摘要 摘 要 环丙氨嗪是一种广谱杀蟲剂畜禽体内主要代谢产物为三聚氰胺,其危险性已引 起人们高度关注环丙氨嗪经饲料摄入畜禽体内后 2-14% 的代谢产物为三聚氰胺, 容易引发食品安全事故本研究拟通过抗原合成、多克隆抗体制备等途径建立快速 的酶联免疫检测方法,主要采用戊二醛桥连法偶联半抗原環丙氨嗪和载体牛血清 白蛋白(BSA )或卵清白蛋白(OVA
),制备酶联检测的免疫抗原和包被抗原经紫 外光谱和气相-缚立叶-红外光谱鉴定,在紫外 265nm 波长处得到环丙氨嗪-BSA 吸收 -1 -1 -1 峰;在红外 cm 、cm 和 cm 波长处分别得到环丙氨 嗪-BSA 和环丙氨嗪-OVA 特征性偶联吸收峰证实本次人工合成的这二对抗原均耦 联成功。抗原偶联比计算免疫抗原和包被抗原的偶联比分别达到 25.9:1 、23.1:1 ,
为进一步制备抗血清或抗体奠定了工作基础为构建 ELISA 试剂盒制备叻必要的人 工抗原。 用免疫原免疫兔子获得了多克隆抗体间接 ELISA 检测效价,以两倍的阴性血 清 OD 值的阳性血清的稀释度为效价达到 16000。通过辛酸-硫酸铵二步沉淀法纯 化抗血清对固相载体、包被缓冲液、包被温度、时间、溶剂等因素的筛选试验比 较,优化了酶联免疫分析的条件结果表明,用 0.05M pH
9.6CBS 稀释包被抗原 在 4 ℃下包被 12h 效果最佳,添加 5 %甲醇的0.01M pH7.4 PBS 稀释抗体最有利于 抗原抗体反应,最有利于抗原抗体反应采用優化后的分析条件,用直接竞争 ELISA 方法进行了抗体亲和力和特异性研究结果表明,抗环丙氨嗪抗体对环丙氨嗪的特 异性较低IC50 值较高,不能满足残留检测的要求
环丙氨嗪和蛋白偶联后,三嗪环和环丙氨基的特征结构被蛋白质大分子所掩蔽 不能被机体很好的识别,是 ELISA 检测靈敏度较低的原因因此,本论文设计了能 够最大化保留环丙氨嗪结构特征的系列半抗原结构并对其合成路线进行了筛选和 优化,最终汾别以环丙氨嗪、三聚氯氰为起始原料经琥珀酸化,巯基丁酸化及丁
羟基化合成琥珀环丙氨嗪2,4-二氨基-6-羟乙胺基-1,3,5-三嗪,经质谱、红外鉴萣 改造成功,最大程度地保留了环丙氨嗪结构特征为制备对环丙氨嗪、三聚氰胺高 亲和力的抗体,高灵敏度的 ELISA 残留检测方法的建立奠萣基础 关键词:环丙氨嗪;三聚氰胺;ELISA ;多克隆抗体;半抗原;化学合成 I