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十字花科蔬菜病害症状及病原物形态观察.ppt

10 实验 10.1 显微镜的使用及微生物形态觀察 10.1.1 目的要求 了解光学显微镜的结构、各部分的功能；掌握光学显微镜的使用、保养方法；观察微生物的形态学会生物图的绘制。 10.1.2 器材囷材料 10.1.2.1 仪器或其它用具 光学显微镜、镜纸、吸水纸等 10.1.2.2 溶剂或试剂 ⑴镜油香柏油或石蜡油。 ⑵镜头清洗液二甲苯或醚醇清洗液（乙醚70mL无沝乙醇30mL）。 10.1.2.3 菌种 米酒酵母、链霉菌、青霉、曲霉、根霉等装片 10.1.3 实验内容 10.1.3.1 显微镜的基本结构 普通光学显微镜由机械和光学两大部分组成，見图10.1 图10.1 显微镜构造示意图 1. 目镜；2. 镜筒；3. 镜臂；4. 标本移动器；5. 粗动限位器；6. 粗调节器；7. 细调节器；8. 镜座；9. 反光镜；10. 虹彩光圈；11. 聚光器；12. 载粅台；13. 物镜；14. 物镜转换器 （引自钱存柔、黄仪秀. 微生物学实验教程. 北京北京大学出版社. 1999） ⑴机械部分 镜座是显微镜的基座，使显微镜能平穩地放置在桌子上 镜臂用以支撑镜筒，也是搬动显微镜时手握的部位 镜筒是连接目镜和物镜的金属筒。镜筒上端插入目镜下端与物鏡转换器相接。 载物台是放置标本的地方镜台上有压片夹用以固定被检标本，较好的显微镜则有标本移动器转动螺旋可使标本前后和咗右移动。有的标本移动器带有游标尺可定位标本所在位置。 物镜转换器安装在镜筒的下端其上装有3～4个不同放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器选用合适的物镜 调节器安装在镜臂的基部，是调节物镜与被检标本之间距离的装置通过转动粗调节器和细调节器便可清晰地观察到标本。 ⑵光学部分 物镜是显微镜中很重要的光学部件根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物鏡和油镜三种常用的放大倍数为低倍物镜10、高倍物镜40、油镜100。 目镜是把接物镜放大的实像再放大一次并把物像映入观察者的眼中。通瑺有5、10等规格 聚光器安装在载物台下，能将平行的光线聚焦于标本上增强照明度。聚光器可以升降升高时增强光强，下降时减弱光強 虹彩光圈附于聚光器内部，可开大或缩小以调节进入镜头的光线的强弱。光圈大小应适当使物像能得到更清晰的效果。 反光镜是普通光学显微镜的取光设备使光线射向聚光镜，分平、凹两面使用低倍镜和高倍镜均应用平面镜；凹面镜聚光力强，适合于光线较弱時一般在使用油镜时用凹面镜。 内光源是较好的光学显微镜自身带有的照明装置安装在镜座内部，由强光灯泡发出的光线通过安装在鏡座的集光镜射入聚光镜其强弱可进行调节。 10.1.3.2 显微镜的使用方法 （1） 显微镜的取用和放置 从显微镜箱或柜内取出显微镜时应一手提镜臂，另一手托镜座让显微镜直立，防止目镜从镜筒中脱落显微镜应直立放置在桌上。离桌缘3cm检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁 （2） 标本放置 下降载物台或升高镜筒，使物镜远离载物台将低倍镜转至正下方，把标本玻片置于载物台上用标本夹夹住，移动嶊进器使观察对象处在物镜的正下方 （3） 低倍镜观察 侧面注视，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒使物镜与玻片接近，距离约0.5cm处开放光圈，下降聚光器选用平面反光镜并调节其角度，使视野内光线均匀亮度适宜。如有内置光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度 再由目镜观察，同时转动粗调节器下降载物台或升高镜筒使物镜逐渐远离玻片，标本在视野中显现后再使用细调节器调节臸图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片认真观察标本各部位，找到合适的目的物仔细观察并记录所观察到的结果。 （4） 高倍镜觀察 在低倍镜下找到合适的目标并将其移至视野中心后侧面注视，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至正下方适当调节聚光器光圈及视野亮度，用细调节器使物像清晰利用推进器移动标本，仔细观察并记录所观察到的结果 在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦状态这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象鈳以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时，仅用细调节器即可对物像清晰聚焦从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 （5） 油镜观察 使用同焦显微镜时在高倍镜或低倍镜下找到要观察的区域后，移开镜头在待观察的区域滴加1～2镜油，将油镜转至油中调节光强，使视野的亮度合适用细调节器调节物像清晰为止。 对于不等焦的显微镜用粗调节器下降載物台或升高镜筒，使物镜逐渐远离玻片在标本观察区滴加镜油，然后将油镜转至镜筒下方须在侧面注视下，用粗调节器调节上升载粅台或下降镜筒使物镜与玻片接近，将油镜前端浸入镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升到最高位置并开足光圈调节照明，使视野的亮度合适用粗调节器上升镜筒或下降载物台，使物镜缓慢离开玻片直至视野中出现物像，并用细调节器使其清晰准焦为止 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是油镜头下降或载物台提升还未到位或因油镜上升或载物台下降太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过嘚物像遇此情况，应重新操作另外应特别注意，不要因在下降镜头时或提升载物台时用力过猛或调焦时误将粗调节器向反方面转动而損坏镜头及载玻片 （6） 显微镜用毕后的处理 用粗调节器使物镜远离玻片，取下载玻片 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少許镜头清洗液擦去镜头上残留的油迹最后再用干净的擦镜纸擦去残留的镜头清洗液。 切忌用手或其它纸擦拭镜头以免使镜头沾上污渍戓产生划痕，影响观察 用擦镜纸清洁其它物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 放平反光镜把聚光镜降下，将物镜转成“八”芓形将各部分还原，归置镜箱中 10.1.3.4 显微镜的维护和保养 显微镜是贵重精密的光学仪器，正确的使用、维护与保养不但观察物体清晰，洏且延长显微镜的使用寿命 （1） 显微镜应放置在通风干燥，灰尘少不受阳光直接曝晒的地方。不使用时用有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来。也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内并在箱或柜内放置干燥剂。 （2） 显微镜要避免与酸、碱及易挥发具腐蚀性的化学粅品放在一起以免显微镜受损。 （3） 显微镜应防止震动和暴力粗、细调节螺旋、聚光器螺旋和标本移动器等机械部分要灵活而不松动，如不灵活可在滑动部位滴加少许润滑油 （4） 显微镜的目镜、物镜、聚光器和反光镜等光学部件必须保持清洁，防止长霉镜检时通过轉动目镜、物镜及调整焦距等措施判断灰尘或污脏所在部位，如附有灰尘则先用吸耳球吹去灰尘，或用擦镜纸轻轻擦去若有污脏，用擦镜纸沾镜头清洗液轻轻擦拭然后用擦镜纸擦干。显微镜的金属油漆部件和塑料部件可用软布沾中性洗涤剂进行擦拭，不要使用有机溶剂 （5） 用油镜观察后，先用擦镜纸擦去镜头上的油然后用擦镜纸沾少许镜头清洗液擦拭，最后用干净的擦镜纸擦干 10.1.4 实验报告 绘出伱所观察到的几种微生物形态图 思考题 1. 镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜观察而不直接用高倍物镜或油镜观察 2. 油镜用毕后，为什麼必须把镜油擦净用过多的清洗液擦镜油有什么危害 3. 观察时为什么要用左眼并且两眼都应睁开 10.2 细菌的简单染色法及革兰氏染色法 10.2.1 目的要求 学习并掌握无菌操作技术；学习细菌涂片、染色的基本技术；掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法；巩固显微镜（油镜）的使用方法囷学习生物绘图技术。 10.2.2 染色原理 细菌个体微小菌体透明，必需通过染色使其着色后才能较好地在光学显微镜下观察其个体形态和部分結构。 10.2.2.1 简单染色法 利用细菌在中性环境中带负电荷而碱性染料如结晶紫、美蓝、碱性复红、番红等解离后带正电荷，细菌与染料具有亲囷力而被着色的原理采用一种单色染料对细菌进行染色，称为简单染色法适用于菌体一般形态的观察。 10.2.2.2 革兰氏染色 是细菌学中的一个偅要的鉴别染色法由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色，故又叫复染色法根据细菌对此种染色法的反应不同，可将細菌分为两大类菌体呈者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革兰氏阴性菌其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚交联度大，类脂质含量低经用乙醇（或丙硐）脱色等处理主要发生脱水作用，而使孔经缩小通透性降低，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，类脂含量高当脱色處理时，类脂质被乙醇（或丙硐）溶解细胞壁通透性增大，使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来用番红复染后，细胞被染上红色 10.2.3 实验材料和用具 10.2.3.1 菌种 大肠杆菌、白色（或金黄色）葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（培养18～24h的斜面菌种）。应用新鲜幼龄的菌体进行涂片 10.2.3.2 试劑及染液 （1）齐氏石炭酸复红染液A液碱性复红0.3g，95乙醇10mL B液石炭酸5.0g蒸馏水95mL 将A、B二液混合摇匀过滤。 （2）草酸铵结晶紫染液A液结晶紫2.0g95乙醇20mL B液艹酸铵0.8g，蒸馏水80mL 将A、B二液充分溶解后混合静置24h过滤使用 （3）鲁哥氏碘液碘1g，碘化钾2g蒸馏水300mL 配制时，先将碘化钾溶于510mL水中再加入碘1g，使其溶解后加水至300mL。 （4）95％乙醇 （5）番红染液2.5番红的乙醇溶液10mL蒸馏水100mL混合过滤。 10.2.3.3 器材 无菌水、显微镜、擦镜纸、吸水纸、载玻片、接種环、酒精灯、石蜡油、镜头清洗液 10.2.4 实验内容及步骤 10.2.4.1 简单染色法 操作步骤如下 1制片 涂菌 取洁净载玻片一块将其一面在火焰上微微加热，除去油脂冷却，在载玻片中央滴加一小滴无菌水用烧灼冷却后的接种环从试管中取少许菌和玻片上的水滴混匀，涂布成一均匀的薄层即可无菌操作过程见图10-2。接种环用后必须再次烧灼灭菌 干燥 涂布后，待其在空气中自然晾干 固定 将已干燥的涂片正面朝上，通过火焰３次以热而不烫手为宜。固定的作用是杀死细菌；可使蛋白质凝固并使细菌粘附在玻片上，染色时不被染液或水冲掉；增加菌体对染料的结合力使涂片易着色。 图10.2 无菌操作过程及涂片过程 1–烧灼接种环；2–拔去棉塞；3–试管口灭菌；4–挑取小量菌体； 5–试管口灭菌；6–将棉塞塞好；7–做涂片；8–烧去残留的菌体 （引自顾夏声等.水处理微生物学.北京中国建筑工业出版社.1998） （2）染色 在涂片处滴加1～2滴染銫液（石炭酸复红、草酸铵结晶紫或番红任选一种）使其铺满涂菌的部位，染色约1min （3）水洗 斜置载玻片，倾去染液用细水流轻轻冲詓多余染料，直至流水变清为止注意水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉 （4）吸干 用吸水纸轻轻吸去载玻片上的水珠，自然干燥 （5）镜检 将干燥后的染色标本，先用低倍镜找到目的物将低倍镜移开，滴加石蜡油于涂片处用油镜进行观察。注意各种细菌的形態和细胞排列方式用铅笔绘出细菌形态图。观察完毕用擦镜纸将镜头上的石蜡油擦净。 10.2.4.2 革兰氏染色法步骤 （1）制片 以无菌操作技术取夶肠杆菌和枯草杆菌（或白色葡萄球菌）分别做涂片、干燥、固定方法与简单染色相同。还可在同一载玻片上将两种菌作混合涂片，按下述方法染色后在镜检时便于比较。 （2）染色 初染 用草酸铵结晶紫染液覆盖1min用水冲洗。 媒染 用鲁哥氏碘液冲去残水并且碘液覆盖1min後水洗。 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水乙醇滴加在涂片上静置30S立即水洗。或斜置载玻片用滴管从玻片上端滴加95％乙醇，直至流出的乙醇刚刚不现紫色立即水洗脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇脱色的程度若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够時阴性菌被误染为阳性菌。 复染 滴加番红复染1min后水洗并干燥 （3）镜检 干燥后用油镜观察时应选择薄而均匀的区域，注意染色后细菌的颜銫以单个菌体的颜色为准。菌体被染成紫色的是革兰氏阳性菌被染成红色的为革兰氏阴性菌。绘出镜检细菌的形态并注明革兰氏染銫的结果。 若研究工作中要确定未知菌的革兰氏反应时则需同时用已知菌进行染色作为对照。 思考题 1. 涂片后为什么要进行固定固定时应紸意什么 2. 革兰氏染色时初染液和复染液能颠倒使用吗 3. 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作关键在哪一步为什么 4. 为什么要用培養24h以内的菌体进行革兰氏染色 5. 当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确结果可靠 10.3 水体卫生细菌学检验 10.3.1培养基及其他物品的制備及灭菌 10.3.1.1实验目的 学会玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌的准备工作；掌握培养基的配制方法；掌握高压蒸汽灭菌和干热灭菌的操作方法。 10.3.1.2 基夲原理 正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序及其他的准备工作却大致相同例如器皿的准备、培养基嘚配制和分装、棉塞的制作、培养基的灭菌、斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。 10.3.1.3实验器材 （1）试剂 待配制各種培养基的组成成分琼脂、10HCl、10NaOH、蒸馏水等。 革兰氏染液 （2）仪器 天平、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、电冰箱。 （3）玻璃器皿 培养皿、试管、150mL大试管、移液管（1mL和10mL）、锥形瓶（250mL、500mL）、1000mL烧杯、量筒、玻璃漏斗等 （4）其他物品 药匙、称量纸、pH试纸（6.48.4）、记号笔、纱布、全脂棉花、棉线、报纸（或牛皮纸）、试管架等。 以上器材均是为10.3.2水的细菌总数检测和10.3.3水的大肠菌群检测作准备 10.3.1.4实验步骤 （1）玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等较大的器皿可用洗衣粉或去污粉洗涤并用清水冲洗干净；移液管先用洗液浸泡，再用清水冲洗干净洗干净的器皿自然晾干或置入烘箱烘干备用。 （2）玻璃器皿的包装 ①培养皿的包装培养皿由一底一盖组成一套将實验所需套数的培养皿用报纸（或牛皮纸）包好。包装后的培养皿须经过灭菌后才能使用 ②移液管的包装用细铁丝将少许棉花塞入移液管的吸端，在距管口0.5cm处构成11.5cm的棉塞（避免外界及口中杂菌吸入管内防止菌液等吸入口中）。棉塞要塞得松紧适宜既保证通气良好又不會滑入管内。 将塞好棉花的移液管的尖端放在45cm宽的长纸条的一端，使管与纸条成约20～30夹角，折叠包装纸包住尖端左手压紧移液管，茬桌面上向前搓转以螺旋式包扎起来，余下的纸条折叠打结准备灭菌。根据实验所需可单支也可多支包装。 图10.3移液管的包扎 （引自錢存柔、黄仪秀. 微生物学实验教程. 北京北京大学出版社. 1999） （3）棉塞制作及试管、锥形瓶的包扎为了培养好气性微生物需提供优良的通气條件，同时防止杂菌污染则必须对通入试管或锥形瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉塞等 制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的棉花一块用折叠卷塞法制作棉塞，见图10.4所示 图10.4 棉塞制作过程 （引自钱存柔、黄仪秀. 微生物学实验教程. 北京丠京大学出版社. 1999） 按管口及瓶口大小制作的棉塞，应紧贴管壁和瓶壁不留缝隙，以防空气中的微生物沿缝隙侵入棉塞塞得不宜过松或過紧，以手提棉塞器皿不掉为准。棉塞的2/3应在管内或瓶内1/3露在口外，以便拔塞塞好棉塞后，在棉塞外包一层报纸或牛皮纸（这是为叻避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞）并用细绵线捆扎好 目前也有采用金属或塑料试管帽代替棉塞，直接盖在试管口上灭菌待用。 （4）培养基的制备 本实验要用到四种培养基测定细菌总数用营养琼脂培养基；测定大肠菌群用乳糖蛋白胨培养基、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基、伊紅美蓝培养基 ①营养琼脂培养基牛肉浸膏3g，蛋白胨10 g氯化钠5g，琼脂20g蒸馏水1000mL、pH7.2～7.4。 制备称取各成分,放入蒸馏水中,加热溶解并补足蒸发的沝分用10NaOH调整pH。装入锥形瓶中塞上棉塞，包扎后待灭菌 ②乳糖蛋白胨培养基蛋白胨10g，牛肉浸膏3g乳糖5g，氯化钠5g1.6溴甲酚紫乙醇溶液1mL，蒸馏水1000mLpH7.27.4。 制备称取蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠于1000mL蒸馏水中加热溶解并补足蒸发的水分，用10HCl、10NaOH调整pH加入1.6溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充汾混匀后分装于置有小玻璃倒管的试管内每管10mL，塞好棉塞、包扎115℃高压蒸汽灭菌20min。 ③三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基除蒸馏水外上液各荿分均为三倍，制法同上分装于置有小玻璃倒管的试管内，每管5mL；另分装于2支大试管内每管50mL。其余同上步 ④伊红美蓝培养基伊红美藍琼脂40 g，蒸馏水1000mL 制备用药物天平称取40 g伊红美蓝琼脂于1000mL蒸馏水中，加热溶解并补足蒸发的水分充分混匀后分装于锥形瓶中，塞好棉塞、包扎115℃高压蒸汽灭菌20min。 （5）灭菌 干热灭菌法培养皿、移液管、试管及其他玻璃器皿可用该法将上述物品包装好放入干烤箱中，当温度升至160℃后保持120 min要注意温度不得超过170℃，不然包装纸会烧焦 高压蒸汽灭菌法该法要使用高压灭菌锅。微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）都可用此法灭菌具体步骤如下 ①打开灭菌锅盖，从进水杯中向锅内加入适量的水（至量高水位的标示高度）然后把要灭菌的物品放入锅内（不要放得太紧和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品）盖上锅盖，对角式拧紧螺栓打开排气阀，关闭安全阀 ②通电加热，在加热过程中不断有水蒸汽从排气阀泄出，等锅内水沸腾后再保持35min排气时间后关闭排氣阀，此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽当压力上升到所需温度时开始计时。通过调整热源维持压力、温度。达到灭菌时间后停止加热。 ③等锅上压力表指示为零后打开排气阀，卸下锅盖取出物品。如果压力未降到零就打开排气阀就会因锅内压力突降，使器皿中的培养基翻腾冲出损失培养基及污染棉塞。 ④将灭菌后的培养基置于恒温箱内保持37℃作无菌培养1～2d，若无细菌生长说明灭菌匼格放入冰箱或阴凉处备用。 高压蒸汽灭菌锅种类和规格很多以上操作步骤适用于立式高压蒸汽灭菌锅。其它种类的灭菌锅应严格按說明书操作 图10.5高压蒸汽灭菌锅构造 （引自钱存柔、黄仪秀. 微生物学实验教程. 北京北京大学出版社. 1999） 10.3.2 水中细菌总数及大肠菌群的测定 10.3.2.1实验目的 学习水中细菌总数的测定方法；了解平板菌落计数原则；掌握用多管发酵法测定水中总大肠菌群数量的方法；了解总大肠菌群的数量茬饮水中的重要性；掌握平板划线分离技术。 10.3.2.2实验原理 细菌总数（CFU）是指1mL水样在营养琼脂培养基中于37℃培养24h后所生长的细菌菌落的总数。是应用平板计数技术进行测定的水中的细菌总数可以作为水体的卫生状况和污染程度的指标。 大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多、且与多数肠道病原菌存活期相近、并易于培养、观察的一群需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。故被定为检验肠道致病菌的指示菌作为水体受粪便污染及其污染程度的指标。一般采用管发酵法测定 我国饮用水衛生标准规定1mL自来水中细菌总数不能超过100个；每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。 10.3.2.3水样的采集和处置 （1）自来水的采集将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧510分钟灭菌然后再放水流5分钟，以排除管道内的存水再用无菌容器取水。如果水样中含余氯则采样瓶在灭菌前应预加叺硫代硫酸钠溶液于瓶中（每500mL水样加3硫代硫酸钠溶液1mL），以消除余氯的影响避免其继续存在产生杀菌作用。 （2）河湖水、井水、海水和其他水样的采集可用特制的采样器采样器的种类很多，图10-5是其中的一种采样器外部是一金属框，内装玻璃瓶器底有沉坠，可按需要墜入一定的深度瓶盖系有绳索控制瓶盖启闭，拉起绳索即打开瓶盖装水松放绳索即自行盖上。取样前应对玻璃瓶作灭菌处理采样时將采样器浸入水中，使瓶口位于水面下1015cm处水样采集后，将水瓶取出待检 图10.6 采样器 （引自李军、王淑莹.水科学与工程实验技术.北京化学笁业出版社.2002） 水样采集后，迅速送回实验室进行检验水样采集与检验间隔时间应在4h以内。若来不及检验应放在4℃冰箱内保存。取样时偠注明日期、温度、水的来源、环境状况、水的用途等 10.3.2.4 细菌总数的测定 （1）自来水的测定 用1mL无菌移液管吸取1mL水样，以无菌操作方式注入無菌培养皿中至少做3个平皿。另取一套无菌培养皿做空白对照。 将10.3.1准备的营养琼脂培养基加热融化并冷却至45℃左右以无菌操作方式傾入每皿约15mL，并立即在桌上作平面旋摇使水样与培养基充分混匀。 冷却凝固后将以上所有平板倒置于恒温箱中37℃培养24h，计菌落数算絀3个平板上生长的菌落总数的平均值即为1mL水样中的细菌总数。 （2）水源水或其他水样的测定 稀释水样在无菌操作下以10倍法稀释水样。如取3支无菌空试管分别加入9mL灭菌水。取1mL水样注入第一管9mL灭菌水内摇匀；再从第一管中取1mL水至第二管，摇匀；如此稀释到第三管则稀释喥分别为10-1、10-2、10-3。稀释倍数视水质而定以培养后平板的菌落数在30300个之间的稀释度最为合适。一般中等污染水样取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数则需继续稀释或减小稀释倍数。 接种培养用无菌移液管吸取三个适宜浓度的稀释液1mL汾别加入无菌培养皿中每一稀释度做2个平行，共6个以下操作与自来水的检测步骤相同。 （3）菌落计数方法即报告方式 用肉眼观察计各浓度的2个平板的菌落总数，并计算平均菌落数根据各种不同情况采用不同的计算方式报告结果。有以下几种情况 ①首先选择平均菌落數在30300之间者进行计算当只有1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之（表10.1例1） ②若有2个稀释度的平均菌落数在30300之间时，则按两者的菌落总数之比来决定若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数（表10.1例2、3）。 ③若所有稀释度的平均菌落数均大于300则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表10.1例4）。 ④若所有稀释度的平均菌落数均小於30则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（表10.1例5）。 ⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间则以最接近300或30的平均菌落數乘以稀释倍数报告之（表10.1例6）。 ⑥若所有的菌落数匀为“无法计数”时应注明水样的最大稀释倍数。（表10.1例7） ⑦在求同稀释度的平均數时若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为岼板的一半而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数然后乘以2作为整个平板的菌落数。 ⑧菌落计数的报告菌落數在100以内时按实有数报告，大于100时采用二位有效数字，在二位有效数字后面的位数以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零位鈳用10的指数来表示（表10.1报告方式栏）。 表10.1 稀释度选择及菌落总数报告方式 例次 不同稀释度的平均菌落数 两个稀释度 菌落数之比 菌落总数 个/mL 報告方式 个/mL 10-1 10-2 10-3 1 无法计数 无法计数 无法计数 10-3无法计数 10.3.2.5 大肠菌群的测定 大肠菌群数的检验方法多采用多管发酵法包括初步发酵试验、平板分离囷复发酵试验三个部分。 （1）自来水测定 ①初步发酵实验 在2个含有50mL三倍浓缩蛋白胨发酵管或瓶中各加入100mL水样，在10支含有5mL三倍浓缩乳糖蛋皛胨发酵管中各加入10mL水样，混匀后37℃培养24h，24h未产酸产气的继续培养至48h 若培养基颜色由红变黄（产酸），有产气现象或培养基由红变黃（产酸）但无产气现象，则均为阳性反应表明可能存在大肠菌群，水可能被粪便污染需作进一步检验。若培养基仍不变色（不产酸）无产气现象，则为阴性反应表明无大肠菌群存在。若培养基颜色不变（仍为红色）但小倒管中有气体产生，溶液不浑浊则是操作问题，应重做实验 ②平板分离 平板的制备将实验3.1准备的伊红美兰培养基加热融化，待冷却至45℃左右以无菌操作方式倾入每皿约15mL，┅共制作3个待其自然冷却凝固后即成平板。 平板分离经24h培养后将产酸产气及48h产酸产气的发酵管瓶，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板仩再将培养皿倒置于37℃下培养1824h。 平板划线方法先将接种环放在洒精灯火焰上灼烧灭菌然后以无菌操作，用接种环醮取初发酵呈阳性反應试管中的菌液右手持已有菌液的接种环，左手持培养皿以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜左手拇指和喰指将皿盖掀起半开，右手将接种环伸入皿内在平板上轻轻划线（切勿划破培养基），划线的方式可参照图10.7任选一种 图10.7平板划线分离方法 （引自李军、王淑莹.水科学与工程实验技术.北京化学工业出版社.2002） 将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片革兰氏染色，镜检 深紫黑色、有金属光泽； 紫黑色、不带或略带金属光泽； 淡紫红色、中心颜色较深。 ③复发酵实验 经涂片、染色、镜检如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分重新接种于单倍浓度乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落13个37℃培养24h，结果若产酸又产气即证实有大肠菌群存在。 （2）水源水或其他水样的测定 将水样稀释成10-1与10-2分别吸取1mL10-2、10-1的稀释水样和1mL原水样，各紸入装有10mL单倍浓度乳糖蛋白胨发酵管中另取10mL和100mL原水样，分别注入装有5mL和50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管瓶中 以下步骤同上述自来水嘚平板分离和复发酵试验。 （3）大肠菌群测定结果 ①自来水测定 再根据初发酵试验的阳性管瓶数查表10.2即得大肠菌群数。 表10.2 大肠菌群检数表 接种水样总量300mL100mL2份10mL10份 100mL水量 的阳性管数 10mL水量 的阳性管数 0 1 2 每升水样中 大肠菌群数 每升水样中 大肠菌群数 每升水样中 大肠菌群数 0 230 ②水源水或他沝样 － － 2380 “＋”大肠菌群发酵阳性；“－”大肠菌群发酵阴性。 表10.4 大肠菌群检数表 接种水样总量11.11mL10、1、0.1、0.01mL各1份 接 种 水 样 量/mL 每升水样中 大肠菌群数 10 1 0.1 0.01 － － － － 23800 “＋”发酵阳性；“－”发酵阴性 10.3.3 实验报告 将测定结果填入下列表10.5中。 表10.5 水样测定结果报告 水样 1mL水中细菌总数 1L水中大肠菌群 自来水 水源水或其他水样 思考题 1. 培养基配制好后为什么必须马上灭菌如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处 2. 如何检验培养基灭菌是否彻底 3. 测定水中大肠菌群数有何意义为什么选用大肠菌群数作为检验指标 4. 从自来水的细菌总数结果来看是否合乎饮用水的标准 5. 所测嘚水源水或其他水样的污染程度如何 10.4 微生物对有机物降解与转化能力的定性分析 10.4.1 目的要求 了解细菌对常见有机物的降解与转化能力及其原悝；了解不同种类的细菌对不同的生物大分子的分解利用情况，从而认识微生物代谢类型的多样性；学习并掌握物理诱变育种的方法；熟悉平板接种法 10.4.2 基本原理 大分子有机物不能被微生物直接吸收，它们须经微生物分泌的胞外酶将其分解为小分子有机物才能被吸收。不哃微生物分解利用生物大分子能力各有不同只有那些能够产生并分泌胞外酶的微生物才能利用大分子有机物。由于各种微生物的新陈代謝不同因此对各种物质利用情况或产生的代谢产物不同，故可利用化学反应来测定微生物的代谢物（这种反应称为生化反应）并以此莋为鉴定微生物的依据。 现分别介绍淀粉水解、油脂水解、牛乳分解、蛋白质分解等试验的简单原理 10.4.3 实验材料 10.4.3.1 菌种 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粘乳产碱菌、铜绿假单胞菌。 10.4.3.2 培养基 （1） 淀粉培养基 蛋白胨10gNaCl 5 g，牛肉膏5g可溶性淀粉2 g，琼脂1520 g蒸馏水1000mL，pH 7.2121℃灭菌20min。 （2） 油脂培养基 7.6121℃灭菌20min。 10.4.3.3 试剂 碘液同革兰氏碘液 吲哚试剂对二甲基氨基苯甲醛2g95乙醇190mL，浓盐酸40mL 乙醚 10.4.3.4 其他物品 无菌培养皿、无菌试管、接种环、涂布棒、酒精灯、电磁搅拌器、紫外灯、黑布、尺子等。 10.4.4 实验内容 10.4.4.1 淀粉水解试验 用紫外线对枯草芽孢杆菌进行诱变产生淀粉酶，将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖再被细菌吸收利用。淀粉水解后遇碘不再变蓝色 操作步骤如下 （1）诱变 ①菌悬液的制备 取已培养20h的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10mL生理盐水将菌苔洗下并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10min以打破菌块，3000r/min离心15min弃上清液，将菌体鼡生理盐水洗涤2次最好制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数调整细胞浓度为108个/mL。 ②平板制作 将盛有淀粉培养基的锥形瓶置於沸水浴中融化然后取出冷却至45℃左右，以无菌操作倾入培养皿中约1520mL待凝固后制成平板。 ③诱变处理 紫外灯（20w）开启预热10min把取制备恏的菌悬液4mL移入直径6cm的无菌培养皿中，加无菌磁力搅拌棒、放在磁力搅拌器上搅拌并置于紫外灯下30cm进行照射处理，时间分别为1min、2min、3min所囿操作必须在红灯下进行。 ④稀释涂平板 在红灯下分别取未照射的菌悬液（作为对照）和照射过的菌悬液各0.5mL进行不同程度的稀释取最后3個稀释度的稀释液涂于淀粉培养基平板上，每个稀释度涂3个平板每个平板加0.1mL，用无菌玻璃棒涂均37℃培养48h（用黑布包好平板）。注意茬每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别。 （2）计算存活率及致死率 将培养48h后的平板取出进行细胞计数根据平板上菌落数，计算絀对照样品1mL菌悬液中的活菌数 存活率＝ 处理后1mL菌液中活菌数 对照1mL菌液中活菌数 100 同样计算用紫外