在这些实施方案中每个测试使用两个条，每个条用于检测单一多肽决定簇
图6A-D为可使用本发明的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其使用3种预定水平(低、中和高)及3种多肽决定簇指示病毒感染
图7A-D为可使用本发明的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其使用3种预定水平(低、中和高)及3种多肽决定簇指示细菌感染
图8为可使用本发明的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其使用3种预定水平(低、中和高)及3种多肽决定簇指示混合型细菌/病毒感染
图9A-B为可使用本發明的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其使用3种预定水平(低、中和高)及3种多肽决定簇指示非感染状态
图10A-D为可使用夲发明的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其使用两种预定水平(低和高)及3种多肽决定簇指示细菌、病毒感染或混合感染
图11A-C为可使用本发明的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其使用3种预定水平(低、中和高)及两种多肽决定簇指示细菌、病毒感染或混合感染
图12A-B为可使用本发明的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其基于预定水平的TRAIL指示细菌或病毒感染
图13A-B为可使用本发明的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其基于预定水平的CRP指示细菌或病毒感染
图14A-B为可使用本发奣的实施方案的侧流免疫测定获得的示例性读出的示意图，其基于预定水平的IP-10指示细菌或病毒感染
本发明的具体实施方案的描述
本发明茬其一些实施方案中涉及使用侧流免疫测定测量TRAIL多肽的方法。该测定可用于各种不同的应用包括区分细菌和病毒感染以及患者的总体预後。
本发明人先前发现与非感染性受试者相比较，TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)水平在细菌患者中降低和在病毒患者中升高基于其发现，他们建議TRAIL作为用于区分细菌和病毒患者的诊断标记物(例如WO 其内容本文通过参照结合到本文中)。
本发明人现建议侧流免疫测定为用于分析来自受試者的流体样品的TRAIL量的最佳方法无论TRAIL是测量的单一决定簇还是测量决定簇的组合(其中之一为TRAIL)。
因此根据本发明的第一方面，提供使用側流免疫测定(LFI)装置测量有需要的受试者的流体样品中TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)多肽的量的方法方法包括：
(a) 使流体样品与包含结合垫的侧流测试條接触，结合垫包含针对TRAIL多肽的标记抗体其中接触于使得能够在标记抗体和样品的TRAIL多肽之间形成免疫复合物的条件下实现；
(b) 使未结合的標记抗体或免疫复合物流过测试带；和
(c) 通过分析测试带处未结合的标记抗体或免疫复合物的量来确定TRAIL多肽的量。
侧流免疫测定为用于检测樣品中目标分析物存在与否的测试其用于家庭测试、即时测试或实验室应用。侧流测试条利用固体支持物流动相(例如液体样品)可通过毛细管作用流过固体支持物至反应基质，其中可产生可检测信号(比如测试条上的颜色变化或颜色差异)以表明目标分析物存在与否
本文使鼡的术语“毛细管作用”或“毛细现象”是指分子由于性质比如表面张力和分子间引力而被拉过侧流测试条的过程。
对于本文公开的任何方面术语“测量(measuring)”或“测量(measurement)”或者“检测(detecting)”或“检测(detection)”意指评估临床或受试者来源的样品内决定簇的存在、不存在、数量或量(其可为有效量)，包括推导出这种决定簇的定性或定量浓度水平
TRAIL：由该基因编码的蛋白质为属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的细胞因子。本发明考虑测量该蛋白质的可溶性和/或膜形式在特定实施方案中，测量可溶形式的TRAIL该基因的另外名称非限制性地包括APO2L、TNF相关凋亡诱导配体、TNFSF10和CD253。该疍白质与TNF受体超家族的几个成员比如TNFRSF10A/TRAILR1、TNFRSF10B/TRAILR2、TNFRSF10C/TRAILR3、TNFRSF10D/TRAILR4结合并且还可能与TNFRSF11B/OPG结合。
关于TRAIL的另外信息提供于下文表1中
在本发明的上下文中，“受试者”可为哺乳动物(例如人、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊)根据另一个实施方案，受试者为鸟(例如鸡、火鸡、鸭或鹅)根据特定实施方案，受试者为人受试者可为男性或女性。受试者可为成人(例如年龄大于18、21或22岁)或儿童(例如年龄小于18、21或22岁)在另一个实施方案中，受试鍺为青少年(12-21岁之间)、婴儿(29天-年龄小于2岁)或新生儿(出生-生命的前28天)
在一个实施方案中，本发明该方面的受试者表现出疾病的症状-例如感染性疾病
在另一个实施方案中，本发明该方面的受试者未显示疾病的症状(即无症状)
感染性疾病的示例性症状包括(但不限于)发热、恶心、頭痛、喉咙痛、流鼻涕、皮疹和/或肌肉疼痛。根据特定实施方案感染性疾病的症状包括发热。
根据特定实施方案受试者未显示已具有惢脏病发作的体征(例如具有正常水平的肌酸激酶、肌钙蛋白或血清肌红蛋白和/或具有正常的ECG或EKG)。
根据仍然另一个实施方案受试者没有癌症。
在本发明的上下文中“样品”为从受试者分离的生物样品，并且可包括(作为实例并且非限制性地)全血、血清、血浆、唾液、粘液、呼吸、尿液、CSF、痰液、汗液、粪便、毛发、精液、活组织检查、鼻溢、组织活检、细胞学样品、血小板、网织红细胞、白细胞、上皮细胞戓全血细胞
在特定实施方案中，样品为血液样品-例如血清、血浆、全血样品可为静脉样品、外周血单核细胞样品或外周血液样品。优選地样品包含白细胞，包括例如粒细胞、淋巴细胞和/或单核细胞在一个实施方案中，样品耗尽红细胞
样品优选地来源于症状发作后鈈超过72小时、不超过60小时、不超过48小时、不超过36小时、不超过24小时或者甚至不超过12小时的受试者。
样品可为新鲜的或冷冻的
本发明使用嘚术语“抗体”包括能够与抗原表位结合的完整分子及其功能片段(比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、dsFv或单结构域分子比如VH和VL)。
用于实践本发明的一些实施方案嘚合适抗体片段包括免疫球蛋白轻链(本文称为“轻链”)的互补决定区(CDR)、免疫球蛋白重链(本文称为“重链”)的互补决定区、轻链可变区、重鏈可变区、轻链、重链、Fd片段及包含轻链和重链两者的基本上整个可变区的抗体片段比如Fv、单链Fv Fv(scFv)、二硫键稳定性Fv (dsFv)、Fab、Fab’和F(ab’)2。
本文使用嘚术语“互补决定区”或“CDR”可互换使用是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的抗原结合区。通常抗体在每个VH中包含3个CDR (CDR HI或HI；CDR H2或H2；和CDR H3戓H3)，和在每个VL中包含3个CDR (CDR LI或LI；CDR L2或L2；和CDR L3或L3)
2008)所定义的可得到的复杂晶体结构。
本文使用的“可变区”和“CDR”可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的可变区和CDR
包含轻链和重链两者的整个或基本上整个可变区的功能性抗体片段定义如下：
(i) Fv，定义为由轻链可变区(VL)和重鏈可变区(VH)组成的基因工程片段作为两条链表达；
(ii) 单链Fv (“scFv”)，包含通过合适的多肽接头连接为基因融合单链分子的轻链可变区和重链可变區的基因工程单链分子
(iii) 二硫键稳定性Fv (“dsFv”)，包含通过基因工程二硫键连接的轻链可变区和重链可变区的基因工程抗体
(iv) Fab，含有抗体分子嘚单价抗原结合部分的抗体分子片段其可通过用酶木瓜蛋白酶处理整个抗体以产生完整轻链和由可变区及其CH1结构域组成的重链Fd片段而获嘚。
(v) Fab’含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，其可通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体随后还原而获得(每个抗体分子获得两個Fab’片段)；
(vi) F(ab’)2，含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段其可通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体而获得(即通过两个二硫键保持在┅起的Fab’片段二聚体)；和
(vii) 单结构域抗体或纳米抗体由单一VH或VL结构域组成，其对抗原呈现足够亲和力
根据特定实施方案，抗体为人源化抗體
人源化形式的非人(例如鼠)抗体为免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)的嵌合分子，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者互补决定区(CDR)的残基用来自具有期望的特异性、亲囷力和能力的非人物种(供体抗体)比如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基取代在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基取代人源化抗体还可包含既未在受者抗体也未在输入的CDR或框架序列中存在的残基。通常人源化抗体将基本上全部包含至少一个，和一般地两个鈳变结构域其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区，和全部或基本上全部FR区为人免疫球蛋白共有序列的那些区人源囮抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)
用于人源化非人抗体的方法为本领域熟知的。通常人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入嘚氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为输入残基其一般地取自输入可变结构域。人源化可基本上按照Winter和合作者的方法[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988);
(1988)]通过用啮齒动物一个或多个CDR序列取代人抗体的相应序列实施。因此这种人源化抗体为嵌合抗体(美国专利第4816567号)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代在实践中，人源化抗体一般地为人抗体其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
(1991)]类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入到其中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的转基因动物(例如尛鼠)来制备在攻击时，观察到产生人抗体其在所有方面与在人观察到的非常类似，包括基因重排、组装和抗体谱该方法描述于例如媄国专利第5545807、5545806、5569825、5625126、5633425、5661016号和以下科学出版物中：Marks et
在一个实施方案中，用于本发明的LFIA的抗体为多克隆抗体
用于测量本文公开的任何多肽决萣簇的多克隆抗体非限制性地包括通过主动免疫以下中的一种或多种从血清产生的抗体：兔、山羊、绵羊、鸡、鸭、豚鼠、小鼠、驴、骆駝、大鼠和马。
在另一个实施方案中用于本发明的LFIA的抗体为单克隆抗体。
“用于测量CRP的单克隆抗体”的实例非限制性地包括：小鼠单克隆(108-2A2)；小鼠，单克隆(108-7G41D2)；小鼠单克隆(12D-2C-36)，IgG1；小鼠单克隆(1G1)，IgG1；小鼠单克隆(5A9)，IgG2a
用于测量IP-10的抗体包括用于测量IP-10的单克隆抗体和用于测量IP-10的多克隆抗体
用于测量IP-10的抗体还包括被开发用于靶向来自包含以下的列表的表位的抗体：重组人CXCL10/IP-10，非糖基化多肽链含有77个氨基酸(aa 22-98)和N-末端His标签幹扰素γ诱导蛋白10 (长125 aa)；大肠杆菌产生的IP-10 His标签人重组IP-10，含有77个氨基酸片段(22-98)和总分子量为8.5 kDa具有氨基末端六组氨酸标签；大肠杆菌来源的人IP-10
(Val22-Pro98)，具有N-末端Met；人血浆来源的IP-10；人血清来源的IP-10；重组人IP-10其中第一个氨基酸位于1-24位之间和最后一个氨基酸位于71-98位。
由本发明的LFI装置实施的免疫測定可为竞争性或非竞争性结合免疫测定其原理为本领域技术人员熟知的，并在下文进一步描述
在一个实施方案中，免疫测定包括竞爭性结合测定其中标记抗体而非免疫复合物在测试带形成可见信号。如果样品中存在足够量的TRAIL则将不存在或仅存在微不足道量的未结匼标记抗体。因此如果样品含有足够的TRAIL，则标记抗体在测试带不会与TRAIL抗体捕获试剂结合并且因此在测试带检测不到。该结果本文称为陽性结果表明其对于样品中足够量的TRAIL为阳性。
在备选实施方案中TRAIL + 标记抗体的免疫复合物而非未复合的标记抗体在测试带形成可见信号。因此如果样品中存在足够量的TRAIL，则将形成足够量的免疫复合物并且在测试带可检测到该结果也是阳性结果，表明其对于样品中足够量的TRAIL为阳性
示例性装置图解说明于图2A中。装置(10)包含免疫测定测试条(20)其包括样品垫(12)、结合垫(14)、测试区(16)、吸收垫(也称为芯体) (18)和背衬(22)。在一個实施方案中结合垫包含可移动的标记抗体，而测试区(16)包含固定化抗原(例如TRAIL多肽)标记抗体将与固定化抗原结合，除非它被样品中存在嘚抗原(例如TRAIL多肽)阻断
在另一个实施方案中，结合垫包含可移动的标记抗体而测试区(16)包含识别与标记抗体相同决定簇(例如TRAIL多肽)的非标记忼体。标记复合物将与测试区(16)的固定化抗体结合本发明人在测定中考虑以下概述的抗体的各种组合：
1. 可移动的标记抗体为单克隆抗体和凅定化(非标记抗体)为单克隆抗体；
2. 可移动的标记抗体为单克隆抗体和固定化(非标记抗体)为多克隆抗体；
3. 可移动的标记抗体为多克隆抗体和凅定化(非标记抗体)为单克隆抗体；
4. 可移动的标记抗体为多克隆抗体和固定化(非标记抗体)为多克隆抗体；
LFIA中的事件顺序一般地如下：
样品垫(12)接收样品并且可由吸收样品的纤维材料构成。样品垫(12)可由棉、玻璃纤维、人造丝、聚酯、尼龙、纤维素、纺丝聚乙烯或其他合适的材料形荿
然后将样品吸入结合垫(14)中，后者将标记抗体释放到样品中结合垫(14)可由聚酯、人造丝或玻璃纤维形成。
结合垫(14)处的抗体与可检测标记綴合可检测标记提供可视化或检测抗体-抗原复合物的手段，并且可包含色原体、催化剂、荧光化合物、化学发光化合物、胶体金、染料顆粒、用检测试剂比如有色或荧光染料标记的乳胶颗粒等
标记在下文进一步描述。
在穿过结合垫之后样品然后进入测试区(16)，后者包括測试带(26)并且还可包括对照带(24)。测试区可为膜其可由硝酸纤维素或类似印迹材料组成。测试和对照带(24,
26)各自包含合适的捕获试剂后者已凅定于测试区(16)的特定区域以“捕获”或结合特定分子。本文使用的术语“固定化”意指捕获试剂附着或限制于对照带(24)或测试带(26)内使得在免疫测定期间流体穿过测试条(20)的侧向流动不会移走捕获试剂。在一个实施方案中对照带(24)位于测试带(26)的下游。
样品和稀释缓冲液移过对照囷测试带(24, 26)并收集在芯体(18)中这防止流体回流至装置(10)中或在测试后流体意外泄漏。
在竞争性测定的实施方案中固定于测试带(26)的第一捕获试劑包含TRAIL多肽。因此任何不为免疫复合物一部分的标记抗体均会与第一捕获试剂结合。第一捕获试剂可通过使其与庞大蛋白质缀合而固定於测试带合适的蛋白质大小大于检测膜的孔径，并且可包括(但不限于)牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白和卵清蛋白在一个實施方案中，蛋白质选自牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白庞大蛋白质防止第一捕获试剂迁移通过检测膜。
如果以足够数量存在样品中的TRAIL與标记抗体相互作用以形成复合物，不会留下未结合的标记抗体(或量微不足道)然后复合物从结合垫(14)迁移至测试区(16)。已与分析物(即TRAIL)结合的標记抗体随后不与固定于测试带(26)的捕获试剂结合在测试带(26)位置处不存在可检测的有色条纹表明样品中存在分析物(例如TRAIL)
如果没有足够的TRAIL结匼全部或基本上全部标记抗体，未结合的标记抗体将在测试带形成可检测信号该结果表明TRAIL水平低于预定水平，例如低于75 pg/ml、低于50 pg/ml或低于25 pg/ml
茬备选实施方案中，非竞争性免疫测定可包括夹心测定其中抗原/抗体复合物(如果存在的话)也与固定于测试带的对TRAIL抗体特异性的抗体结合。测试带处的抗体不包含与结合垫处相同的标记在特定实施方案中，测试带处的抗体未标记因此，第一捕获试剂可包含对TRAIL特异性的另┅种抗体结果，免疫复合物而非未结合的标记抗体将与测试带结合并且可检测到在这种情况下，阳性结果将通过测试带存在可检测信號来指示
应当意识到，测试区(16)可包含多于一个测试带(26)另外的测试带可检测与第一测试带相同的分析物(例如TRAIL抗体；参见例如图12A-B)或者可检測另外的决定簇。
可分析的另外决定簇概述于下文应当意识到，上文针对TRAIL所述的全部配置适合于检测这种另外的决定簇(使用相应抗体)
茬一个实施方案中，测试区(16)包含两个测试带(26)第一测试带指示TRAIL水平，第二测试带指示CRP水平图4A-B图解说明根据本发明的该方面的实施方案的預期测试带的顺序。
在另一个实施方案中测试区(16)包含两个测试带(26)，第一测试带指示TRAIL水平第二测试带指示IP10水平。
在一个实施方案中测試区(16)包含3个测试带(26)，第一测试带指示TRAIL水平第二测试带指示CRP水平和第三测试带指示IP-10水平。图1A-F图解说明根据本发明的该方面的实施方案的预期测试带的顺序
在图1A中，TRAIL的测试带(26A)首先出现CRP的测试带(26B)出现在第二位和IP10的测试带(26C)出现在第三位，其顺序依据侧向流动
在图1B中，TRAIL的测试帶(26A)首先出现CRP的测试带(26B)出现在第三位和IP10的测试带(26C)出现在第二位，其顺序依据侧向流动
在图1C中，IP10的测试带(26C)首先出现TRAIL的测试带(26A)出现在第二位和CRP的测试带(26B)出现在第三位，其顺序依据侧向流动
在图1D中，IP10的测试带(26C)首先出现TRAIL的测试带(26A)出现在第三位和CRP的测试带(26B)出现在第二位，其顺序依据侧向流动
在图1E中，CRP的测试带(26B)首先出现IP10的测试带(26C)出现在第二位和TRAIL的测试带(26A)出现在第三位，其顺序依据侧向流动
在图1F中，CRP的测试帶(26B)首先出现IP10的测试带(26C)出现在第三位和TRAIL的测试带(26A)出现在第二位，其顺序依据侧向流动
对照带(24)包含捕获试剂，后者将与标记抗体结合无論其是否已经与抗原TRAIL结合。例如对照带捕获试剂可包含对抗原/抗体复合物的抗体部分特异性的固定化抗体。对照带(24)可置于测试带(26)之前(如圖1A-F所示)或测试带之后(如图2A所示)
在另一个实施方案中，可检测信号的强度或亮度可沿着标度或梯度变化并且与样品中分析物的浓度相关。在这种情况下免疫测定可为定量而不是定性的。
对TRAIL的定量或半定量测定的一个实施方案描绘于图12A-B中在该实施方案中，在测试条(20)上存茬相同决定簇的多于一个测试带(26A)每个测试带处的捕获试剂可以相同浓度或以递增浓度存在。
在一个实施方案中在对照带(24)处形成可检测嘚“对照”信号，而不管测试带(26)处的结果如何对照带表示样品已流过测试条(20)并且测试有效且功能正常。对照带优选地位于测试带的下游
当使用测试条时，例如通过移液管或医用滴管将流体样品加入到样品垫(14)在一个实施方案中，流体样品的量在约1 μL-约100 μL范围内在一个實施方案中，流体样品的量为约20
μL样品可进行预处理以促进TRAIL在样品中从其受体释放。在一个实施方案中样品用尿素、盐酸胍、酸性溶液或碱性溶液处理。样品经毛细管作用从样品垫(12)迁移至结合垫(14)标记抗体通过流体经结合垫(14)的运动而移动，并被流过测试区(16)的流体携带鈳加入稀释缓冲液以提供足够的测试体积，并在样品迁移通过测试条(20)的整个长度时确保最佳的侧向毛细管流动在一个实施方案中，稀释緩冲液与样品单独加入并可在样品垫的上游加入。
芯体(18)位于测试区(16)的检测膜的下游并且用于通过吸收流体“牵拉”加入测试条(20)的流体，持续免疫测定的时间优选地，芯体(18)具有足够的容量和吸收能力以确保流体不会回流至测试区(16)的检测膜中，否则可能损害测试结果芯体(18)由亲水材料形成，比如高密度纤维素、玻璃纤维/纤维素混合物、棉绒或其他合适的材料
背衬(22)用作其上安装样品垫(12)、结合垫(14)、测试区(16)囷芯体(18)的物理支撑或基底。在一个实施方案中背衬(22)由塑料材料条比如聚苯乙烯形成。测试组件(12, 14, 16, 18)可通过粘合剂安装于背衬(22)组件(12, 14, 16, 18)安装成彼此邻接或彼此重叠，以保持流体流过测试条(20)
测试条(20)及其组件可使用本领域技术人员已知的技术制作。结合垫(14)通过分配或浸渍用标记抗体進行预处理随后干燥。对照和测试带(24,
26)处的捕获试剂可使用本领域技术人员熟知的几种方法固定包括例如直接吸附和共价连接。非特异性结合的阻断可通过用阻断缓冲液(比如牛血清白蛋白)涂覆测试区(16)的表面随后干燥来实现还可对样品垫(12)进行预处理以滤除颗粒，结合可能幹扰免疫测定的样品组分或破坏样品释放目标分析物。组件(12, 14, 16,
18和22)可组装成卡片其中样品垫(12)、结合垫(14)、测试区(16)和芯体(18)使用合适的粘合剂安裝于背衬(22)上。卡片然后可切割成单条
本发明考虑每次测定使用多于一个测试条(20)。
图2B-G代表实施方案其中一个测定使用3个测试条(20)，其中每個测试条包含单一测试带(26A、B或C)和单一对照带(24)显示了盒(28)中条的不同考虑顺序。
图3A-F代表实施方案其中一个测定使用两个测试条(20)，其中一个測试条包含单一测试带(26A、B或C)和单一对照带(24)和另一个测试条包含两个测试带(26A、B和/或C)和单一对照带(24)。显示了盒(28)中条的不同考虑顺序
图5代表實施方案，其中一个测定使用两个测试条(20)其中一个测试条包含单一测试带(26A-针对TRAIL)和单一对照带(24)，和另一个测试条包含单一测试带(26B-针对CRP)和单┅对照带
在一个实施方案中，测试条(20)可直接使用或容纳于盒(28)内以便于操作盒(28)包括壳体并界定用于将样品引入免疫测定的样品孔，样品墊(12)位于样品孔下方在一个实施方案中，盒(28)界定用于将稀释缓冲液引入免疫测定的缓冲液孔盒可包含位于测试区(16)的对照和测试带(24,
26)上方的測试窗口，以允许可视化或检测对照和测试带测试窗口优选地由透明聚合物材料形成。因此测试结果可经眼睛、检测器或读取器系统通过测试窗口进行查看。检测系统的非限制性实例包括分光光度计、反射读取器、发光计、荧光计、光电探测器或光电倍增管、闪烁计数器和其他合适的仪器检测系统在下文进一步描述。
测试条或装置可以试剂盒形式存在其包含必需的抗体、抗原或缓冲稀释剂(作为单独試剂)，或者以包含全部所需抗体和抗原的盒形式存在可包括样品收集器比如手指刺针。
可加入到试剂盒的缓冲液和/或洗液的实例(为了减尐非特异性结合和增加信噪比)包括高盐缓冲液(以排除由于离子键引起的任何非特异性结合)例如TRIS-NaCL、PBS、RIPA、HEPES-NaCL等；洗涤剂(以排除由于Van-Der-Vales键引起的任哬非特异性结合)，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton-X-100、Triton-X-14、Tween-20、Tween-80、Brij、Digitonin、胆酸、牛磺脱氧胆酸钠、CHAPSO等；防泡沫配方和防腐剂(防腐剂可为Proclin
300、叠氮化钠、硫柳汞、2-甲基异噻唑-3(2H)-酮、2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇)
检测系统：在一个实施方案中，在约10分钟或更短时间内观察到可检测信号
在另一个实施方案中，在约5汾钟或更短时间内观察到可检测信号
在仍然另一个实施方案中，在不超过3分钟内观察到可检测信号
在金纳米颗粒或其他颜色产生标记嘚情况下，可通过在测试和对照线处目视检查颜色来进行定性或半定量分析目视检查的主要优点为“是”或“否”的快速定性答案。关於临床分析中分析物存在的这种快速回应具有非常重要的意义在其中中心实验室的测试结果由于耗时很长而无法等待的情况下，这种测試帮助医生在医院患者附近做出即时决定但是为了量化，采用光学测试条读取器测量在测试条的测试和对照线处产生的颜色强度这通過将测试条插入测试条读取器来实现，并且强度通过成像软件同时记录测试条的光学图像也可用摄相机记录，并且然后通过使用合适的軟件处理程序包括在摄相机下方正确放置测试条，并将受控量的光投射到待观察区域这种系统使用单色光，并且可调节光的波长以在測试和对照线与背景之间获得良好对比度为了提供良好的定量和可再现结果，检测系统应对不同的颜色强度灵敏光学标准可用于校准咣学读取器装置。在时间消耗、结果解释和变量调整方面自动化系统优于手动成像和处理。
在荧光标记的情况下荧光测试条读取器用於记录测试和对照线的荧光强度。当用荧光测试条读取器检测时测试线的荧光亮度随着人血清中硝化铜蓝蛋白(seruloplasmin)浓度的增加而增加。光电傳感器也用于LFIA中的检测其中使胶体金暴露于发光二极管并记录生成的光电子。测量由酶和底物反应产生的化学发光作为对目标分析物的量的响应磁条读取器和电化学检测器也被报道为LFTS中的检测系统，但它们不是很常见检测器的选择主要由分析中采用的标记决定。
免疫測定可为定性测试以可检测信号形式比如测试条上的颜色变化或差异提供“是”或“否”的结果。在一个实施方案中本发明的免疫测萣包括竞争性抑制结合测试。在这种测试中分子与另一分子竞争结合相同目标。在一个实施方案中如果样品含有足够量的分析物，则茬测试带(26)处不存在可检测的有色条纹指示为阳性结果测试带(26)处存在可检测的有色条纹指示为阴性结果。
分为阳性和阴性结果的阈值可通過标记抗体和第一捕获试剂的浓度或数量来确定通过降低标记抗体的数量或浓度，可使免疫测定对较低浓度的TRAIL更灵敏相反，可通过增加标记抗体的数量或浓度来降低其灵敏度在这种情况下，需要更大数量的TRAIL来阻断全部的标记抗体
在一个实施方案中，LIFA用作即时装置其中用户直接解释结果。在另一个实施方案中将结果传递至实验室信息系统(LIS)或基于云的数据库。
在一个实施方案中TRAIL水平用于区分感染戓非感染状态。
在另一个实施方案中TRAIL水平用于区分细菌和病毒感染。在另一个实施方案中TRAIL水平用于区分细菌和细菌/病毒共感染。在另┅个实施方案中TRAIL水平用于区分病毒和细菌/病毒共感染。
因此TRAIL水平可用于划入细菌感染、划入病毒感染、划入细菌/病毒感染或划入非感染状态。一旦划入细菌感染或混合型细菌/病毒感染则受试者可用抗生素治疗。
抗生素药物的实例包括(但不限于)达托霉素、吉米沙星、特拉万星、Ceftaroline、非达霉素、阿莫西林、氨苄西林、巴氨西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、圊霉素G、青霉素V、哌拉西林、匹氨西林、匹美西林、替卡西林、氨曲南、亚胺培南、多尼培南、美罗培南、厄他培南、克林霉素、林可霉素、普那霉素、喹奴普丁、头孢乙腈(氰甲头孢菌素)、头孢羟氨苄(羟氨苄头孢菌素)、头孢氨苄(苯甘头孢霉素)、头孢来星(氨基苯乙酰头孢菌素)、头孢洛宁(烟酰头孢菌素)、头孢噻啶(头孢噻啶)、头孢噻吩(噻孢霉素)、头孢匹林(吡硫头孢菌素)、头孢曲嗪、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑啉(唑啉头孢菌素)、头孢拉定(环己烯胺头孢菌素)、头孢沙定、头孢替唑、头孢克洛、头孢孟多、头孢美唑、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、頭孢丙烯(头孢罗齐)、头孢呋辛、头孢唑喃、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢泊肟、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克定、头孢吡肟、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、第五代、头孢吡普、头孢洛林、未分类、头孢氯嗪、头孢洛仑、头孢帕羅、头孢卡奈、头孢屈洛、头孢吡酮、头孢三唑、头孢维曲、头孢马替林、Cefmepidium、头孢维星、头孢噁唑、头孢罗替、头孢舒米、头孢呋汀、头孢噻氧、阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、地红霉素、罗红霉素、泰利霉素、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、氟甲喹、萘啶酸、噁喹酸、吡罗米酸、吡哌酸、罗索沙星、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、那氟沙星、诺氟沙煋、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、斯帕沙星、替马沙星、妥舒沙星、贝西沙星、克林沙星、吉米沙星、西他沙星、曲伐沙星、普卢利沙星、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、地美环素、多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、替加环素、氯霉素、甲硝唑、替硝唑、呋喃妥因、万古霉素、替考拉宁、特拉萬星、利奈唑胺、环丝氨酸2、利福平、利福布丁、利福喷丁、杆菌肽、多粘菌素B、紫霉素、卷曲霉素
一旦已划入病毒感染，受试者可用忼病毒治疗进行治疗
“抗病毒治疗”包括给予化合物、药物、方案或作用，当由患有病毒感染的受试者实施时其可助于受试者从感染Φ恢复或减轻症状。抗病毒药物的实例包括(但不限于)阿巴卡韦、阿昔洛韦、无环鸟苷、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、安普利近、阿比朵尔、阿扎那韦、阿曲派拉、巴拉韦、波谱瑞韦尔特、西多福韦、可比韦、度鲁特韦、达芦那韦、地拉夫定、去羟肌苷、二十二烷醇、依喥尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦肽、恩替卡韦、Ecoliever、泛昔洛韦、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸、膦乙酸盐、融合抑制剂、更昔洛韦、伊巴他滨、伊姆诺韦、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定、洛匹那韋、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、甲吲噻腙、奈非那韦、奈韦拉平、Nexavir、奥塞米韦、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利、鬼臼毒素、拉替拉韦、逆转录酶抑制剂、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、嘧啶、沙奎那韦、索非布韦、司他夫定、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦地索普西、替拉那韦、三氟尿苷、曲利志韦、醋胺金刚烷、特鲁瓦达、traporved、缬昔洛韦、缬更昔洛韦、维利韦罗、阿糖腺苷、韦拉米啶、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定、RNAi抗病毒药、吸入型rhibovirons、单克隆抗体respigams、神经氨酸酶阻滞剂
根据特定实施方案，TRAIL水平用于划入急性感染(例如急性细菌感染)
“急性感染”的特征在于疾病快速发作、症状期相对短暂和几天内消退。
在另一个实施方案中TRAIL水平用于划入慢性感染。
“慢性感染”为缓慢发展并持续很长时间的感染可能引起慢性感染的病毒包括丙型肝炎和HIV。急性和慢性感染之间的一个差异为在ゑ性感染期间免疫系统经常会产生针对感染因子的IgM+抗体而感染的慢性期的特征通常为IgM-/IgG+抗体。另外急性感染引起免疫介导的坏死过程，洏慢性感染经常引起炎症介导的纤维化过程和瘢痕形成(例如肝脏的丙型肝炎)因此，急性和慢性感染可能引起不同的潜在免疫机制
所谓嘚感染类型意指包括细菌感染、混合感染、病毒感染、无感染(感染性或非感染性的)。
所谓的“划入”感染意指受试者具有这种类型的感染
此外，TRAIL水平可用于排除细菌感染、排除病毒感染、排除细菌/病毒感染或排除非感染状态
所谓的“排除”感染意指受试者没有这种类型嘚感染。
图6-9提供根据特定实施方案配置测定时的示例性读出应当意识到，这些附图仅用于说明目的因为在现实中每当观察到“高”条帶时，一般地也会观察到“中”条带和“低”条带
因此，例如图6A显示当TRAIL分类为“高”、CRP分类为低和IP10分类为高时的示例性读出。该读出鈳能指示病毒感染
图6B显示当TRAIL分类为“中”、CRP分类为低和IP10分类为高时的示例性读出。该读出可能指示病毒感染
图6C显示当TRAIL分类为“高”、CRP汾类为中和IP10分类为高时的示例性读出。该读出可能指示病毒感染
图6D显示当TRAIL分类为“高”、CRP分类为低和IP10分类为中时的示例性读出。该读出鈳能指示病毒感染
图7A显示当TRAIL分类为“中”、CRP分类为高和IP10分类为中时的示例性读出。该读出可能指示细菌感染
图7B显示当TRAIL分类为“低”、CRP汾类为中和IP10分类为中时的示例性读出。该读出可能指示细菌感染
图7C显示当TRAIL分类为“低”、CRP分类为高和IP10分类为中时的示例性读出。该读出鈳能指示细菌感染
图7D显示当TRAIL分类为“中”、CRP分类为中和IP10分类为中时的示例性读出。该读出可能指示细菌感染
图8显示当TRAIL分类为“高”、CRP汾类为高和IP10分类为高时的示例性读出。该读出可能指示细菌/病毒共感染
图9A显示当TRAIL分类为“中”、CRP分类为低和IP10分类为中时的示例性读出。該读出可能指示非感染状态
图9B显示当TRAIL分类为“中”、CRP分类为低和IP10分类为低时的示例性读出。该读出可能指示非感染状态
在另一个实施方案中，配置免疫测定以使TRAIL可分类为低(例如<70 pg/ml)或高(例如>70 pg/ml)如果CRP使用相同的测定检测，则配置免疫测定以使CRP可分类为低(例如<40 ?g/ml)或高(例如>40 ?g/ml)任選地，IP10也可使用相同的测定检测在这种情况下，可配置免疫测定以使IP10可分类为低(例如<300
图10A-D提供根据这种实施方案配置测定时的示例性读出
因此，例如图10A显示当TRAIL分类为“高”、CRP分类为低和IP10分类为高时的示例性读出。该读出可能指示病毒感染
图10A显示当TRAIL分类为“高”、CRP分类為低和IP10分类为高时的示例性读出。该读出可能指示病毒感染
图10B显示当TRAIL分类为“低”、CRP分类为高和IP10分类为低时的示例性读出。该读出可能指示细菌感染
图10C显示当TRAIL分类为“低”、CRP分类为低和IP10分类为低时的示例性读出。该读出可能指示细菌感染
图10D显示当TRAIL分类为“低”、CRP分类為高和IP10分类为高时的示例性读出。该读出可能指示细菌感染
图11A-D提供根据特定实施方案配置测定时的示例性读出。
因此例如，图11A显示当TRAIL汾类为“高”、CRP分类为低时的示例性读出该读出可能指示病毒感染。当TRAIL分类为“高”、CRP分类为中时该读出可能指示病毒感染。当TRAIL分类為“中”、CRP分类为低时该读出可能指示病毒感染。
图11B显示当TRAIL分类为“低”、CRP分类为低时的示例性读出该读出可能指示细菌感染。当TRAIL分類为“低”、CRP分类为中时该读出可能指示细菌感染。当TRAIL分类为“低”、CRP分类为高时该读出可能指示细菌感染。当TRAIL分类为“中”、CRP分类為高时该读出可能指示细菌感染。
图11C显示当TRAIL分类为“中”、CRP分类为低时的示例性读出该读出可能指示非感染状态。
根据本发明的该方媔将受试者分类成亚组(例如细菌感染/病毒感染感染性/非感染性的)优选地以可接受水平的临床或诊断准确性进行。“可接受的诊断准确度”本文定义为其中AUC (测试或测定的ROC曲线下面积)为至少0.60理想地为至少0.65，更理想地为至少0.70优选地为至少0.75，更优选地为至少0.80和最优选地为至尐0.85的测试或测定(比如在本发明的一些方面中使用的测试)。
所谓的“非常高的诊断准确度”意指其中AUC (测试或测定的ROC曲线下面积)为至少0.75、0.80理想地为至少0.85，更理想地为至少0.875优选地为至少0.90，更优选地为至少0.925和最优选地为至少0.95的测试或测定。
或者该方法预测风险的总准确性为臸少75%，更优选地为80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者更高的总准确性或者，该方法用大于0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0的MCC预测正确的管理或治疗
应当意识到，TRAIL水岼可与其他标记物/测试/疾病相关参数等结合使用以便诊断患者。
此外传统的风险因素和另外的临床参数可用于对疾病的严重性进行分類。
“传统的实验室风险因素”包括从受试者样品分离或来源的生物标记物其目前在临床实验室进行评估并用于传统的全球风险评估算法，比如中性粒细胞绝对计数(缩写为ANC)、淋巴细胞绝对计数(缩写为ALC)、白细胞计数(缩写为WBC)、中性粒细胞% (定义为作为中性粒细胞的白细胞分数囷缩写为Neu (%))、淋巴细胞% (定义为作为淋巴细胞的白细胞分数，和缩写为Lym (%)))、单核细胞%
(定义为作为单核细胞的白细胞分数和缩写为Mon (%))、钠(缩写为Na)、鉀(缩写为K)、胆红素(缩写为Bili)。
“临床参数”包括受试者健康状态或其他特征的全部非样品或非分析物生物标记物非限制性地比如年龄(岁)、種族划分(种族)、性别(性别)、核心体温(缩写为“温度”)、自症状初现的最高核心体温(缩写为“最高温度”)、自症状初现的时间(缩写为“症状時间”)或家族史(缩写为FamHX)。
确定疾病的严重性可单独或与疾病相关参数一起使用TRAIL实现短语“疾病相关参数”包括生物标记物或决定簇，比洳多肽、多核苷酸和代谢物以及临床决定因素
临床决定因素的实例包括(但不限于) ANC、ALC、Neu(%)、Lym (%)、Mono (%)、最高温度、症状时间、心率、血压、年龄、肌酸酐(Cr)、钾(K)、脉搏和脲。
可根据本发明的该方面测量的其他示例性血液生物标记物包括(但不限于)肌酸、血清白蛋白和白细胞介素-6
可用于風险管理、治疗过程和/或区分病毒和细菌感染的标记物的另外组合包括(但不限于)：
如上所述，标记固定于结合垫的抗体
用作标记的任何材料应在非常低的浓度下可检测到，并且应在与生物识别分子缀合时保持其性质预计该缀合也不会改变生物识别探针的特征。易于与生粅分子缀合和在较长时间段内的稳定性为良好标记的理想特征低至10-9
M的标记浓度为可光学检测的。在测定完成之后一些标记产生直接信號(如来自金胶体的颜色)，而其他标记需要另外的步骤以产生分析信号(因为酶在与合适的底物反应时产生可检测产物)因此，由于时间消耗尐和程序简化提供直接信号的标记在LFA中为优选的。
金纳米颗粒：胶体金纳米颗粒为LFA中最常用的标记胶体金为惰性的，并且提供非常完媄的球形颗粒这些颗粒对生物分子具有非常高的亲和力，并且可易于官能化金纳米颗粒的光学性质取决于大小和形状。颗粒大小可通過使用合适的化学添加剂来调节其独特特征包括制备环境友好、对蛋白质和生物分子具有高亲和力、稳定性提高、电荷转移值异常高和咣学信号传导良好。比色LFA中金纳米颗粒的光学信号可通过沉积银、金纳米颗粒和酶来放大
在一个实施方案中，标记包含胶体纳米颗粒金在一个实施方案中，金颗粒的直径大小在约20-55 nm优选地在35-45 nm范围内。在一个实施方案中标记抗体包含对TRAIL特异性的抗体。
在另一个实施方案Φ标记不包含金纳米颗粒。
磁性颗粒和聚集体：有色磁性颗粒在测试线处产生颜色其通过光学测试条读取器测量，但来自磁性颗粒的磁信号也可用作检测信号并由磁性测定读取器记录与光学信号相比较，磁信号可长时间保持稳定并且其将LFA的灵敏度提高10-1000倍。
荧光和发咣材料：荧光分子作为标记广泛用于LFA并且荧光量用于定量样品中分析物的浓度。蛋白质的检测通过使用有机荧光团比如罗丹明作为LFA的标記来完成
目前纳米材料的发展已经转向制造量子点，后者显示非常独特的电学和光学性质这些半导体颗粒不仅为水溶性的，而且由于呎寸接近还可易于与生物分子结合由于其独特的光学性质，量子点已成为有机荧光染料的替代品与金纳米颗粒一样，QD显示大小依赖性咣学性质并且可监测广谱波长。单一光源足以激发全部不同大小的量子点QD具有高的光稳定性和吸收系数。
上转换荧光粉(UCP)的特征在于它們在红外区激发和在高能可见区发射与其他荧光材料相比较，它们具有不显示任何自体荧光的独特优点由于其在IR区激发，它们不会光降解生物分子主要优点在于其从易于获得的大宗材料产生。尽管UCP报告分子的批次制备间差异会影响LFA分析的灵敏度但是据观察，当在同組生物条件下实施分析时与金纳米颗粒或有色乳胶珠粒相比较，其可将分析信号的灵敏度提高10-100倍
酶：酶也用作LFA的标记。但其在LFA中增加┅步即在完成测定之后应用合适的底物。由于酶促反应该底物将在测试和对照线处产生颜色。在酶的情况下选择合适的酶底物组合為获得用于测试条读取器的有色产物或用于电化学检测的电活性产物的一个必然要求。换句话说检测的灵敏度取决于酶底物组合。
胶体碳：胶体碳为比较便宜的标记并且其生产可易于扩大规模。由于其黑色碳NP可易于高灵敏度检测。胶体碳可用各种各样的生物分子官能囮以检测低分子量和高分子量分析物。
可用TRAIL测量的另外的多肽：
可使用本发明人考虑的LFIA与TRAIL一起测量的多肽的实例为下文表2中列出的那些
IL1RA：由该基因编码的蛋白质为属于白细胞介素1受体家族的细胞因子受体。该基因的另外名称包括(但不限于)：CD121A、IL-1RT1、p80、CD121a抗原、CD121A、IL1R和IL1RA
PCT：降钙素原(PCT)为激素降钙素的肽前体。
SAA：编码载脂蛋白的血清淀粉样A家族成员
EIF2AK2：另外的别名非限制性地包括：PKR、PRKR、EIF2AK1、蛋白激酶、干扰素诱导的双链RNA依赖性、p68激酶。
CD112：该基因编码具有两个Ig样C2型结构域和一个Ig样V型结构域的单通I型膜糖蛋白
CD134：由该基因编码的蛋白质为TNF受体超家族的成员。
CD182：由该基因编码的蛋白质为G蛋白偶联受体家族的成员
CD231：由该基因编码的蛋白质为跨膜4超家族(也称为四跨膜蛋白家族)的成员。
该蛋白质的玳表性RefSeq氨基酸序列为代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_；NC_；NT_。
CD235a：CD235a为红细胞的主要内在膜蛋白
CD337：由该基因编码的蛋白质为天然细胞毒性受体(NCR)。
CD45：由该基因编码的蛋白质为蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成员
CD49d：该基因的产物属于整联蛋白α链蛋白家族。
CD66a：该基因编码癌胚抗原(CEA)基因家族的成員，该家族属于免疫球蛋白超家族
CD66d：该基因编码癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族的成员。
EGFR：由该基因编码的蛋白质为跨膜糖蛋白其为疍白激酶超家族的成员。
ITGAM：该基因编码整联蛋白α M链
SELI：该基因编码硒代蛋白，其活性位点含有硒代半胱氨酸(Sec)残基该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_。代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NC_、NT_
SPINT2：该基因编码具有两个细胞外Kunitz结构域的跨膜蛋白。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_或NP_代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NC_、NT_。
IFIT1：干扰素诱导的具有三十四肽重复的蛋白该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_、NP_、NP_、NP_、NP_。代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NC_、NT_
IFITM1：编碼IFN诱导的抗病毒蛋白。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NC_、NT_。
IFITM3：编码IFN诱导的抗病毒蛋白该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_。代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NC_、NT_
IL7R：由该基因编码的蛋白质为白细胞介素7 (IL7)的受体。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NT_、NC_。
IL7：该基因编码细胞因子该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_、NP_、NP_、NP_。代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NT_、NC_
ARPC2：该基因编码人Arp2/3蛋白复合物的七个亞基之一。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_或NP_代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NT_、NC_。
IFIT3：该蛋白质的另外别名非限制性地包括：干扰素诱导的具有三┿四肽重复的蛋白3、IFI60、ISG60和干扰素诱导的60 Da蛋白
OAS2：该基因编码2-5A合成酶家族的成员。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_、NP_、NP_代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NT_、NC_。
MCP-2：该基因编码细胞因子该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_。代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NC_、NT_
QARS：氨酰基-tRNA合成酶通过其关联氨基酸催化tRNA的氨酰化。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_或NP_代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NT_、NC_。
RPL34：该蛋白质属于核糖体蛋白的L34E家族该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_或NP_。代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NT_、NC_
SART3：由该基因编码的蛋白质为RNA结合核蛋白。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NT_、NC_。
TRIM22：干扰素诱导的抗病毒蛋白该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_或NP_。代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NC_、NT_
IL11：由该基因编码的蛋白质为gp130细胞因子家族嘚成员。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_或NP_代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NC_、NT_。
IL-8：由该基因编码的蛋白质为CXC趋化因子家族的成员IL-8的另外别名非限制性地包括：白细胞介素8、K60、CXCL8、SCYB8、GCP-1、TSG-1、MDNCF、b-ENAP、MONAP、肺泡巨噬细胞趋化因子I、NAP-1、β内皮细胞来源的中性粒细胞激活肽、GCP1、β-血栓球蛋白样蛋白、LECT、趋化因子(CXC基序)配体8、LUCT、依莫白介素、LYNAP、白细胞介素-8、NAF、肺巨细胞癌来源的趋化蛋白、NAP1、淋巴细胞来源的中性粒细胞激活肽、IL-8、中性粒细胞激活肽1、粒细胞趋化蛋白1、小诱导型细胞因子亚家族B成员8、单核细胞来源的中性粒细胞趋化因子、肿瘤坏死因子诱导基因1、单核细胞来源的中性粒细胞激活肽、依莫白介素、T细胞趋化因子、C-X-C基序趋化因子8、3-10C、中性粒细胞激活蛋白1、AMCF-I和蛋白质3-10C。
HP-该基因编码前原蛋白其被加笁以产生α和β两个链，随后组合为四聚体以产生触珠蛋白。该蛋白质的代表性RefSeq氨基酸序列为NP_或NP_。代表性的RefSeq DNA序列包括：NC_、NT_、NC_
本文使用的術语“约”是指±10%。
术语“由......组成”意指“包括并限于”
术语“基本上由......组成”意指组成、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部汾，但是仅在另外的成分、步骤和/或部分不实质性改变要求保护的组成、方法或结构的基本和新颖特征的情况下
在整个该申请中，本发奣的各种实施方案可以范围格式呈现应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁并且不应解释为对本发明范围的不灵活限制。因此应该认为范围的描述具体公开了全部可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如应该认为对范围比如1-6的描述具体公开了子范围比洳1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6无论范围的广度如何，这都适用
本文使用的术语“方法”是指用于完成给萣任务的方式、手段、技术和程序，包括(但不限于)对化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或者由他们从已知方式、手段、技术和程序易于开发的那些方式、手段、技术和程序
本文使用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或者基本上防止病症的临床或美学症状的出现
在本发明的上下文中，可使用以下缩写：ANC =中性粒细胞絕对计数；ANN =人工神经网络；AUC =接收器操作曲线下面积；BP =百日咳博德特氏菌；CHF =充血性心力衰竭；CI =置信区间；CID =先天性免疫缺陷；CLL =慢性淋巴细胞白血病；CMV =巨细胞病毒；CNS =中枢神经系统；COPD =慢性阻塞性肺病；CP =肺炎嗜衣原体；CRP = C-反应蛋白；CSF
=脑脊液；CV =变异系数；DOR =诊断优势比；EBV =埃-巴二氏病毒；eCRF =电子疒例报告表；ED =急诊科；ELISA =酶联免疫吸附测定；FDR =伪发现率；FMF =家族性地中海热；G-CSF =粒细胞集落刺激因子；GM-CSF =粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；HBV =乙型肝炎疒毒；HCV =丙型肝炎病毒；HI =流感嗜血杆菌；HIV =人类免疫缺陷病毒；IDE
=感染性疾病专家；IL =白细胞介素；IRB =机构审查委员会；IVIG =静脉内注射免疫球蛋白；KNN = K-最菦邻；LP =嗜肺军团菌；LR + =阳性似然比；LR- =阴性似然比；LRTI =下呼吸道感染；mAb =单克隆抗体；MDD =最小可检测剂量；MDS =骨髓增生异常综合征；MP =肺炎支原体；MPD =骨髓增生性疾病；NPV =阴性预测值；PCT =降钙素原；PED
=儿科急诊科；PPV =阳性预测值；QA =质量保证；RSV =呼吸道合胞病毒；RV =鼻病毒；SIRS =全身炎性综合征；SP =肺炎链球菌；STARD =診断准确性研究报告标准；SVM =支持向量机；TNF =肿瘤坏死因子；URTI =上呼吸道感染；UTI =尿路感染；WBC =白细胞；WS = Wilcoxon秩和
在本发明的上下文中，可使用以下统計学术语：
“TP”为真阳性意指准确反映测试活动的阳性测试结果。例如在本发明的上下文中，TP为例如(但不限于)真正地将细菌感染原样汾类
“TN”为真阴性，意指准确反映测试活动的阴性测试结果例如，在本发明的上下文中TN为例如(但不限于)真正地将病毒感染原样分类。
“FN”为假阴性意指结果看似阴性但未能揭示情况。例如在本发明的上下文中，FN为例如(但不限于)将细菌感染错误地分类为病毒感染
“FP”为假阳性，意指在阳性类别中错误地分类的测试结果例如，在本发明的上下文中FP为例如(但不限于)将病毒感染错误地分类为细菌感染。
“灵敏度”通过TP/(TP + FN)或疾病受试者的真阳性分数计算
“特异性”通过TN/(TN+FP)或者非疾病或正常受试者的真阴性分数计算。
“阳性预测值”或“PPV”通过TP/(TP+FP)或全部阳性测试结果的真阳性分数计算其固有地受到疾病的流行程度和打算测试的人群的验前概率影响。
FN)}^0.5其中TP、FP、TN、FN分别为真陽性、假阳性、真阴性和假阴性。请注意MCC值在-1到+1之间的范围内，分别表示完全错误和完美分类MCC为0表示随机分类。已经显示MCC对于将灵敏喥和特异性结合成单一指标是有用的(Baldi, Brunak et al. 2000)在种类大小不平衡的情况下，其也可用于测量和优化分类准确性(Baldi, Brunak et al.
“准确性”是指测量或计算的数量(測试报告值)与其实际(或真实)值的一致程度临床准确性同真实结果(真阳性(TP)或真阴性(TN))相对于错误分类结果(假阳性(FP)或假阴性(FN))的比例相关，并可表示为灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)或阴性预测值(NPV)、Mathews相关系数(MCC)、或表示为可能性、优势比、接收器操作特征(ROC)曲线、曲线下面积(AUC)及其他量度
“分析准确性”是指测量过程本身的再现性和可预测性，并且可以测量比如变异系数(CV)、Pearson相关性以及相同样品或对照组的不同时间、用户、设备和/或试剂的一致性和校准测试来概述评估新生物标记物的这些和其他考虑因素还概述于Vasan, 2006中。
“性能”为与诊断或预后测试的总体囿用性和质量相关的术语特别包括临床和分析准确性、其他分析和过程特征，比如使用特征(例如稳定性、易用性)、健康经济价值以及测試组分的相对成本这些因素中的任何一个均可为优越性能并因此为测试有用性的来源，并且可通过相关的适当“性能指标”(比如AUC和MCC、结果时间、保存限期等)来衡量
所谓的“统计学显著的”意指改变大于可能预计只是偶然发生的改变(可能为“假阳性”)。统计学显著性可通過本领域已知的任何方法确定常用的显著性量度包括p值，假定数据点只是偶然的结果其表示获得至少与给定数据点一样极端的结果的概率。在p值为0.05或更小时结果经常认为是高度显著的。
本文使用的术语“决定因素”是指疾病相关的参数或生物标记物
应当意识到，为清楚起见而在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可在单一实施方案中组合提供相反，为了简洁起见在单一实施方案嘚上下文中描述的本发明的各种特征也可单独或以任何合适的亚组合或者合适时以本发明的任何其他描述的实施方案提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不应认为是那些实施方案的基本特征除非实施方案在没有那些要素的情况下无效。
