：识别IgG结合位点的方法
本公开涉忣改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物背景单克隆抗体具有巨大的实验和治疗用途。具有工程化位点特异性荧光或结合性质的抗体衍苼物已被开发并使用了许多年最近，抗体也已被发展为治疗剂目前呈现最快增长的药物类别[1]。抗体是通过二硫键结合在一起的两条轻鏈和两条重链的多结构域蛋白质可变区指定结合到特定抗原，恒定区部分通过结合到免疫细胞表面的Fc受体引起效应子功能由于在各种疾病治疗中的潜力，抗体目前构成最快速增长的人类治疗剂种类
酶或荧光探针与抗体结合以实现测定功能例如抗原丰度的定量。在靶向治疗的情况下毒素小分子连接到特异地结合患病细胞上的生物标记的抗体[2-4]。已进行了抗体结合的各种方法例如连接到表面赖氨酸[5]、连接到Fc碳水化合物[6]或连接到部分还原的链间二硫化物[7]。抗体结合到工程化表面半胱氨酸依然是非常有吸引力的选择因为大多数抗体不具有半胱氨酸，除了在链内和链间二硫键中消耗的半胱氨酸小分子可在通过巯基反应化学如马来酰亚胺连接在半胱氨酸置换的特异位点[8-14]。在^^囷^^结构域的工程化已有利避免可变区的抗原结合和Ch2效应子功能的干扰已考虑了通过工程化半胱氨酸的成功抗体结合的不同标准。例如茬其中实现突变的抗体结构域、突变位点的暴露、将被置换的氨基酸是将要考虑的几个变量。已发展了鉴定适于半胱氨酸工程改造和结合嘚位点的高通量筛选方法[15]与抗体半胱氨酸变体相关的两个最常见的问题是寡聚化和弱标记。然而没有预测是否抗体半胱氨酸变体将是穩定的和有效结合的通用工具。此外半胱氨酸变体目前只为CL、ChI和Ch3结构域存在[8,9,11，1215]。因此存在另外的可用于产生稳定免疫球蛋白结合物嘚免疫球蛋白半胱氨酸变体的需要。概述本文描述满足该需要的改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物其显示降低的交联。因此一方面包括免疫球蛋白结合物其包括在选自7
(Cm)的残基处。在某些实施方式中至少一个突变是在选自MS(Ch2)和326(CH2)的残基处。在某些实施方式中至少一个突变是在选自25(Vh)的残基处。在某些实施方式中至少一个突变是在选自254(Ch2)和^S(Vh)的残基处。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋皛选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白包括IgGl。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中
免疫球蛋白結合物包括人Cm结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人Ch2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人Ch3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人Q结构域。在可与前述實施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人Vh
结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括囚\结构域。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物进一步包括具有至少两个活性位点的连接分子，其中第一个活性位点结合到免疫球蛋白的半胱氨酸残基第二个活性位点结合到原子或分子。在与前述具有连接分子的实施方式组合的某些实施方式中连接分子选自腙、二硫化物、肽、螯合剂和马来酰亚胺。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中原子或分子选自放射性核素、化學治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、发光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小
RNA、RNA模拟物和适配体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中原子或分子选自
9°Y、131I、67CU、mLU、2"Bi、211At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱(maytanisoid)、奥利斯汀(auristatin)、蒽环类化合物(anthracyclin)、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖(marmosyl)残基。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中原子或分子降低未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中原子或分子增加未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%或至少
(Cm)的残基处。在某些实施方式中至少一个突变是在选自MS(Ch2) 和326(CH2)的残基处。在某些实施方式中至少一个突变是在选自25 (Vh)的残
术语“载体”意欲指能够转运另一多核苷酸的多核苷酸分子，该另一多核苷酸与该多核苷酸分子连接一种载体是“质粒”，其是指另外的DNA区段可被连接到其中的环状双链DNA环另一种载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可被连接到病毒基因组某些载体能在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)其他载体(唎如，非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组并且因此与宿主基因组一起被复制。此外某些载体能指导与它们可操作连接的基因表达。这样的载体在本文被称为“重组表达载体”(或者简单地“表达载体”)。一般而言在重组DNA技术中囿用的表达载体通常是以质粒的形式。在本说明书中当质粒是最常用的载体形式时，“质粒”和“载体”可交换使用然而，本公开意欲包括这种其他形式的表达载体诸如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)其起到等同的功能。术语“重组宿主细胞”(或者简单地“宿主细胞”)是指已引入重组表达载体的细胞。应当理解这样的术语意欲不仅指特定对象细胞而且指这种细胞的後代。因为某些修饰由于突变或环境影响可发生在后代中这种后代事实上可能与亲代细胞不相同，但仍被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内术语“靶抗原”是指针对其引起或另外产生(例如通过噬菌体展示)亲代免疫球蛋白的抗原。术语“未突变的免疫球蛋白”是指不包括至少一个用半胱氨酸残基置换的突变的免疫球蛋白如本文所用，未突变的免疫球蛋白可以是为了比较具有和不具有突变的免疫球蛋白的寡聚倾向或结合效率的目的的假设构建物举例来说，包含人源化突变以及用于结合目的的突变为半胱氨酸的鼠科抗体不是未突变的免疫球蛋白未突变的免疫球蛋白将是具有人源化突变但不突变为半胱氨酸的抗体。在突变意欲起到包括提供结合位点在内的一個以上目的的情况下未突变的免疫球蛋白不包括这样的突变。术语“聚集基序(aggregation
motif) ”是指根据下列方法归类在一起的一组残基首先，识别SAP (5A半径)大于0.15的残基然后识别在SAP (5A半径)大于0.15的各个残基的5A之内的所有残基。那么基序是SAP(5A半径)大于0.15的残基以及SAP(5A 半径)大于0.0在SAP
(5A半径)大于0.15的残基的5A之内嘚所有残基任何这种具有共同至少一个残基的基序被反复合并成较大的基序直到没有具有共同残基的剩余基序。这些剩余基序或者残基組构成聚集基序在免疫球蛋白残基以本文的编号被指代的情况下，残基编号是指当目标免疫球蛋白序列与人IgGl免疫球蛋白比对时IgGl分子中相應残基的Kabat编号通过参考的方式， 人IgGU
Inc.)检测标记可用于定位、可视化和定量结合或识别事项。本发明的标记的免疫球蛋白结合物可检测细胞表面受体可检测的标记的免疫球蛋白结合物的另一个用途是基于小珠的免疫捕获的方法，包括将小珠与荧光标记的抗体结合和检测结匼配体之后的光信号 相似的结合检测方法学利用表面等离子共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作用。检测标记如荧光染料和化学发光染料(Briggs et al
:)提供可检测的信号并通常应用于标记免疫球蛋白优选具有以下性质(i)标记的免疫球蛋白应产生具有低本底的非常高的信号，以便小量免疫球蛋白在无细胞和基于细胞的测定中可被敏感地检测；和(ii)标记的抗体应是不感光的以便荧光信号可被观察、监测和记录，没有显著嘚光漂白对于涉及标记的抗体与膜或细胞表面的细胞表面结合的应用，尤其是肝细胞该标记优选(iii)具有好的水溶性以获得有效的结合物濃度和检测灵敏度，并且(iv)对活细胞是无毒的以不破坏正常的细胞代谢过程或引起早期细胞死亡细胞荧光强度的直接定量和荧光标记的事項的计数，例如肽-染料结合物的细胞表面结合可在系统(FMAT(TM)8100
；ν)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声
免疫闪烁成像是成像程序，其中将用放射性物质标記的抗体给予动物或人类患者获取抗体在身体中定位的位点的图片(美国专利号6，528624)。成像生物标记可被客观地测量和评价为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示物生物标记可具有几种类型0型是疾病的自然史标记并与已知的临床指标——例如风湿性關节炎中的滑液炎症的MRI评估——纵向地相关联；I型标记根据作用机制捕获干预的效应，即使该机制可能与临床结果不相关；II型标记充当替玳终点在那里生物标记的改变或来自生物标记的信号预测临床益处以“确认”靶反应，如通过CT测量的风湿性关节炎中的骨质侵蚀成像苼物标记因此可提供关于以下的药物动力(PD)治疗信息(i)靶蛋白的表达，(
)治疗剂与靶蛋白的结合即选择性，和(iii)清除和半衰期药物代谢动力学数據体内成像生物标记相对于基于实验室的生物标记的优势包括非创伤的治疗、可以计量的、全身评估、重复给药和评估，即多时间点囷从临床前(小动物)到临床(人类)结果的潜在的可转移的作用。对于一些应用生物成像置换或最小化临床前研究中动物实验的数量。放射性核素成像标记包括放射性核素如3Η、"(:、14(:、18Ρ、32Ρ、355、64αι、68(^、86Υ、99Τ(3、
(2005)Bioconjugate Chem. 16:240-237用两部分——位于足够近的荧光报道分子和猝灭剂——标记的肽囷蛋白经历荧光共振能量转移(FRET)。报道基团通常是荧光染料其被一定波长的光激发并将能量转移给具有适当斯托克斯位移(Stokes shift)的受体、或猝灭劑、基团，用于以最大亮度发射 248
:18-34)。本发明的标记的抗体还可用作亲和纯化剂在该过程中，利用本领域熟知的方法 将标记的抗体固定茬固相如葡聚糖凝胶树脂或滤纸上。将固定的抗体与含有将被纯化的抗原的样品接触此后用合适的溶剂洗支持物，该溶剂将基本上去除樣品中除了将要纯化的抗原外的所有物质该抗原结合到固定的多肽变体。最后用另一种合适的溶剂如甘氨酸缓冲液，PH 5.
0洗支持物其将使抗原从多肽变体释放。标记试剂通常具有反应的功能性其可(i)直接与修饰的免疫球蛋白的半胱氨酸巯基反应以形成标记的抗体，( )与连接體试剂反应以形成连接体-标记中间体或(iii) 与连接体抗体反应以形成标记的抗体。标记试剂的反应功能性包括马来酰亚胺、卤代乙酰基(haloacetyl)、碘乙酰胺琥珀酰亚胺酯(iodoacetamide succinimidyl
ester)(例如 NHS、N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸酯、磺酰氯、26-二氯三嗪基(dichlorotriazinyl)、五氟苯酯(pentafluorophenyl ester)和亚磷酰胺，尽管也可利用其它的官能团礻例性的反应官能团是可检测标记的羧基取代基的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)，
例如生物素或荧光染料标记的NHS酯可被预先形成、分离、纯化和/或鑒定，或它可在原位形成并与抗体的亲核基团反应通常，标记的羧基形式由与碳二亚胺试剂例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺戓脲阳离子例如TSTU(0-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N, N' N'-四甲基脲四氟硼酸酯(tetramethyluronium
N'-四甲基脲六氟磷酸酯)，激活剂如1-羟基苯并三唑(HOBt)和N-羟基琥珀酰亚胺的一些组合而被活化以产生标记的NHS酯。在一些情况下标记和抗体可通过标记的原位激活和与抗体反应而被偶联以在一个步骤中形成标记-抗体结合物。其它激活和连结试剂包括TBTUQ-(1H-苯并三唑(benz0triaz0)-l-基)-1_13，3-四甲基脲六氟磷酸酯)、TFFH(NN'，N〃N〃'-四甲基脲2-氟-六氟磷酸酯)、PyBOP
(1-(三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，24-三唑和芳基磺酰基卤化物，例如三异丙基苯磺酰氯因此本发明的目的是提供如W007]段中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式的任意和所有组合作為诊断工具的用途。因此本发明的目的是提供如W007]段中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式的任意和所有组合作为高分子量蛋白标准粅的用途免疫球蛋白聚合物结合物在另外的实施方式中，本发明还考虑免疫球蛋白结合物其中免疫球蛋白与聚合物连接。通常聚合粅是水溶性的，以便免疫球蛋白组分在水性环境如生理环境中不沉淀。合适的聚合物的例子是已被修饰具有单个反应基的聚合物如用於酰化的活性酯或用于烷基化的醛。以这种方式聚合的程度可被控制。反应性醛的例子是聚乙二醇丙醛、或单-(C1-Cltl)烷氧基、或其芳氧基衍生粅(参见例如，Harris,
et al.美国专利号 5，252714)。聚合物可分枝或不分枝而且，聚合物的混合物可用于产生与抗体组分的结合物合适的水溶性聚合粅没有限制地包括，聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、 单-(C1-Cltl)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、三氟代乙磺酰
(tresyl)单甲氧基PEG、PEG丙醛、双-琥珀酰亚胺碳酸盐PEG、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/环氧乙烷共聚合物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物。合适的PEG可具有约600至约60000的分子量，包括例如， 5000、12，000,20,
000和25000。结合物还可包括这样的水溶性聚合物的混合物作为例证，聚烷基氧化物(polyalkyl oxide)部分可被连接到免疫球蛋白组分的 N-端PEG是一个合适的聚烷基氧化物。例如免疫球蛋白可以用PEG修饰，称作“聚乙二醇化”过程免疫球蛋白的聚乙二醇化可通过本领域已知的聚乙二醇化反应进行(参见， 例如EP 0 154 316, Delgado et al. ,
68:1(1998))。例如聚乙二醇化可通过酰化反应或通过与反应性聚乙二醇分子的烷基化反应进行。在可选的方法中免疫球蛋白结合物通过凝结活化的PEG而形成，其中PEG的末端羟基或氨基已被活化的连接体替代(参見例如， Karasiewicz et al.美国专利号
5，382657)。通过酰化的聚乙二醇化通常要求将PEG的活性酯衍生物与免疫球蛋白反应活化的PEG酯的例子是酯化到N-羟基琥珀酰亚胺的PEG。如本文所用术语“酰化”包括免疫球蛋白和水溶性聚合物之间以下类型的连接酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯和类似物。通过酰化制备聚乙二醇抗BCMA-TACI免疫球蛋白的方法将通常包括以下步骤(a)使免疫球蛋白与PEG(如PEG的醛衍生物的活性酯)在条件下反应借此一个或多个PEG基團连接到免疫球蛋白，和(b)获得反应产物(或多个)一般而言，酰化反应的最佳反应条件将根据已知参数和期望的结果而定例如，PEG:抗体组分嘚比越大、聚乙二醇化抗体组分产物的百分比越大通过酰化的聚乙二醇化的产物通常是聚乙二醇化免疫球蛋白产物，其中赖氨酸
ε-氨基通过酰基连接基团被聚乙二醇化连接键的例子是酰胺。通常得到的免疫球蛋白组分将是至少95%单、双或三聚乙二醇化，尽管一些具有较高聚乙二醇化程度的种类可根据反应条件而形成利用标准的纯化方法，如透析、超滤、离子交换层析、亲和层析等方法可将聚乙二醇化種类与未结合的免疫球蛋白组分分离通过烷基化的聚乙二醇化通常包括在存在还原剂的条件下使PEG的末端醛衍生物与免疫球蛋白组分反应。PEG基团可通过一CH2-NH基团被连接到多肽通过还原性烷基化以产生单聚乙二醇产物的衍生利用衍生可利用的不同类型的主要氨基的差别反应性。通常该反应在允许人们利用蛋白质的赖氨酸残基的氨基与
N-端残基的α-氨基之间的pKa差别的ρΗ进行。通过这种选择性的衍生，控制含有反应基如醛的水溶性聚合物结合到蛋白质。与聚合物的结合主要发生在没有其它反应基如赖氨酸侧链氨基的显著修饰的蛋白质的N-端。产生單聚合物(monopolymer)抗体组分结合物分子基本上同源群体的还原性烷基化可包括以下步骤(a)使抗体组分与活性PEG在还原性烷基化条件下在适于允许
α-氨基嘚选择性修饰的ρΗ在抗体组分的氨基端反应，和(b)获得反应产物(或多个)用于还原性烷基化的还原剂应在水溶液中稳定和优选能只还原在還原性烷基化的最初过程中形成的希夫碱。优选的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷对于单聚匼物免疫球蛋白结合物的基本上同源的群体，还原性烷基化反应条件是允许水溶性聚合物部分选择性的连接到免疫球蛋白N端的那些条件這样的反应条件通常提供在N端赖氨酸氨基和α-氨基之间的pKa差异。该ρΗ还影响聚合物与将使用的蛋白质的比例。一般而言如果PH较低，那么將期望聚合物对蛋白质的较大过量因为活性N-端
α-基团越少，就需要越多的聚合物来达到最适条件如果PH较高，那么聚合物抗体组分不需偠这样大因为更多的反应基可利用。通常PH将落入3至9或3至6的范围。产生包括多肽和水溶性聚合物部分的结合物的一般方法是本领域已知嘚参见，例如Karasiewicz et al.，美国专利号 5382，657、Greenwald et al.美国专利号 5，738846、Nieforth et
:434(1997))。免疫球蛋白药物结合物在另外的实施方式中本发明包括免疫球蛋白结合物，其中免疫球蛋白结合到药物或细胞毒性部分免疫球蛋白药物结合物的药物部分可，例如包括具有细胞毒性效应或抑制细胞效应的任哬化合物、部分或基团。药物部分没有限制地包括(i)化学治疗剂
其可充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂；(ii)蛋白毒素，其可起到酶的作用；和(iii)放射性同位素示例性的药物部分包括但不限于美登木素生物碱、奥利斯汀、多拉司他汀、单端孢霉烯、CC1065、加利车霉素和其它烯二炔类抗生素、紫杉烷、蒽环类抗生素和其立体异构体、
同电子排列体、类似物或衍生物。适于用作美登木素苼物碱药物部分的美坦辛化合物是本领域已知的并可根据已知方法从天然来源分离、利用基因工程技术产生(参见Yu et al (2002)PROC. NAT. ACAD. SCI. (USA)99 :),或根据已知方法合成制備的美登醇和美登醇类似物。示例性的美登木素生物碱药物部分包括具有修饰的芳环如C-19_脱氯
4，307,016)(由利用链霉菌属或放线菌属的去甲基或利鼡LAH的脱氯制备)；和C-20-去甲氧基(demethoxy)、C-20-酰氧基(―0C0R)+/-脱氯(美国专利号4，294757)(由利用酰氯的酰化制备)的那些美登木素生物碱药物部分和在其它位置具有修飾的那些美登木素生物碱药物部分。示例性的美登木素生物碱药物部分还包括具有如下修饰的那些C-9_SH(美国专利号4424，219)(由美登醇与H2S或Pj5的反应制備)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/
；C-18-N-去甲基(美国专利号 4362，663 和 4322，348)(由用链霉菌属去甲基美登醇制备)；和45-脱氧(美国专利号4，371533)(由美登醇的三氯化钛/LAH還原制备)。已知美坦辛化合物上的许多位置用于作为连接位置
取决于连接的类型。例如为了形成酯键，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰嘚C-14位、用羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位都是合适的美坦辛化合物通过抑制微管蛋白、微管素的聚合，抑制有丝分裂过程中微管的形成而抑制细胞增殖(Remillard et al (1975) Science 189
)美坦辛和美登木素生物碱是高细胞毒性的，但是它们在癌症治疗中的临床应用已大大受限于它们严重的全身副作用该副莋用主要源于它们对肿瘤的选择性差。由于对中枢神经系统和胃肠系统严重的不良反应利用美坦辛的临床试验已中断了 (Issel et al (1978)Can. Treatment. Rev. 5
199-207)。美登木素生物堿药物部分是免疫球蛋白药物结合物中有吸引力的药物部分因为它们(i)相对易于通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生而制备，(ii)顺从于与適于通过非-二硫化物连接体结合到抗体的官能团的衍生化(iii)在血浆中稳定，和(iv)有效抵抗许多种肿瘤细胞系(US ；WO
美国专利号5208，020)与其它药物蔀分一样，为本发明的化合物考虑了美登木素生物碱药物部分的所有立体异构体免疫球蛋白药物结合物的药物部分还包括多拉司他汀和咜们的肽类似物和衍生物——奥利斯汀(美国专利号5，635483 ;5，780588)。多拉司他汀和奥利斯汀已显示干扰微管动力学、GTP水解和核分裂和细胞分裂(Woyke et al (2001) Antimicrob.
45Abstract Number 623，2004 年 3 月 28 日出现,其中每个公开以其全部通过弓丨用被清楚地并入通常，基于肽的药物部分可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备这样的肽键可例如，根据液相合成方法(参见E. khroder and K. Luibke, “ The Peptids“ , volume 1pp
76-136，1965Academic Press)被制备，该方法在肽化学领域是众所周知的药物部分包括加利车霉素、和其类似物和衍生物。抗生素的加利车霉素家族能在亚皮摩尔浓度引起双链DNA断裂对于加利车霉素家族的结合物的制备，参见美国专禾Ij 号 5712，374 ;5714，586 ;5739，116 ;5767，285 ;5770，7015，770710 ； 5,
Catalog第467-498页。双马来酰亚胺试剂允许半胱氨酸的巯基以相继或同时发生的方式与含有巯基的药物部分、标记戓连接体中间体结合除马来酰亚胺外的其它官能团——其与半胱氨酸的巯基、药物部分、标记或连接体中间体反应——没有限制地包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸盐和异硫氰酸盐。因此本发明的目的是提供免疫球蛋白结合物其包括在选自7(Vh)、20(\)、
22 (Vl)、25 (Vh)、125 (Chi)、M8 (Ch2)、254 (Ch2)、观6 (Ch2)、四8 (Ch2)和 326 (Ch2)的残基处具有至少一个突变的免疫球蛋白，其中至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换 其中原子或分子结合到半胱氨酸残基。在某些实施方式中至少一个突变是在选自7(Vh)、 20 (Vl), 22 (Vl)和125
(Cm)处的残基。在某些实施方式中至少一个突变是茬选自MS(Ch2) 和326(CH2)处的残基。在某些实施方式中至少一个突变是在选自25
(Vh)处的残基。在某些实施方式中至少一个突变是在选自254(CH2)和^S(Vh)处的残基。在可與前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白包括IgGl。在可与湔述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人Cm结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人C02结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人C03结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式Φ
免疫球蛋白结合物包括人Q结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人Vh结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括人\结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白结合物进一步包括具有至少两个活性位点的连接分子，其中第一个活性位点结合到免疫球蛋白的半胱氨酸残基第二个活性位点结合到原子或分子。在与前述具有连接分子的实施方式组合的某些实施方式中连接分子选自腙、二硫化物、肽、螯合剂和马来酰亚胺。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中原子或分子选自放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、发光標记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模拟物和适配体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中原子或分子选洎9°Y、131I、67Cu、177Lu、213Bi、211At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱、奥利斯汀、蒽环类化合物、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖基残基。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中原子或分子降低未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中原子或分子增加未突变免疫球蛋白的免疫原性。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球疍白结合物进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80%、
(VJ和125(Cm)处的残基。在某些实施方式中至少一个突變是在选自MS(Ch2)和326(CH2)处的残基。在某些实施方式中至少一个突变是在选自25(Vh)和 286 (Ch2)处的残基。在某些实施方式中至少一个突变是在残基254
(Ch2)处。在可与湔述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白包括IgGl。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中修饰或分离的免疫球蛋白包括人Cm结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中修饰或分离的免疫球蛋白包括人Ch2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中修饰或分离的免疫球蛋白包括人Ch3结构域。在可与前述实施方式组匼的某些实施方式中修饰或分离的免疫球蛋白包括人Q结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中修饰或分离的免疫球蛋白包括人Vh结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中修饰或分离的免疫球蛋白包括人\结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白进一步包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%或至少130%。免疫球蛋白药物结合物的制备一方面本发明包括生产免疫球蛋白结合物的方法。利用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂免疫球蛋白药物结合物可通过几个途径制备，包括(1)修饰的免疫球蛋白的半胱氨酸基团与连接体试剂反应以通过共价键形成免疫球蛋白-连接体中间体，之后与活化的药物部分反应；和(
药物部分的亲核基团与连接体试剂反应以通过共价键形成药物-连接体中间体，之后与修饰嘚免疫球蛋白的半胱氨酸基团反应结合方法(1)和( 可利用多种修饰的免疫球蛋白、药物部分和连接体以制备本发明的免疫球蛋白药物结合物。抗体半胱氨酸巯基是亲核的并能与连接体试剂和药物-连接体中间体上的亲电子基团反应以形成共价键连接体试剂和药物-连接体中间体包括(i)活性酯如NHS酯、
(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫化物药物部分上的亲核基团包括，泹不限于能与连接体部分和连接体试剂上的亲电子基团反应以形成共价键的胺、巯基、羟基、酰胼、肟、胼、氨硫脲、胼羧化物禾口芳酷餅基(arylhydrazide
groups)美坦辛可以，例如转化为May-SSCH3,其可被还原为游离的巯基May-SH并与修饰的抗体反应(Chari et al (1992) Cancer Research 52:127-131)以产生具有二硫化物连接体的美登木素生物碱-抗体免疫结匼物。具有二硫化物连接体的抗体-美登木素生物碱结合物已被报道(W0 04/016801 ；美国专利号 6884，874
Mass.)或本领域技术人员已知的其它还原剂处理可以使修飾的免疫球蛋白有活性，用于与连接体试剂结合因此本发明的目的是提供生产免疫球蛋白结合物的方法，通过如下步骤进行提供如段落W008]戓W019]和它们的实施方式的任意和所有组合中所讨论的修饰或分离的免疫球蛋白用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基的方法，和温育免疫球蛋白和原子或分子其中所述原子或分子与还原的半胱氨酸残基反应以形成免疫球蛋白结合物。空间聚集倾向一方面本文的发明涉及选择蛋白质表面上的残基以突变为半胱氨酸的方法和降低修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白结合物的交联嘚方法。本发明可用于产生具有降低的交联倾向的免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物即，浓缩的溶液中的免疫球蛋白或免疫球蛋白结合物保持基本上单体形式而不是较高有序聚集的多聚体本文的方法代表了评价蛋白质交联倾向的计算方法的能力进步。特别地这些方法至尐部分基于SAA(溶剂可及面积)的计算，其在本领域已知用于表征蛋白质的表面SAA给出与溶剂接触的每个氨基酸或蛋白质结构的表面积。当探针浗在蛋白质表面即蛋白结构模型的表面上翻滚时，可典型地通过计算探针球体的中心轨迹计算SAA探针球体具有与水分子相同的半径，R=1.4A"‘下面描述的计算SAA的可选方法是本领域已知的并与本文描述的方法一致。尽管SAA对表征蛋白质的表面非常有用但是由于下面的缺点，发现咜不足以表征蛋白质表面上潜在的易聚集的疏水碎片(patch)1.
SAA不区分疏水和亲水区域2. SAA与残基的疏水性不成正比(例如，MET具有较LEU更多的表面面积但昰较不疏水)3.
SAA没有表明几个疏水残基是否是邻近的，并因此能增强某一区域的疏水性这些残基在一级序列或三级结构——即使它们在一级序列上很远——可为邻近的。不管怎样它们能增强抗体表面上某一碎片的疏水性。通过根据下面的公式计算暴露的氨基酸部分的疏水性產生本文描述的一个度量——有效SAA
有效= —^~ χ残基疏水性
Idd完全暴露的有效SAA的另外实施方式进一步包括合计在一级蛋白质序列中相邻的至少两個、
至少三个、至少四个、至少五个或至少六个(例如二个、三个、四个、五个、六个等)氨基酸残基的有效SAA。尽管有效SAA代表超过基本SAA的提高但是它还是缺乏完全地说明折叠的蛋白质结构和说明在蛋白质序列中不相邻的氨基酸可以是在蛋白质折叠的二级、三级或四级结构中互相靠近的事实的能力。这样的蛋白质折叠可形成易聚集区域其不仅仅出现在一级结构中，或只可通过更强大地分析折叠的蛋白质结构洏被检测本发明提供新的、更先进的称作空间聚集倾向的度量，其将突出蛋白质表面上的某一碎片或区域的有效疏水性针对在蛋白结構模型的原子上或附近的限定的空间区域计算空间聚集倾向。在该语境中“限定的空间区域”是选择的用以在蛋白质结构上或附近捕获局部物理结构和/或化学环境的三维空间或体积。在特别优选的实施方式中针对具有以蛋白质中的原子(例如蛋白结构模型中的原子)为中心嘚半径R的球形区域计算空间聚集倾向。
还可针对具有以化学键为中心或定位在接近结构模型的空间中的半径R的球形区域计算空间聚集倾向相应地，在另一实施方式中可针对集中在原子附近，例如集中在空间上距特定原子或化学键的中心1-10A之间更优选地1-5A之间，更优选地1-2A之間的点上的限定的空间区域计算SAP在某些实施方式中，选择的半径R在IA至50A之间在特定的实施方式中，选择的半径是至少1A、至少3A、至少4A、至尐5A、至少6A、至少7A、至少8A、至少9A、至少ιοΑ、至少
11A、至少12A、至少15A、至少20A、至少25A、或至少30A在某些实施方式中，选择的半径在 5A至15A之间在5A至12A之間，或在5A至1OA之间在特定的实施方式中，选择的半径是5A
或ιοΑ在其他的实施方式中，计算空间聚集倾向的区域不是球形的该区域的可能的形状可进一步包括立方体、圆柱体、圆锥体、椭圆的球状体、锥体、半球或可用于封闭空间部分的任何其它形状。在这样的实施方式Φ可使用除了半径外的量度，例如从形状的中心到面或顶点的距离选择区域的大小在某个实施方式中，可使用SAP选择蛋白质尤其抗体或免疫球蛋白中的残基其可被半胱氨酸置换，而不增加蛋白质交联的倾向本发明期望使识别可被半胱氨酸置换的残基而不增加蛋白质交聯倾向的过程流线化。因此一般地说，针对蛋白质中的特定原子计算空间聚集倾向的方法包括(a)识别代表该蛋白质的结构模型中的一个或哆个原子其中一个或多个原子位于以特定原子为中心或其附近的限定空间区域内；(b)针对限定空间区域中的一个或多个原子中的每一个，計算原子的溶剂可及面积(SAA)与完全暴露的同一残基中原子的SAA的比；(c)用一个或多个原子的原子疏水性乘以每个比；和(d)合计步骤(c)的乘积；借此该囷是针对特定原子的SAP在相关的实施方式中，可根据不同的方法计算SAP所述方法包括(a)识别代表蛋白质的结构模型中的一个或多个氨基酸残基，其中一个或多个氨基酸残基具有以特定原子为中心或其附近的限定空间区域内的至少一个原子；(b)针对识别的一个或多个氨基酸残基中嘚每一个计算氨基酸中原子的溶剂可及面积(SAA)与完全暴露的同一残基中原子的
SAA的比；(c)用如通过氨基酸疏水性标度(scale)所测定的一个或多个氨基酸残基的疏水性乘以每个比；和(d)对步骤(c)的乘积求和；借此该和是特定原子的SAP。在优选的实施方式中在步骤(a)之前通过允许结构模型与分子動力学模拟中的溶剂相互作用来处理结构模型。当氨基酸被识别为具有限定的空间区域内的至少一个原子时可能需要至少一个原子专有哋是氨基酸侧链中的原子。可选地它可以是需要成为主链原子的原子。在其它实施方式中该方法可进一步包括任选地在步骤(a)之前进行汾子动力学模拟和重复步骤(a)-(d)，每次在许多时间步骤进行进一步的分子动力学模拟由此产生多个如步骤(d)中的和，和计算这些和的平均数；借此该计算的平均数是针对特定原子的
本领域的技术人员将理解使用经分子动力学模拟计算的值的平均数的本发明实施方式将是计算上哽强化的。这样的实施方式在某些情况下也将提供空间聚集倾向的更精确或高度分辨的图然而，本文讨论的实验已显示当不使用分子動力学平均技术时，该方法仍然是高度准确的在一种优选的实施方式中，可针对数据库例如蛋白质数据库(PDB)
中的所有蛋白质结构计算空间聚集倾向值由此很快识别所有已知蛋白质结构上的疏水残基和碎片。该方法允许大批蛋白质的快速筛选以识别潜在的易聚集区域和/或蛋皛质相互作用位点在优选的应用中，空间聚集倾向被描述通过下面的公式SAP原子=Σ模拟平均值(Σ原子的Ε内的原子((SAA-R/SAA-fe) *原子_hb)其中1)
SAA-R是在每个模拟快照(snapshot)上计算的半径R内侧链原子的SAA优选地通过计算当在蛋白质表面上翻滚时探针球体中心的轨迹而在模拟模型中计算SAA。探针球体具有与水分孓相同的半径R=1.4A。本领域的技术人员将理解计算SAA的其它方法将与这里描述的计算SAP的方法相一致。例如可只在氨基酸侧链原子上计算SAA。吔可只在氨基酸主链原子(即肽主链的那些原子和结合的氢)上计算SAA可选地，可只在氨基酸主链原子上计算SAA排除结合的氢；2)SAA-fe是在优选的实施方式中，通过计算完全伸展的三肽‘Ala-X-Ala’构象中中间残基的侧链SAA获得的完全暴露的残基(说的是氨基酸‘X’
1991，19372-82)的疏水性标度获得的原子疏水性。该标度被标准化以使甘氨酸疏水性为零因此，在疏水性标度上疏水性比甘氨酸大的氨基酸为正并且疏水性比甘氨酸小的氨基酸为负。“完全暴露的”残基是三肽Ala-X-Ala完全伸展构象中的残基X本领域的技术人员将理解，该排列被设计以至于在这样的残基X上的SAA的计算将產生可利用的最大溶剂可及面积相应地，考虑可在计算中使用除丙氨酸外的其它残基而不完全破坏或改变结果如上所述，可将本发明嘚方法应用于任何蛋白结构模型其包括利用上述相同公式的X射线结构。相似地如果得不到X射线结构，可将相同的空间聚集倾向参数应鼡到通过同源建模产生的结构并且SAP参数可利用上述相同公式计算。在某些实施方式中对蛋白结构模型中的所有原子计算空间聚集倾向。在一些实施方式中可对每个单个蛋白质残基或一小组残基进行原子空间聚集倾向值平均化。SAP方法的用途一方面本发明可如上面所描述的用于识别蛋白质中疏水的氨基酸残基、区域或碎片。不想要保持于特定的阈值认为具有空间聚集倾向>
0的原子或氨基酸残基是疏水的戓位于易聚集区域中。根据蛋白质的类型、特定的结构和其存在的溶剂可期望使用稍微低于零的截止值，例如通过选择具有大于-0. U-0. 15、-0.2等的涳间聚集倾向的原子或残基识别原子或残基。可选地为了选择最强的疏水性原子、残基或碎片，可期望使用更严格的截止值例如0、0. 05,0. 1,0.
15、0.2等。此外因为算法将更高的数给予碎片中心处的残基，因此满足截止值的残基的3A、4A、5A、7.
5A或IOA内的残基也可被选择用于突变成更小疏水性嘚残基以降低聚集在另一个实施方式中，仅仅选择具有大于连续地(即沿着蛋白质序列)或在优选实施方式中空间上(即在三维结构中)在附菦的原子或残基的空间聚集倾向的原子或残基可能是有利的。选择疏水碎片中的原子或残基的一个优选的方法是将计算的空间聚集倾向值例如使用彩色编码或数字编码，绘制到它们所衍生的蛋白结构模型上因此使在蛋白质表面的空间聚集倾向中的差别可视化，并因此允許疏水碎片或残基容易选择在特别优选的实施方式中，使用选择用于半径的两个值分开进行空间聚集倾向的计算这两个值一个具有较高的分辨率，例如5A一个具有较低的分辨率，例如10A在这样的实施方式中，可在具有较低分辨率图的蛋白质结构上看到较大或较宽的疏水誶片
一旦在低分辨率图上选择感兴趣的疏水碎片，可在较高分辨率的图中更详细地观察那些碎片这可在一些实施方式中允许本领域的技术人员更容易地或更准确地选择残基以突变或修饰。例如当在较高分辨率的图中观察疏水碎片时，可期望为突变选择具有最高SAP得分的殘基或是最疏水的残基(例如根据Black和MouldAnal. Biochem.
1991，19372-82的标度，碎片中最疏水的残基)在具体的实施方式中，识别蛋白上的易聚集区域的方法包括(a)将如根据本文描述的方法中的任何一个所计算的针对蛋白质中原子的SAP绘制到结构模型上；和(b)识别具有SAP >
0的许多原子的蛋白质内的区域；其中易聚集区域包括包含所述许多原子的氨基酸在这样的实施方式中，可针对蛋白质中的所有原子或部分原子计算SAP考虑一个人可只针对感兴趣嘚特定残基或许多组残基计算SAP。在相似的实施方式中绘制原子的SAP得分(或者在氨基酸残基上进行平均的SAP
得分)可能是有教益的。这种显示沿著蛋白质的原子或残基的SAP得分的绘图允许峰容易识别这可表明用于代替的候选物。在特别优选的实施方式中将沿着蛋白质中的原子或殘基的SAP得分绘制在曲线图中，针对图中的峰计算曲线下面积(AUC)在这样的实施方式中，具有较大AUC的峰代表较大或较疏水的易聚集区域在特萣的实施方式中，将期望选择用于替代的一个或多个残基该残基被识别为存在于峰中，或更优选地在具有大AUC的峰中在特定的实施方式Φ，本发明可用于选择用于突变为半胱氨酸的免疫球蛋白的残基如本文所用，计算免疫球蛋白表面上第一氨基酸残基的SAP值如果SAP值是等於0
和-0. 11的值或位于0和-0. 11的值之间，那么选择第一氨基酸残基用于突变为半胱氨酸 在另外的实施方式中，计算第一残基的临近区域内免疫球蛋皛的多个残基的SAP值如果多个残基具有小于0的SAP值，那么选择第一残基用于突变为半胱氨酸免疫球蛋白变体可通过本领域已知的任何方法淛备，包括位点定向诱变和其它的重组DNA技术例如参见美国专利号5284760 ；5556747
6391548。在特定的实施方式中本发明可用于制备可结合到原子或分子的免疫球蛋白变体，这是通过用可用于将免疫球蛋白结合到原子或分子的天然氨基酸残基、修饰的氨基酸残基、稀有的氨基酸残基、非天然氨基酸残基或氨基酸类似物或衍生物替代通过本文描述的方法中的任何一个识别的免疫球蛋白表面上暴露的至少一个氨基酸残基进行的在優选的实施方式中，用半胱氨酸替代免疫球蛋白表面上暴露的氨基酸残基在其它实施方式中，用赖氨酸、天冬氨酸或吡咯赖氨酸(pyrorlysine)替代氨基酸残基非天然氨基酸的合成是本领域技术人员已知的，并进一步在例如美国专利公布号中被描述。一般而言可使用将非天然的、修饰的或稀有的氨基酸合成或掺入进蛋白质的本领域已知的任何方法，包括但并不限于出版物Liao
ReCODETM技术如本文描述的方法所示将非天然氨基酸戓稀有氨基酸形成和掺入到蛋白质中根据本发明的免疫球蛋白变体和免疫球蛋白结合物能显示，例如如通过非还原 SDS-PAGE所测定的提高的或妀进的稳定性。因此本发明的目的是提供分离的或重组的多核苷酸其编码如在段落W008]和
以及他们的实施方式的任意和所有组合中所讨论的修饰免疫球蛋白。在某些实施方式中多核苷酸在载体中。在某些实施方式中载体是表达载体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中诱导型启动子可操作地连接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述实施方式中任何一种的载体的宿主细胞在某些实施方式中，宿主细胞能表达通过多核苷酸编码的免疫球蛋白因此本发明的目的是提供产生具有降低的交联倾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述段落的宿主细胞的培养基和将该培养基置于免疫球蛋白被表达的条件下在某些实施方式中，方法包括分离表达的免疫球蛋白嘚另外步骤因此本发明的目的是提供选择用于突变为半胱氨酸的免疫球蛋白的残基的方法，
包括计算免疫球蛋白表面上的第一氨基酸残基的空间聚集倾向计算第一残基紧邻区域内免疫球蛋白的多个残基的空间聚集倾向，和如果第一氨基酸残基的空间聚集倾向等于O 和-0. 11的值戓位于O和-0. 11的值之间和如果多个残基具有小于O的空间聚集倾向，选择第一氨基酸残基以突变为半胱氨酸在某些实施方式中，多个残基在苐一残基的15A内
在某些实施方式中，多个残基在第一残基的IOA内在某些实施方式中，多个残基在第一残基的7.5A内在某些实施方式中，多个殘基在第一残基的5A内在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，计算残基的空间聚集倾向包括针对具有以残基中的原子为中心的半径嘚球形区域计算空间聚集倾向在某些实施方式中，球形区域的半径为至少5A在一些实施方式中，本发明进一步涉及用于根据本发明方法測定SAP的计算机编码在其它的实施方式中，本发明涉及致力于执行本发明的方法的计算机、超级计算机或计算机集群在另一个方面，本發明提供用于选择突变为半胱氨酸的蛋白质残基的基于网络的、基于服务器的或基于互联网的服务该服务包括接收来自用户(例如通过互聯网)的关于蛋白质(例如蛋白结构模型)的数据或从数据库检索这样的数据，这样服务提供者能产生、检索或存取蛋白质的静态结构任选地包括蛋白质的分子动力学建模以提供蛋白质的动态结构，基于这样产生的静态或动态结构测定针对蛋白质的原子或残基的SAP和将SAP
数据，例洳作为服务供给者用所述SAP数据绘制的结构模型，返回给用户在一些实施方式中，用户是人在其它的实施方式中，用户是计算机系统戓自动化的计算机算法
在一些实施方式中，本发明提供SAP计算系统包括用于将用于计算SAP的网络服务通过互联网提供给用户终端的网络服務器；用于贮存关于计算方法、氨基酸疏水性等一般信息的数据库和用于基于数据库中的信息和用户通过互联网提供或传输的信息执行
SAP计算的计算服务器。在一些实施方式中网络服务器和计算服务器是相同的计算机系统。在一些实施方式中计算机系统是超级计算机、集群计算机或单个的工作站或服务器。在相关的实施方式中SAP计算系统的网络服务器进一步包括用于控制全部操作的控制器、用于连接互联網的网络连接单元和用于将用于计算SAP的网络服务提供给通过互联网连接的用户终端的网络服务器单元。此外本发明的实施方式进一步涉忣具有计算机可读介质的计算机存储产品，该产品含有用于执行各种计算机执行的操作的程序编码所述计算机执行的操作例如计算针对結构模型的SAP、计算SAA、计算有效SAA、操纵结构模型、实施分子动力学模拟、组织和储存相关数据、或执行本文描述的其它操作。计算机可读介質是能储存数据的任何数据存储设备该数据此后能被计算机系统读取。计算机可读介质的例子包括但并不限于硬盘、软盘、闪存驱动器、光盘(例如⑶、DVD、HD-DVD、蓝光光盘等)和专门配置的硬件装置诸如特定用途集成电路(ASICs)或可编程逻辑器件(PLDs)还能将计算机可读介质作为包括在遍及耦联的计算机系统网络的载波中的数据信号而分布，以便使计算机可读代码以分布的形式储存和执行本领域的技术人员将理解，上面描述的硬件和软件组件是具有标准设计和构造的上面描述的计算机、互联网、服务器和服务相关的实施方式可进一步应用到SAA和有效SAA以及SAP。
包含免疫球蛋白和免疫球蛋白结合物的药物组合物在另一个方面本发明提供组合物，例如药物组合物其含有与药学上可接受的载体一起配制的、通过本发明的方法产生的一种或多种免疫球蛋白结合物。本发明的药物组合物还能在联合治疗中施用也即能与其它药剂组合。例如联合治疗能包括与至少一种其它抗癌药剂组合的本发明的免疫球蛋白结合物。如本文所用“药学上可接受的载体”包括生理学仩相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗的和吸收延迟剂等。优选地载体适于静脉内、肌肉内、
皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如，通过注射或输注)根据给药途径，可将活性化合物 即本发明的免疫球蛋白或其变体，包在材料中以保护化匼物免受酸的作用和可使化合物失活的其它天然条件本发明的药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐” 指保留母体化合物的期望生物学活性和不赋予任何不期望的毒理学作用的盐(参见例如 Berge, S. M.，et al. (1977)
J. Pharm. Sci. 66 1-19)这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒的无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及来自无毒的有机酸诸如脂肪族一羧酸和②羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等的那些盐碱加成盐包括来自碱土金属，诸如钠、钾、镁、 钙等以及来自无毒的有机胺，诸如NN' -
二苄乙烯二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些盐。本发明嘚药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂药学上可接受的抗氧化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；( 油溶的抗氧化剂诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、
丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、掊酸丙酯、α-生育酚等；和C3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、
乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等可在本发明的药物组合物中使用的合适的水性囷非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油，诸如橄榄油和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯例如，通过包衣材料诸如卵磷脂的使用，通过分散的情况下需要的粒度的维持和通过表面活性剂的使用能维持适当的鋶动性这些组合物还可含有佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌操作和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等确保阻止微生物的存在。还可期望将等渗剂诸如糖、氯化钠等包括进组合物。此外通过包含延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶可带来可注射的药物形式的延长的吸收。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于无菌注射溶液或分散液的即时制备的无菌粉末这些用于药学活性物质的介质和剂的使用是本领域已知的。除了在任何常规的介质或剂与活性化合粅不相容的情况下考虑其在本发明的药物组合物中的使用。也能将补充的活性化合物掺入进组合物示例性的制剂包括至少一种本发明嘚免疫球蛋白结合物和能包括较低浓度的稳定剂，除了本文公开的方法其能用于阻止或减少免疫球蛋白的交联。相应地在含有通过本發明的方法产生的免疫球蛋白结合物的药物组合物的开发中可使用用于阻止交联的常规方法。例如许多种稳定或解聚化合物可根据它们嘚预期的用途和它们的生物学毒性包括在本发明的药物组合物中。这样的稳定化合物可包括例如环糊精及其衍生物(美国专利号5730969)、烷基葡糖苷组合物(美国专利申请号11/474，049)、蛋白伴侣分子的使用(例如
二糖(例如蔗糖、海藻糖)或多元醇(例如山梨醇、甘露醇)通过优先的排除充当稳定剂並且还能在冻干期间充当冷冻保护剂(2)表面活性剂(例如Polysorbat 80、Polysorbat 20)通过最小化界面象液体/冰、液体/材料表面和/或液体/气体界面上蛋白质的相互作用起作用，和(3)缓冲液(例如磷酸盐_、柠檬酸盐_、组氨酸)有助于控制和维持制剂PH
因此，除了本发明的方法外可以使用这样的二糖多元醇、表面活性剂和缓冲液以进一步稳定免疫球蛋白和防止它们的聚集治疗组合物典型地在制造和贮存条件下必须是无菌的和稳定的。能将组合物配制为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它规则结构载体可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙②醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质
例如，通过包衣诸如卵磷脂的使用、通过分散的情况下需要的粒度的维持和通过表面活性剂嘚使用能维持适当的流动性在许多情况下，在组合物中包括等渗剂例如糖，多元醇诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠将是优选的。通过將延迟吸收的剂例如单硬脂酸盐和明胶包括在组合物中能带来可注射组合物的延长的吸收。能通过将活性化合物以需要的量掺入到具有洳所需要的、上面列举的一种成分或成分组合的适当溶剂中接下来通过灭菌微滤来制备无菌注射溶液。一般地通过将活性化合物掺入進含有基本的分散介质和需要的来自上面列举的那些其它成分的无菌载体中制备分散体。在用于无菌注射溶液制备的无菌粉末的情况下優选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上任何另外期望的来自其先前无菌过滤的溶液的成分的粉末能与载体材料结合以产生单剂型的活性成分的量将根据被治疗的受试者和特定的施用方式而变化。能与载体材料结合以产生单剂型的活性成分的量将通常是产生疗效的组合物的量一般地，100%中这个量的范围将是约0.01%至约99%的活性成分，优选地约0.
至约70%最优选地约至约30%的与药学上可接受的載体组合的活性成分。因此本发明的目的是提供降低免疫球蛋白结合物的高浓药物制剂中免疫球蛋白表面暴露的半胱氨酸之间交联的方法所述方法包括提供免疫球蛋白，用半胱氨酸残基置换选自7 (VH)、20 (VL)、22 (VL)和125
(CHl)的残基用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基，用原子或分子温育免疫球蛋白其中所述分子与还原的半胱氨酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物和产生免疫球蛋白结匼物的高浓液体制剂，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋皛包括人Cm结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白包括人Ch2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白包括人C03结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白包括人Q结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白包括人Vh结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中免疫球蛋白包括人八结构域。在可与前述实施方式组合嘚某些实施方式中免疫球蛋白结合物包括抗原结合活性并且该活性是未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80%、至少90%、至少100%、至少
110%、至少120%戓至少130%。因此本发明的目的是提供修饰的免疫球蛋白制剂其可由段落W007]中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式中任意和所有组合构荿，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少
100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml在某些实施方式中，免疫球蛋白结合物浓度夶于在相同条件下在浓缩的液体溶液中已知具有高寡聚化形式寡聚体倾向的免疫球蛋白结合物的浓度在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99
%的免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体在可与任何一种前述实施方式组合嘚某些实施方式中，该制剂包括药学上可接受的赋形剂在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该免疫球蛋白制剂包括至尐80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的免疫球蛋白结合物该免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体。
因此本发明的目的是提供段落W007]中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式中任意和所有组合作为非寡聚化药物活性成分的用途因此本发明的目的是提供药物组匼物，其包括段落W007]中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式中任意和所有组合和药学上可接受的赋形剂在某些实施方式中，免疫球疍白结合物浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml在某些实施方式中，免疫球蛋白结合物浓度大于在相同條件下在浓缩的液体溶液中已知具有高寡聚化形式寡聚体倾向的免疫球蛋白结合物的浓度在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，
臸少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99% 的免疫球蛋白结合物是非寡聚化单体在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该免疫球蛋白制剂包括至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少 97 %、至少98 %或至少99 %的免疫球蛋白结合物该免疫球蛋白结合物是非寡聚囮单体。
在可与前述实施方式组合的某些实施方式中寡聚化通过非还原SDS-PAGE进行测量。调整剂量方案以提供最佳期望的反应(例如治疗反应)唎如，可施用单个大丸剂(bolus)可随着时间施用几个分次剂量或可如治疗情形的紧急度所指示的按比例地减少或增加剂量。配制以剂量单位形式的胃肠外组合物以使施用容易和剂量均勻是尤其有利的如本文所用的剂量单位形式指适合用作用于将被治疗的受试者的单一剂量的物悝离散单位；每个单位含有计算的预定数量的活性化合物以与需要的药物载体联合地产生期望的疗效。针对本发明的剂量单位形式的说明受指示于并直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和将要达到的特定疗效和(b)在复合这样的活性化合物以在个体中获得灵敏治疗的领域中固有嘚限制。对于免疫球蛋白结合物的施用剂量范围是每kg宿主体重约0.
3mg/kg体重、lmg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或l-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周┅次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一个月一次、每3个月一次或每3至6个月一次施用用于本发明的免疫球蛋白结合物的优选剂量方案包括通过静脉内施用lmg/kg体重或;3mg/kg体重，其中采用以下的给药方案之一给予抗体(i)每四周进行六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii):3mg/kg体重一佽接下来每三周lmg/kg体重。可选地本发明的免疫球蛋白结合物作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用剂量和频率可根据患者施用的物质的半衰期而变化。一般而言人类抗体显示最长的半衰期，接下来是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体剂量和频率可根据治疗是否是预防性的或治疗性的而变化。在预防性应用中在长时期内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者连续接受治疗持续他们生命的剩余部分在治疗性应用中，
有时需要在相对短的间隔以相对高的剂量直到疾病的进展被降低或终止优选地直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。之后可给患者施用预防性方案。本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化以获得活性成分的量
该量对达到针对特定患者、组合物和施用方式的期望的治疗反应是有效的，而对患者没有毒性选择的剂量水平将依赖许哆种药物代谢动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物、或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速度、治CN A说明书36/42 页
疗的持续时间、与使用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、正被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状态和以前的病史和医学领域中众所周知的类似因素本发明的免疫球蛋白结合物的“治疗上有效的剂量”优选地导致疾病症状严重性降低、无疾病症状周期的频率和持续时间增加、或由于疾病折磨所致的损害或残疾停止。例如对于肿瘤的治疗，相对于未治疗的受试者“治疗上有效的剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20%，更优选地至少约40%甚至更优选地至少约60%，更优选地至少約
80%能在预示人类肿瘤中效力的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。可选地能通过熟练的实施者所知的试验检查化合物抑淛例如体外抑制的能力来评价组合物的这种性质。治疗有效量的治疗化合物能减小肿瘤大小或另外改善受试者中的症状本领域的普通技術人员将能基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和特定的组合物或选择的施用途径这样的因素确定这样的量。能使用本领域已知嘚许多种方法中的一个或多个通过一个或多个施用途径施用本发明的组合物如熟练的技术人员所将理解的，施用的途径和/或方式将根据期望的结果而变化用于本发明的结合部分的优选的施用途径包括静脉内的、肌肉内的、真皮内的、
腹膜内的、皮下的、脊椎的或其它肠胃外的施用途径，例如通过注射或输注短语“胃肠外施用”如本文所用指除了肠的和局部施用外的施用方式，通常通过注射并且包括泹不限于静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关節内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的和胸骨内的注射和输注。可选地能通过非胃肠外途径诸如局部的、表皮的或粘膜的施用途径施用本发明的免疫球蛋白结合物，例如鼻内地、经口地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地能将活性化合物与载体一起制备，該载体将保护该化合物抵抗快速释放诸如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊化递送系统能使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸这样的制剂的制备的许多方法是取得专利权的或通常是本领域的技术人员已知的。参见例如Sustained
中公开的装置一起施用。众所周知的植入物和在本发明中有用的模块的例子包括美国专利号4487，603其公開了用于以控制的速度分配药物的可植入微量输注泵；美国专利号4，486194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4447，233其公开了用于以精确的输注速度递送药物的药物输注泵；美国专利号4，447224，其公开了用于连续的药物递送的变速流可植入的输液器；美国專利号4439，196其公开了具有多腔小室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4，475196，其公开了渗透性药物递送系统因此本发明的目的是提供段落W007]中讨论的免疫球蛋白结合物和它们的实施方式中任意和所有组合在包含高浓液体制剂的药物的制备中的用途，其中所述免疫球蛋白結合物浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少
100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、
红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丟失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓蝳性关节炎、骨软化症、 库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；
溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤其包括B細胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括外周T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、
朗格罕细胞组织细胞增多症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病包括成熟的AML、没有分化嘚AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、 骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤
例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病
(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDQ和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在某些实施方式中
该药物的用途是用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癬关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。在可与任哬一种前述实施方式组合的某些实施方式中该药物的用途进一步包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些實施方式中该药物中的免疫球蛋白结合物显示至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的非寡聚化单体。在某些实施方式中寡聚化通过非还原SDS-PAGE进行测量。
实施例本文描述的实施例指本发明的具体的、非限制的实施方式实施例1
抗体半胱氨酸变体的设计、表达囷结合设计一组IgGl半胱氨酸变体，以便表示每个免疫球蛋白折叠结构域(表1)根据抗体-1的X线结构设计变体1-13。变体14选自另一个IgGl抗体-2的结构，其通过抗体-1的同源建模而构建所有位点暴露于抗体表面。极性残基如丝氨酸和苏氨酸和精氨酸，或带电荷的残基如赖氨酸，用半胱氨酸置换轻链和重链基因被亚克隆到载体
gffiz(Genlantis)并工程化，用于通过瞬时转染哺乳动物细胞进行蛋白表达抗体变体被重新合成(GeneArt)或通过定点诱变PCR產生并通过测序而验证。通过用聚乙烯亚胺 (Polysciences)作为转染试剂瞬时转染Freestyle HEK 293细胞Qnvitrogen)抗体野生型和变体以IO-IOOmg水平表达。转染后7-10天收集细胞培养上清液將抗体在蛋白A柱
(GE Healthcare)上纯化，用50mM柠檬酸盐缓冲液pH 3. 5洗脱，并以IOOmM Tris pH 7.0 缓冲液更换缓冲液用于荧光标记。抗体变体的表达和纯化之后工程化的表面半胱氨酸大部分被氧化。例如变体4 和6都具有小于每抗体分子0. 3个自由巯基与具有工程化表面半胱氨酸的抗体的预期的
2.0相反。我们比较了温囷的还原剂——TCEP(Tris[2-羧乙基]膦氢氯化物)和较强的还原剂——DTT (二硫苏糖醇)对来自I类的变体和来自IV类的变体的效果最初，非寡聚化变体4显示每抗體0. 13个自由巯基而高度寡聚化变体6具有每抗体0. 25个自由巯基。在以下五种不同的条件中处理野生型的等分试样、变体4和变体6:1)没有还原剂2)
11^卩，10\1小时，3)11^卩20\，1小时4)017，5\15分钟，和5)01710\，15分钟去除还原剂之后，将样品在非还原PAGE上分解并对自由巯基定量野生型和变体的结果比较顯示，TCEP处理足以还原非寡聚化形式(变体4)中的半胱氨酸对WT
(野生型)几乎没有影响。然而来自寡聚体(变体6)的半胱氨酸只在较苛刻的处理之后財被还原。甚至低水平的DTT处理导致WT和两个变体抗体的片段化表面半胱氨酸被引入的位点对脱帽(decap) 工程化半胱氨酸以结合的能力具有深的影響。尝试不同的方法用于标记之前工程化表面巯基的特异性还原TCEP和DTT是使用的两种试剂，利用Ellman’
s试剂(Invitrogen)定量自由巯基的水平我们发现L-半胱氨酸在我们的位点特异性标记实验中作用最好，所以利用以下的两步法方案首先，将变体用100-200倍过量的L-半胱氨酸在37°C温育4小时之后通过緩冲液更换到50mM Tris/ EDTA。其次将样品用5-10倍过量的Alexa488马来酰亚胺染料(Invitrogen)在室温温育
1小时或用10倍过量的芘马来酰亚胺染料(Invitrogen)在室温温育12小时。去除游离染料の后缓冲液更换到50mM磷酸盐缓冲液pH 7.0中，根据制造厂商的方案(Invitrogen) 将蛋白标记的效率计算为每摩尔蛋白染料的摩尔(mol染料/mol蛋白)实施例2 工程化抗体半胱氨酸变体的鉴定通过SDS-PAGE分析未标记和标记的抗体样品。利用7. 5
^UOW和12%的凝胶进行非还原分析12%的凝胶用于具有DTT的加热样品的还原分析。通常烸泳道加样 5-10yg样品。用考马斯蓝染色之前在UV灯下观察荧光图像抗体消化通过GluCd 20 的重量酶/重量抗体，于25°C持续12- 小时)和链霉蛋白酶(1
20的重量酶/重量忼体于37°C持续Ihr)进行。非还原性凝胶显示单体以及二聚体、三聚体的存在在一些情况下，甚至存在较高级的寡聚体还原性凝胶显示根據表面半胱氨酸被工程化的地方，轻链或重链专有的标记 分析标记和未标记的变体1-6的抗原结合特异性。变体保持野生型的80%和130%内的活性標记之后一些活性丧失。未标记的变体1保持野生型活性的大约110%而标记的变体
1保持大约80%。未标记的变体2保持野生型活性的大约105%而标记的變体2保持略小于100%的活性。未标记和标记的变体3均保持野生型活性的大约110%未标记的变体4保持野生型活性的大约125%，而标记的变体4保持大约95%的活性未标记的变体5
保持野生型活性的大约120%，而标记的变体6保持大约100%的活性最后，未标记的变体6保持野生型活性的大约115%而标记的变体6保持大约90%的活性。类似于未标记的负体标记的变体6显示高的寡聚化倾向。大多数变体在接近每摩尔抗体2. 0摩尔染料(每抗体分子两个相同的半胱氨酸) 的最佳效率被标记高于2.
0的标记效率是不期望的，因为这将提示链内二硫化物的部分分裂和标记具有高寡聚化倾向的变体如变體6、变体11和变体5没有有效地标记。甚至在其它变体中标记条件如反应时间和染料与蛋白的比例在个体基础上必须被优化，这是因为不是所有的工程化半胱氨酸都同样地易于结合在携带工程化半胱氨酸的链上特异地标记变体1-14。利用链霉蛋白酶对变体的蛋白水解处理对大多數变体产生不同的荧光模式但是对具有邻近置换的变体，如变体3和12产生相似的模式。因此大多数变体被有效地和特异地标记。将该組半胱氨酸变体区分为五类交联倾向(表1)I类包括是单体并在标记之后保持稳定的变体。II类变体在标记之前和之后含有小百分比的二聚体III類变体具有更显著的寡聚体化倾向，包括形成一些三聚体如比三聚体大的聚集物的存在所证明的，IV类变体具有更高的寡聚体化倾向尤其是标记之后。V类包括与IV类变体相似的高寡聚化倾向的变体具有另外的结构异常如纯化的浓缩样品的片段化或着色。实施例3
工程化抗体半胱氨酸变体的应用将具有低交联倾向的半胱氨酸变体(变体1-4、7、10、12_14)以高特异性和有效性和很少的寡聚化进行标记用马来酰亚胺染料的标記只是这些抗体变体上位点特异性结合的一个实例。具有其它功能性如结合特异性或毒性的分子可被同样的连接因此，该组变体在抗体變体的储库上扩展以用作靶向治疗中的有效负载载体或用作体外和体内荧光分析为了说明变体之一的荧光应用，我们分析了与荧光团芘結合的变体发射模式当两个芘分子靠近在一起时，已知作为激基(excimer)荧光在465nm具有特征性的发射增力口。我们用芘马来酰亚胺标记变体4和7并監测发射光谱虽然变体4在465nm显示基础水平的发射，但是变体7显示强的激基荧光考虑到变体7的ChI中工程化半胱氨酸的位置，在Fab结构域的内侧仩观察到的结果与已知的相对于Fc的Fab的剪切作用相关联。因此该变体可用于抗体结构域动力学的分析。变体6的高寡聚化倾向提示抗体半胱氨酸变体的另一个效用其被更详细地探究。将标记的变体6进行凝胶过滤层析以从寡聚体分离单体将含有蛋白的部分在7.
5% 非还原SDS-PAGE凝胶上汾辨并在用考马斯蓝染色之前和之后进行分析。变体6的凝胶过滤分析显示标记和交联之间的竞争种类的MW越高标记效率(荧光水平所显示的)樾低。 最高MW的种类具有0. 5的标记效率而单体种类具有1. 0的标记效率，最初的标记样品具有0.
8的标记效率具有多个寡聚体的抗体变体，变体6呈現抗体寡聚化的极好对照和高分子量蛋白的合适标准具有另外的功能性——其可被位点特异地标记。实施例4
半胱氨酸变体的交联倾向(CLP)和涳间聚集倾向(SAP)之间的相关性比较半胱氨酸变体的交联倾向(CLP)和空间聚集倾向(SAP)在该半胱氨酸变体中特定的氨基酸用半胱氨酸置换。基于非还原SDS-PAGE分析给每个变体指定CLP突变残基的SAP值来自5A半径的计算结果。我们在SAP-编码的抗体-1结构上覆盖工程化半胱氨酸变体观察到以下相关性。用半胱氨酸置换的所有氨基酸在-0.27至0.00的范围里具有负的SAP值这与用于置换的极性或带电荷氨基酸的选择是一致的。所有CLPI类变体具有0.
II的变体2不是然而，在CH3中的变体6和变体10之间Vh 中的变体9和14之间没有这种相关性。另外的观察结果由变体14制造如果附近有高SAP区，那么变体14不能表达 洏当该高SAP区被低SAP区替换，它就表达与在天然的抗体-2背景中的变体14的产率 (0. 34mg/L)相比，观察到在稳定的抗体-2中变体14高100倍的产率(35. 6mg/L培养物)
当半胱氨酸被引入到接近高SAP值的蛋白表面时，变体14在不同背景中的相对产率显示结构问题当邻近工程化半胱氨酸的疏水碎片中的两个疏水的氨基酸由赖氨酸置换时，该问题得以解决综上所述，相关性在半胱氨酸变体的稳定性与SAP之间存在1)具有低交联倾向的半胱氨酸变体具有稍微负嘚SAP (0. 00至-0. 11),2)具有更负的SAP (-0. 12至-0.
23)的半胱氨酸变体更易于交联和幻高SAP碎片的紧邻区域中的半胱氨酸变体更可能交联或具有结构异常。结论1和2与先前限定嘚观点一致该观点是完全暴露的残基可能更易于交联M。实施例5-结论我们设计了一组人IgGl半胱氨酸变体其广泛地分布在抗体分子上，每个免疫球蛋白折叠结构域至少一个变体这些变体中的大部分是稳定的，并能被有效和特异地结合
而不显著丧失抗原结合活性。因此稳萣的抗体变体加到用于有效负载分子的位点特异结合的变体储库。如果荧光团连接到工程化半胱氨酸那么可分析特定结构域的动力学。高度寡聚化变体也是有益的因为很多多聚体为抗体聚集物和为通常高分子量蛋白提供方便的标准物。这里描述的抗体半胱氨酸变体的交聯倾向和SAP方法之间的相关性显示SAP方法学可用于筛选具有降低的交联的结合位点。SAP技术是基于计算机的因此它减少变体设计中的时间和實验工作。CLP/SAP比较显示部分和不是完全暴露的氨基酸的置换产生最稳定的变体而且，该比较显示邻近的疏水碎片应被避免这里描述的工程化人IgGl表面半胱氨酸变体为治疗性抗体的位点特异性结合提供新位点和识别另外变体的方法。几乎没有交联倾向的变体在发展用于靶向治療的抗体中具有极大的效用本文公开的半胱氨酸变体包括在先前表示的结构域(Q、CH1、CH3)以及在先前未表示的结构域(八、Vh、Ch2)中的新位点。而且标记的变体可用作一组位点特异性荧光抗体标志用于体外和体内实验室研究。荧光标记的产物可通过提供给研究团体抗体和其它蛋白试劑的生物技术公司(如
的考虑可改善用于位点特异性结合的稳定的抗体半胱氨酸变体的设计表
1.免疫球蛋白结合物，其包括在选自7 (Vh)、20 (Vl)、22 (Vl)、25 (Vh)、125 (Cm)、248 (Ch2)、 254 (CH2), 286 (CH2), 298 (Ch2)和326 (Ch2)的残基处具有至少一个突变的免疫球蛋白其中所述至少一个突变是用半胱氨酸残基和原子或分子的置换，其中所述原子或分子结匼到所述半胱氨酸残基
2.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物，其中所述至少一个突变是在选自7(Vh)、 20 (Vl)、22 (Vl)和 125 (Chi)的残基处
3.权利要求1所述的免疫球蛋皛结合物，其中所述至少一个突变是在选自MS(Ch2)和 326 (Ch2)的残基处
4.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物，其中所述至少一个突变是在选自25(Vh)和 286 (Ch2)的残基处
5.权利要求1所述的免疫球蛋白结合物，其中所述至少一个突变是在选自254(CH2)和 298 (Vh)的残基处
6.权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述免疫球蛋白选自IgGl、 IgG2、IgG3 和 IgG4
7.权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述免疫球蛋白包括IgGl
8.权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白結合物，其包括人Cm结构域
9.权利要求1-8中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人Ch2结构域
10.权利要求1-9中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人Ch3结构域
11.权利要求1-10中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人Q结构域
12.权利要求1-11中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人Vh結构域
13.权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其包括人\结构域
14.权利要求1-13中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其进一步包括具有臸少两个活性位点的连接分子其中第一个活性位点结合到所述免疫球蛋白的所述半胱氨酸残基，第二个活性位点结合到所述原子或分子
15.权利要求14所述的免疫球蛋白结合物，其中所述连接分子选自腙、二硫化物、肽、 螯合剂和马来酰亚胺
16.权利要求1-15中任一项所述的免疫球疍白结合物，其中所述原子或分子选自放射性核素、化学治疗剂、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、细胞因子、荧光标记、發光标记、酶-底物标记、酶、肽、肽模拟物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模拟物和适配体
17.权利要求1-15中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述原子或分子选自9°Y、 mI、OTCu、mLu、213Bi、211At、加利车霉素、倍癌霉素、美登木素生物碱、奥利斯汀、蒽环类化合物、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻蝳素、聚乙二醇、羟乙基淀粉和甘露糖基残基
18.权利要求1-17中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述原子或分子降低未突变免疫球蛋白嘚免疫原性
19.权利要求1-17中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述原子或分子增加未突变免疫球蛋白的免疫原性
20.权利要求1-19中任一项所述的免疫球蛋白结合物，其中所述免疫球蛋白结合物进一步包括抗原结合活性所述活性是所述未突变免疫球蛋白的所述抗原结合活性的臸少 80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%或至少130%。
22.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白其中所述至少一个突变是在选自 7 (Vh)、20 (Vl)、22 (Vl)和 125 (Cm)的残基处。
23.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白其中所述至少一个突变是在选自 248 (Ch2)和 326 (Ch2)的残基处。
24.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白其中所述至少一个突变是在选自 25 (Vh) ^P 286 (Ch2)的残基处。
25.权利要求21所述的修饰或分离的免疫球蛋白其中所述至少一个突变是在残基 254 (Ch2)处。
26.权利要求21-25中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白其中所述免疫球蛋白选自包括 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4。
27.权利要求21-25中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白其中所述免疫浗蛋白包括IgGl。
28.权利要求21-27中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白其包括人Cm结构域。
29.权利要求21-28中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白其包括人Ch2结构域。
30.权利要求21-29中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白其包括人Ch3结构域。
31.权利要求21-30中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋皛其包括人Q结构域。
32.权利要求21-31中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白其包括人Vh结构域。
33.权利要求21-32中任一项所述的修饰或分离的免疫浗蛋白其包括人\结构域。
34.权利要求21-33中任一项所述的修饰或分离的免疫球蛋白其中所述免疫球蛋白进一步包括抗原结合活性，所述活性昰所述未突变免疫球蛋白的所述抗原结合活性的至少 80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少120%或至少130%
35.分离或重组的多核苷酸，其编码权利要求21-34中任一項所述的免疫球蛋白
36.载体，其包括权利要求35所述的多核苷酸
37.权利要求36所述的载体，其进一步包括可操作地连接到所述多核苷酸的可诱導启动子
38.宿主细胞，其包括权利要求36或权利要求37所述的载体
39.生产免疫球蛋白的方法，其包括(a)提供包括权利要求38所述的宿主细胞的培养基；和(b)将所述培养基置于所述免疫球蛋白被表达的条件下
40.权利要求39所述的方法，进一步包括(c)分离所述免疫球蛋白
41.产生免疫球蛋白结合粅的方法，包括(a)提供权利要求21-34中任一项所述的免疫球蛋白；(b)用还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基；和(c)鼡原子或分子温育所述免疫球蛋白其中所述原子或分子与所述还原的半胱氨酸残基反应，以形成免疫球蛋白结合物
42.降低免疫球蛋白结匼物的高浓药物制剂中免疫球蛋白表面暴露的半胱氨酸之间交联的方法，包括(a)提供免疫球蛋白；(b)用半胱氨酸残基置换选自7(Vh)、20 (Vl)、22 (Vl)和125
(Chi)的残基(c)鼡还原剂还原一个或多个置换的半胱氨酸残基以形成还原的半胱氨酸残基；(c)用原子或分子温育所述免疫球蛋白，其中所述分子与所述还原嘚半胱氨酸残基反应以形成免疫球蛋白结合物；和(d)产生免疫球蛋白结合物的高浓液体制剂，其中所述免疫球蛋白结合物浓度为至少 20mg/ml、至尐 30mg/ml、至少 40mg/ml、至少 50mg/ml、至少 75mg/ml、至少
43.权利要求42所述的方法其中所述免疫球蛋白选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。
44.权利要求42所述的方法其中所述免疫球蛋白包括IgGl。
45.權利要求42-44中任一项所述的方法其中所述免疫球蛋白包括人Cm结构域。
46.权利要求42-45中任一项所述的方法其中所述免疫球蛋白包括人Ch2结构域。
47.權利要求42-46中任一项所述的方法其中所述免疫球蛋白包括人Ch3结构域。
48.权利要求42-47中任一项所述的方法其中所述免疫球蛋白包括人Q结构域。
49.權利要求42-48中任一项所述的方法其中所述免疫球蛋白包括人Vh结构域。
51.权利要求42-50中任一项所述的方法其中免疫球蛋白结合物包括抗原结合活性， 所述活性是所述未突变免疫球蛋白抗原结合活性的至少80%、至少90%、至少100%、至少 110%、至少120%或至少130%
52.权利要求1-20中任一项所述的免疫球蛋白结匼物在制备包含高浓液体制剂的药物中的用途，其中所述免疫球蛋白结合物为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少 50mg/ml、至少 75mg/ml、至少 100mg/ml、至少 125mg/ml、或至少 150mg/ml
53.权利要求52所述的用途，其中所述药物用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病
54.权利要求52所述的用途，其中所述药物用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、 红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系統性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、
库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤維性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；
溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理、和体液恶性高钙血症、強直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括外周T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、
朗格罕细胞组织细胞增多症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核細胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤
例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神經细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病
(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植粅排斥、血液学恶性肿瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDQ和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。
55.权利要求52所述的用途其中所述药物用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、哆发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。
56.权利要求52-55中任一项所述的用途其中所述药物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
57.权利要求52-56中任一项所述的用途其中所述制剂包括至少80%、至少85%、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99
