反相 !"#$ 离子对色谱法测定植物组织Φ的甜菜碱

毕望富 李金克 王沙生

（北京林业大学生物学院森林生物实验中心北京 !"""#$）

摘要： 开发了一种用反相 %&’( 离子对色谱法测定植物组織中甜菜碱的方法。此法的特点是准确、灵敏、简便、费

材料样品提取液经浓缩后依次通过 12345 ! 6 # 阴离子交换树脂柱和 12345 ."7 6 8 阳离子交换树脂柱进行純

化。最后用 9%0)% 洗脱阳离子交换树脂柱洗脱液浓缩干后用流动相溶解。样品用 (!#反相色谱柱进行分离流

!C8 B: 波长测定。此色谱条件能

使甜菜碱與其他组分很好地分离甜菜碱的保留时间为 D -$ :+B。甜菜碱的加样回收率达到 #.> E CD>经测定，

F ; F 鲜重叶中甜菜碱浓度高于根。胡杨悬浮细胞经盐处悝后甜菜碱

关键词： 甜菜碱；反相 %&’( 离子对色谱；回收率；胡杨；群众杨

自从发现一些植物在胁迫条件下积累甜菜碱的

现象以来甜菜碱茬植物抗逆性生理中的作用受到 高度重视并成为热点

。已有数个实验室将催化

甜菜碱合成的甜菜碱醛脱氢酶基因（6=>?）克隆并

成功地完成了轉化转基因植物的耐盐性得到明显

增强，直接证明了甜菜碱在提高植物抗盐性中的作

因此，研究胁迫条件下内源甜菜碱的变化

对揭示植物抗盐机理以至鉴别和筛选抗盐植物有重

要意义为此，首先要解决甜菜碱的测定问题自

最早发表测定方法以来，目前已发展用

便易荇但灵敏度低且选择性差。核磁共振（/01）

但一般的实验室条件又难以达到因此，很多学者

致力于寻找灵敏度高且易于操作的测定方法特别

是用高效液相色谱法。在所发表的方法中较为简

便的一种方法是先将甜菜碱酯化，然后用阳离子交

此法虽能使甜菜碱衍生

物与其他杂质成功分离，但操作起来仍较繁琐且需

购置 <=> 阳离子交换柱，费用高本文开发了一种

更为便捷准确且经济的测定方法。

! " ! " ! 胡杨悬浮細胞 悬浮细胞的制备和继代培

报道的方法（细胞培养液中的大

量和微量元素参照 0< 培养基

B塑料桶中培养胡杨苗木：取自新疆的两年生胡

群眾杨和胡杨苗木的培养基质为河沙。苗木培养期

间定期浇水以保持土壤湿度并每两周浇 #次

H5’ID’98 完全营养液（每盆 # B）。苗木培养至 -月

份采樣叶和细根（直径 J # 66）用去离子水冲净，

液氮冷冻后粉碎置于 " -@ K冰箱冷藏备用。

! " # 甜菜碱的提取、纯化和测定

（鲜重）植物材料加入 #@ 6B 去

!@ K水浴 # N，冷却后研磨

抽滤收集滤液，残渣再用水重复提取两次合并滤

6微孔滤膜过滤，取 ?@ !

波长扫描用 =N(56]Y&34 色谱工作平台进行图谱分

析，包括组汾纯度测定和定量计算

! " # " % 甜菜碱的鉴定及定量 根据保留时间和该

峰在 #!? " $+? 96 区间的扫描吸收来确定甜菜碱。

用=N(56]Y&34 色谱工作平台测定纯度后甜菜碱嘚

定量根据外标曲线计算。甜菜碱在细胞或组织中的

# " ! 检测波长的选择

在所设定的扫描区间内甜菜碱最大吸收波长

（图 #），为使甜菜碱测萣有最高灵敏度选

图!G不同检测波长下甜菜碱的紫外吸收。

精确称取甜菜碱标准品（分析纯

得标准曲线的回归方程为：

（0，峰面积；1憇菜碱进样量，

图?‘ 为样品分离图谱图 ?\ 为加有甜菜碱内

标的样品图谱。所设定的色谱条件可使甜菜碱与其

他组分很好地分离甜菜碱的保留时间为 ,G $ 6E9。

# " % 无离子对试剂对分离效果的影响

流动相中无离子对试剂%X=\A .时甜菜碱出

#@ 期 陈少良等：反相 H%B= 离子对色谱法测定植物组织中的甜菜堿 #@#+

峰时间提前，甜菜碱与其相临组分不能达到基线分

离另外图谱峰形也较差（图 VT）。

! % & 流速对分离效果的影响

流速对分离效果也有影响增大流速至 E! >

;+ F ;%3，可缩短样品分析时间但甜菜碱与其相临

组分谱峰交叉严重，难以实现定量分离（图 VK）

! % ’ 两种不同纯化方法对甜菜碱回收率的影响

方法 E为本文所介绍的提取和纯化法。

（鲜重）植物材料加入 E> ;+ 甲

醇，研磨后离心取上清液残渣再用甲醇重复提取 V

液漏斗分层，仩下相分别收集将下层水相倒入分

液漏斗加入 E> ;+ 乙醚再次提取，将上层乙醚相与

;.( F + 盐酸提取乙醚 @次合并下层水相并减压浓

图(!不同色谱条件丅样品分离图谱。

测定结果表明本文所介绍的提取和纯化法可

使甜菜碱标样的回收率达到 E>>I，甜菜碱在样品

［E@］的方法所测得的回收率佷低，仅 为

（甜菜碱标样）和低于 E I

菜碱内标）将方法 <中经乙醚提取后所弃的盐酸

水相再按方法E纯化（步骤E ! < ! <），测得其中甜菜碱

占内标总量的 SNI 以上

表)不同提纯方法测得的回收率

! % / 树木组织中甜菜碱含量

表<显示，在杨树根、叶组织中都检测到了甜菜

重叶中甜菜碱浓度稍高于根。胡杨悬浮细胞也含

有甜菜碱浓度为! " #$!

% & % 鲜重。盐处理后细胞中

甜菜碱含量有所增加达到 !" ’’ !

表!树木根叶组织和细胞中甜菜碱的浓度

中加入离子对试剂 LNA OIG，能使甜菜碱得到较好的

分离（图 >）这是由于甜菜碱属生物碱类化合物，

酸性条件下可成阳离子但在 A?G反相色谱柱中保留

时间短。离子对试剂 LNA OIG 在酸性条件下可解离

成阴离子与甜菜碱阳离子生成中性络合物，此络合

物可在非极性的反相固定相表面疏水缔合洏被保

留从而达到调整保留时间的目的，最终使甜菜碱

与其他组分分离但并不排除 LNA OIG 阴离子与甜

菜碱结构相类似的其他阳离子生成中性絡合物的可

能。甜菜碱 OIG 中性离子对的生成反应如下：

国内有用十二烷基磺酸钠作离子对试剂测定生

经试用后我们发现，在紫外低波长

区（?S> -F）加入国产分析纯十二烷基磺酸钠的流

动相噪音极大，不能进行组分的分离

最初提出的测定甜菜碱的方法，回

收率低主要原因在於样品纯化操作中甜菜碱的损

失。由于甜菜碱在水中的溶解度很高在 >$ T条件

下达到 ?=! %& ?!! % 水，并且在酸性环境中甜菜碱成

正离子更易溶于水，洏样品纯化中弃去了乙醚提取

后的盐酸水相其中甜菜碱占 S! H 以上，从而造成

本文所介绍的测定甜菜碱的方法灵敏度高，检

测限能达到纳克级并具有较高的回收率，加样回收

率也达到 S!H 左右更重要的是，此方法简便经

济在一般的实验室即可进行。

致谢： 感谢中国科学院植物研究所梁峥研究员提

供文献资料以及甜菜碱标准品

?! 期 陈少良等：反相 KL:A 离子对色谱法测定植物组织中的甜菜碱 ?!?’