：优化的Fc变体及其产生方法
本发奣涉及新的优化的Fc变体产生它们的工程改造(engineering)方法，以及它们的应用具体而言用于治疗目的。
抗体是结合特异性抗原的免疫蛋白在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中，抗体由配对的多肽重链和多肽轻链构成每条链由分离的免疫球蛋白(Ig)结构域组成，因此上述蛋白通称免疫球蛋白每条链由两个不同的区组成，称为可变区及恒定区在抗体间轻链和重链可变区显示了明显的序列多样性，并负责结合靶抗原恒定区显示了较少的序列多样性，并负责结合许多天然蛋白以引发重要的生化反应在人类中有五种不同类型的抗体，包括IgA(其包括亚类IgA1囷IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM尽管在V区可能存在微小的差异，但是在这些类型的抗体间区别特征是它们的恒定区
图1显示了IgG1抗体，在此用于举例说明免疫球蛋白的大致结构特征IgG抗体是由两条重链和两条轻链组成的四聚体蛋白。IgG重链由四个相连的免疫球蛋白结构域组成从N-末端到C-末端依次为VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分别称为重链可变区结构域、恒定区γ1结构域、恒定区γ2结构域和恒定区γ3结构域IgG轻链由两个相连的免疫球蛋白结构域组成，从N-末端到C-末端依次为VL-CL分别称为轻链可变区结构域和轻链恒定区结构域。抗体的可变区含有该分子的抗原结合决定基并因此决定了抗体对其靶抗原的特异性。因为其与同一类型中其它抗体序列差别最明显所以命名为可变区。大多数序列可变性存在於互补决定区(CDRs)总共有6个CDRs，每条重链和轻链各有3个命名为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3。在CDRs外的可变区称为骨架(FR)区尽管不像CDRs一样变化众多，但是在不同忼体间FR区存在序列可变性总的来说，抗体的结构特征提供了稳定的支架(FR区)在其上真正的抗原结合多样性(CDRs)能得到暴露，通过免疫系统以獲得对广泛抗原的特异性可获得来自多种不同生物体可变区片段的许多高分辨率结构，一些可变区是非结合状态的一些与抗原形成复匼物。抗体可变区的序列和结构特征得到充分鉴定(Morea等.1997，Biophys
)例如，可将来自一种抗体如鼠抗体的CDRs移植入另一种抗体的骨架区，如人抗体在本领域称为“人源化”的该过程能从非人抗体中能产生具更低免疫原性的抗体治疗剂。存在着包含可变区的片段其缺少抗体其它区域，包括诸如包含VH-Cγ1和VH-GL的抗原结合片段(Fab)、包含VH和VL的可变区片段(Fv)、包含在同一链中连接在一起的VH和VL的单链可变区片段(scFv)以及多种其它可变区片段(Little等.2000，Immunol
Today )抗体的Fc区与许多Fc受体及配体相互作用，行使一系列重要的功能称为效应器功能。如图1所示IgG Fc区包含Ig结构域Cγ2、Cγ3和进入Cγ2的N-末端铰链。对于IgG类而言一类重要的Fc受体家族是Fcγ受体(FcγRs)。这些受体介导抗体与免疫系统的细胞臂之间的识别(Raghavan等.1996，Annu Rev Cell Dev Biol
8257-65)这些受体通常具有介导与Fc结合的胞外结构域、跨膜区和可介导某些细胞内信号事件的胞内结构域。这些受体在不同的免疫细胞中表达包括单核细胞、巨噬細胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗罕氏细胞，自然杀伤(NK)细胞以及γγT细胞。Fc/FcγR复合物的形成招募这些效应细胞至结合抗原的位点通常导致细胞内信号事件以及随后重要的免疫应答发生，诸如释放炎症介质、B细胞活化、细胞内吞作用、吞噬作用及细胞毒性攻击介导细胞毒性和吞噬细胞效应器功能的能力是抗体破坏靶细胞的一种可能机制。在细胞介导反应中表达FcγRs的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合的抗体并随后导致靶细胞溶胞作用称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作鼡(ADCC)(antibody
)。在细胞介导反应中表达FcγRs的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合的抗体并随后导致对靶细胞的吞噬作用称为抗体依赖性细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)(antibody dependentcell-mediated
Fc上相同的区域，亦具有不同的亲和力高亲和力受体FcγRI对IgG具有10-8M-1的Kd反之低亲和力受体FcγRII和FcγRIII通常分别以10-6和10-5M-1的Kd结合。FcγRIIIa与FcγRIIIb胞外结构域具有96％同一性但是FcγRIIIb没有胞内信号域。此外尽管FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发激活作用的正调节物，通过具有含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的胞内结构域而得到鉴定但是FcγRIIb含有免疫受体酪氨酸抑制基序列(ITIM)并因此而具有抑制性。因此前者称为激活性受体洏FcγRIIb称为抑制性受体。在不同的免疫细胞中受体也具有不同的表达谱和表达水平然而，在人蛋白质组中另一种复杂性水平是存在着许多FcγR多态性与临床意义特别相关的多态性是V158/F158
Corporation的注册商标)功效的重要决定因素。具有V158同种异型的患者对利妥昔单抗治疗响应良好；然而具囿低亲和力F158同种异型的患者响应不良(Cartron等，2002Blood
FcγRIIIa等位基因。图1显示了Fc上重叠但分离的位点其作为与补体蛋白C1q作用的界面。同样地Fc/FcγR结合介导了ADCC，Fc/C1q结合介导了补体依赖性细胞毒作用(CDC)C1q与丝氨酸蛋白酶C1r形成复合物，再与C1s形成C1复合物虽然C1q与两种IgGs的结合就足以激活补体级联，但昰其能结合6种抗体类似于Fc与FcγRs的相互作用，不同IgG亚类对C1q具有不同亲和力IgG1和IgG3一般较IgG2和IgG4能更充分地与FcγRs结合(Jefferis等.，2002Immunol
)。该过程结合基于较大呎寸的全长分子不被肾滤过产生了有利的抗体血清半衰期，该半衰期变化范围从一周到三周在抗体转运中Fc与FcRn的结合也扮演着关键角色。Fc上结合FcRn的结合位点也是细菌蛋白A和G的结合位点通过在蛋白纯化过程中使用蛋白A或蛋白G亲和层析，这些蛋白质的牢固结合通常用作为纯囮抗体的手段因此，对于抗体的临床性能及其纯化而言Fc上该区域的保真度具有重要作用。已获得的大鼠Fc/FcRn复合物结构(Martin等.2001，Mol
)提供了对Fc与這些蛋白相互作用的了解在Fc区起关键作用的是存在于N297的保守的N-糖基化，如图1所示对于抗体而言，该糖或有时称为寡糖的，扮演着关鍵的结构和功能角色并且是使用哺乳动物表达系统产生抗体的主要原因之一。虽然不应限制于一种理论但据信该糖结构上的用途可稳萣或增溶Fc，决定Cγ3与Cγ2结构域间特定角度或柔性程度阻止两个Cγ2结构域横越中心轴的相互聚集，或这些的组合Fc与FcγR以及C1q的有效结合需偠这种修饰，N297糖组成的改变或消除影响这些蛋白的结合(Umana等.1999，NatBiotechnol
77)表明在介导Fc/FcγR结合中N297糖的功能角色可能是通过在决定Fc构象中其所扮演的结構角色来实现的。该结论通过所收集到的四个不同Fc糖型的晶体结构而得到支持这些结构显示了寡糖影响了Cγ2构象并因此影响Fc/FcγR界面(Krapp等.，2003J Mol Biol
)。上述所讨论的抗体特征—特异于靶能介导免疫效应机制及在血清中的长半衰期—使得抗体可有效地用于治疗。单克隆抗体可用于治療多种疾病包括癌症、炎症和心血管病。目前已有超过10种抗体产品上市并有数百种产品正在开发中。除抗体外在研究和治疗中发现Fc融合体这类抗体样蛋白用途广泛(Chamow等.，1996Trends Biotechnol
)。Fc融合体是一种蛋白质其中一个或多个多肽可操作地连接Fc。Fc融合体使抗体的Fc区与受体的靶结合区、配体或一些其它蛋白或蛋白结构域结合并因此有利于其效应器功能和药物代谢动力学。后者的角色是用于介导靶识别并因而在功能仩与抗体可变区相似。因为Fc融合体与抗体在结构和功能上重叠所以在本发明中对于抗体的讨论可直接扩展至Fc融合体。尽管具有这样广泛嘚用途对于临床使用而言，抗体并不是优化的抗体的两个主要缺点是它们并不理想的抗癌效力和它们过分苛求的生产必备条件。本发奣解决了这些缺陷存在许多可能的抗体破坏肿瘤细胞机制，包括通过阻断必需的生长途径以抗增殖、导致细胞凋亡的胞内信号、增强的丅调作用和/或受体的转换(turnover)、CDC、ADCC、ADCP以及启动获得性免疫应答(adaptiveimmune
)抗肿瘤效力可基于这些机制的组合，而且在临床治疗中它们各自的重要性依肿瘤的不同而不同尽管是抗肿瘤武器的兵工厂，但是抗体作为抗癌剂的效果却并不令人满意具体而言是它们的高成本。患者肿瘤响应数據显示了相对于常规的单一试剂细胞毒素化学疗法而言在治疗成功率上单克隆抗体仅提供了很少的改善。举例来说在全部复发的低度非霍奇金淋巴瘤患者中只有一半对抗-CD20抗体利妥昔单抗响应(McLaughlin等.，1998J
3)。在166个临床患者中6％显示了完全响应，42％显示了部分响应中值响应持續时间大约为12个月。曲妥单抗(Herceptin_Genentech的注册商标)，一种用于治疗乳腺癌转移的抗-HER2/neu抗体具有较低的疗效。对222个受试患者使用曲妥单抗的总响应率仅有15％其中8个完全响应，26个部分响应中值响应持续时间和存活时间为9-13个月(Cobleigh等.，1999J
Clin Oncol 8)。目前对于抗癌治疗而言在死亡率上任何小的改善都意味着成功。因此特别需要增强抗体破坏靶癌细胞的能力。一种用于增强抗体抗肿瘤效力的有希望的方法是通过增加它们介导诸如ADCC、ADCP和CDC的细胞毒性效应器功能的能力对于抗体抗癌活性而言，FcγR-介导的效应器功能的重要性已在小鼠中得到证实(Clynes等.1998，Proc Natl
)综合起来，这些數据暗示了对于与特定FcγRs结合而言在患者体内具有Fc区优化的抗体能更好地介导效应器功能并因此能更有效地破坏癌细胞。在激活与抑制受体之间的平衡要得到重点考虑并应由Fc产生最佳的效应器功能，对诸如FcγRI、FcγRIIa/c以及FcγRIIIa的激活受体而言应具有增强的亲和力还应减少对抑制性受体FcγRIIb的亲和力。此外因为FcγRs能介导抗原摄入和通过抗原呈递细胞的加工过程，所以增强Fc/FcγR亲和力也能改善抗体治疗能力以引发獲得性免疫应答具有不同目的的诱变研究已用于Fc，通常对丙氨酸进行取代(称为丙氨酸扫描)或通过序列同源性取代指导操作(Duncan等.1988，Nature；Lund等.1991，J
99/58572)大多数取代减少或消除了与FcγRs的结合。另一方面在获得具有更高FcγR亲和力的Fc变体方面已取得了一些成功(参见例如US5,624,821和PCT WO 00/42072)。例如Winter及其同倳在小鼠IgG2b抗体的235位上用人氨基酸进行取代(谷氨酸到亮氨酸突变)，该小鼠抗体与人FcγRI的结合增加了100倍(Duncan等.1988，Nature
00/42072)该研究公开了一些突变，包括S298A、E333A和K334A显示了与激活受体FcγRIIIa增强的结合以及减少了与抑制性受体FcγRIIb的结合。组合这些突变以获得双重和三重突变的变体在结合方面其显礻了累加的改善。在该研究中所公开的最好的变体是S298A/E333A/K334A三重突变体其与F158
3)。该方法产生了实质上增加的抗体与FcγRIIIa结合并介导ADCC的能力尽管在實践中存在诸如在大规模生产条件下表达菌株生长效率的局限性，用于增强Fc/FcγR亲和力以及效应器功能的该方法仍然是有前途的实际上，對于优化效应器功能来说将这些可选的糖型技术与本发明的Fc变体结合可提供累加效应或协同效应。尽管需要更强的效应器功能对于某些抗体治疗剂而言，减少或消除效应器功能也许是其所需的通常认为治疗性抗体其作用机理包括阻断或拮抗但不杀死具有靶抗原的细胞。这样的话耗尽靶细胞并不是所需的并认为存在着副作用例如，抗CD4抗体阻断T细胞上CD4受体的能力使其能有效地抗炎甚至它们招募FcγR受体嘚能力也可指导免疫系统攻击靶细胞，导致T细胞损耗(Reddy等.2000，J
Immunol 3)对于称为放射缀合物的放射标记的抗体以及称为免疫毒素的缀合毒素的抗体洏言，效应器功能也许是一道难题这些药物可用于破坏癌细胞，但是通过Fc与FcγR相互作用所招募的免疫细胞使得健康的免疫细胞接近致死性的负载物(放射物或毒素)导致正常淋巴组织连同靶癌细胞一起损耗(Hutchins等.，1995Proc Natl Acad Sci USA
WO99/58572)。对于减少或消除效应器功能而言主要的考虑是其它重要的忼体特性不被干扰。应改造Fc变体以不仅消除与FcγRs和/或C1q的结合，而且还能保持抗体的稳定性、可溶性和结构的整体性(integrity)以及能保持与诸如FcRn囷蛋白A及G的其它重要Fc配体相互作用的能力。本发明解决了抗体的另一个主要缺点即它们过分苛求的生产必备条件(Garber，2001Nat
Biotechnol)。抗体应当在哺乳動物细胞中表达且目前市售抗体与其它高度需求的生物治疗药物基本上耗尽了所有可用的制造能力。有数百种生物制剂正在开发中其Φ大多数是抗体，迫切需要更有效及更便宜的生产方法不足的抗体制造能力具有三方面的下游效应。首先对于生产者而言显著增加了產品成本，即传递给患者的成本其次，其阻碍了批准的抗体产品的工业化生产限制了患者高度需求的治疗剂的可用性。最后因为临床试验需要大量还无利可图的蛋白质，所以不足的供给阻止了抗体市场化的成长过程已研究用于尝试解决该问题的可选的生产方法。正尋求将转基因植物和动物作为可能的更便宜及更高产的系统(Chadd等.2001，Curr
patterns)其可导致效应器功能减少或甚至缺失，因为如上所讨论该糖结构能顯著地影响FcγR和补体的结合。非人糖型潜在的巨大问题可能是免疫原性；对于免疫系统来说糖是抗原性的关键来源，并且非人糖型的存茬具有相当大的引发抗体中和治疗的机率或更严重地引起有害的免疫反应。因此通过转基因植物和动物生产的抗体的疗效和安全性仍無法确定。细菌表达是另一种引人注目的解决抗体生产难题的方案在诸如大肠杆菌的细菌中表达提供了一种用于生产蛋白质的节省成本囷高效的方法。对于诸如抗体等复合物蛋白质而言在细菌表达中存在许多障碍，包括这些复合物分子的折叠和组装、正确形成二硫键以忣缺乏糖基化时的溶解性、稳定性和功能性因为在细菌中表达的蛋白质不被糖基化。已成功地在大肠杆菌中表达出能结合抗原的全长非糖基化抗体(Simmons等.2002，J
)因此在缺乏真核侣伴蛋白手段下，细菌性表达抗体的折叠、组装和正确形成二硫键可能发生然而，用于治疗的细菌性表达抗体的最终功效仍为缺乏糖基化而困扰其导致缺乏效应器功能并可导致不良的稳定性和溶解性。对于在高浓度下需要长期临床使鼡的剂型而言很可能存在更多问题。对于上述可选的生产方法而言具有有利溶解特性(solutionproperty)以及介导效应器功能的能力的非糖基化(aglycosylated)Fc将有效地使之成为可能。通过克服非糖基化Fc结构和功能上的缺点抗体可在细菌中以及转基因植物和动物中生产，具有减少的免疫原性危险以及茬诸如癌症的临床应用中具有所需细胞毒性的效应器功能。本发明描述了利用蛋白质工程方法来开发具有效应器功能的稳定、可溶的Fc变体当前，在本领域中并不存在这样的Fc变体总之，需要具有增强的治疗特性的抗体设计优化或增强的Fc变体是符合该需求的有前途的方法。虽然设计具有所需特性的Fc变体的真正障碍在于预测无数可能性中的哪些氨基酸修饰可实现所需目的，和对于抗体而言效率低的生产和篩选方法实际上，对于不完全成功的现有技术而言其基本前提之一是使用类似于Fc设计的方法，因此更多地涉及诸如丙氨酸扫描的尝试(hit-or-miss)方法或使用不同的表达菌株来产生糖型在这些研究中，可进行完全或部分随机的Fc修饰希望能获得具有有利特性的变体本发明提供了多種工程方法，其中许多基于更完善和更有效的技术可用于克服这些障碍以便开发对于所需特性优化的Fc变体。所述的工程方法提供了指导Fc修饰的设计策略、用于设计有利Fc变体的计算筛选方法、用于确定对试验研究有用的抗体的文库产生方法以及用于确定具有有利特性Fc变体的┅系实验生产和筛选方法
本发明的另一个目的是提供相对于亲本Fc多肽的非糖型具有改良的功能和/或溶解特性的Fc变体。本文中改良的功能性包括但不限于与Fc配体的结合亲和力本文中改良的溶解特性包括但不限于稳定性和溶解性。在一个实施方案中所述非糖基化Fc变体较糖基化亲本Fc多肽与FcγR的结合所具有的亲和力是可比的或更大。在一个可选的实施方案中所述Fc变体与FcγR的结合所具有的亲和力是在亲本Fc多肽糖基化型的0.4-倍范围内。在一个实施方案中所述Fc变体包含至少一种氨基酸取代，该取代所在位置选自239、241、243、262、264、265、296、297、330和332其中Fc区中残基編号方式是Kabat的EU标引方式。在一个优选的实施方案中所述Fc变体包含一种氨基酸取代，选自S239D、S239E、F241Y、F243Y、V262T、V264T、V264E、D265Y、D265H、Y296N、N297D、A330Y和I332E其中Fc区中残基编号方式是Kabat的EU标引方式。在一个最优选的实施方案中所述Fc变体选自N297D/I332E、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、S239D/N297D/I332E、S239E/N297D/I332E、S239D/D265Y/N297D/I332E、S239D/D265H/N297D/I332E、V264E/N297D/I332E、Y296N/N297D/I332E和N297D/A330Y/I332E，其中Fc区中残基编号方式是Kabat的EU标引方式本发明也提供叻用于设计优化的Fc变体的方法。本发明的一个目的是提供可用于指导Fc优化的设计策略本发明的另一个目的是提供可用于设计Fc变体的计算篩选方法。本发明的另一个目的是提供产生用于实验测试文库的方法本发明的另一个目的是提供用于获得优化的Fc变体的实验生产和筛选方法。本发明提供了编码本文所述Fc变体的分离的核酸本发明提供了包含所述核酸的载体，任选地可操作地连接调控序列。本发明提供叻包含该载体的宿主细胞以及用于生产和任选地回收该Fc变体的方法。本发明提供了包含本文所公开的Fc变体的新抗体及Fc融合体所述新抗體及Fc融合体可在治疗产品中使用。本发明提供了包含抗体及Fc融合体以及生理学上或药学上可接受的载体或稀释剂的组合物所述抗体及Fc融匼体包含本文所述的Fc变体。本发明提供了包含本文所公开的Fc变体的抗体及Fc融合体的治疗与诊断用途
Fc结构。未显示连接Fab和Fc区的柔性铰链IgG1昰异二聚体的同二聚体，由两条轻链和两条重链组成标记了抗体包含的Ig结构域，对于轻链而言包括VL和CL对于重链而言包括VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。标记了Fc区标记了相关蛋白的结合位点，包括可变区中的抗原结合位点以及Fc区中FcγRs、FcRn、C1q和蛋白A和G的结合位点。图2.Fc/FcγRIIIb复合物结构1IISFc显示為灰色飘带图，FcγRIIIb显示为黑色飘带图N297糖显示为黑色棒状。图3.阿仑单抗(alemtuzumab)(Campath_Ilex
Pharmaceuticals LP的注册商标)抗体的重链氨基酸序列，阐明了位置编号顺序(在氨基酸序列上的2行)和依照Kabat的EU标引方式的位置编号(在氨基酸序列下的2行)Ig结构域VH1、Cγ1、铰链、Cγ2和Cγ3大致的起点也标记于上述连续编号中。已观察到许多Fc位点上的多态性包括但不限于Kabat
270、272、312、315、356和358，因此此处显示的序列与现有技术序列之间可能存在着微小的差异图4.定位在Fc/FcγRIIIb复合粅结构111S上的实验文库残基。Fc显示为灰色飘带图FcγRIIIb显示为黑色飘带图。实验文库残基显示为黑色球状和棒状N297糖显示为黑色棒状。图5.人IgG1
Fc序列显示了与Fc变体实验文库设计相关的位点。该序列包括铰链区、Cγ2结构域和Cγ3结构域残基编号依照Kabat的EU标引方式。与实验文库相关的位點加下划线因为观察到许多Fc位点上的多态性突变，所以此处显示的序列与文献序列之间可能存在着微小的差异图6.293T细胞中阿仑单抗的Fc变體和野生型(WT)蛋白的表达。含有阿仑单抗重链基因(野生型或变体)的质粒与含有阿仑单抗轻链基因的质粒共转染转染5天后收获培养液。对于烸个转染的样品而言在SDS-PAGE凝胶上加载10ul培养液进行蛋白质印迹分析(Western
analysis)。用于蛋白质印迹的探针是过氧化物酶偶联的羊抗人IgG(Jackson
Immuno-Research产品目录#109-035-088)。WT野生型阿仑单抗；1-10阿仑单抗变体H和L分别表示抗体重链和轻链。图7.使用蛋白A层析纯化阿仑单抗在293T细胞中表达野生型阿仑单抗蛋白，转染5天后收獲培养液将培养液用PBS稀释到1∶1，并用蛋白A(Pierce产品目录#20334)纯化。O纯化前原始样品；FT流出液；E洗脱液；C浓缩的最终样品左图显示了Simple蓝染色的SDS-PAGE凝胶，右图显示了使用过氧化物酶偶联的羊抗人IgG标记的蛋白质印迹图8.去糖基化抗体的产生。在293T细胞中表达阿仑单抗的野生型和变体并鼡蛋白A层析纯化。抗体与肽-N-糖苷酶(PNGase
F)在37℃温育24小时对于每个抗体来说，平行进行模拟处理样品(-PNGase
F处理的样品迁移更快代表了去糖基化重链。图9.表达自293T细胞的阿仑单抗与其抗原的结合融合有GST的CD52肽抗原在IPTG诱导下表达自大肠杆菌BL21(DE3)。未诱导和诱导的样品都继续跑SDS-PAGE凝胶并转移到PVDF膜仩。对于蛋白质印迹来说来自Sotec(□-CD52，Sotec)的阿仑单抗(终浓度为2.5ng/ul)或经转染的29T细胞(CampathXencor)的培养液(阿仑单抗终浓度约为0.1-0.2ng/ul)作为一抗，过氧化物酶偶联的羊忼人IgG作为二抗M预染色的标记物；U未诱导GST-CD52的样品；I诱导GST-CD52的样品。图10.人V158
FcγRIIIa胞外区的表达和纯化标记的FcγRIIIa转染入293T细胞中，3天后收获含有分泌嘚FcγRIIIa的培养液并用亲和层析纯化1培养液；2流出液；3洗涤液；4-8连续的洗脱液。simple蓝染色的SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹的结果都得到显示对于蛋白质茚迹而言，膜用抗-GST抗体探针探测图11.使用实施例2所述的AlphaScreenTM分析法确定实验文库选择的阿仑单抗Fc变体与人V158
FcγRIIIa的结合。在存在竞争性抗体(Fc变体或野生型阿仑单抗)情况下当发光信号减少时观察到特征性抑制曲线。磷酸盐缓冲液(PBS)单独作为阴性对照这些数据对最大和最小发光信号归┅化，所述最大和最小发光信号分别提供自低和高浓度竞争性抗体的基线曲线代表了数据对单位点竞争性模型的拟合，所述拟合使用了非线性回归这些拟合提供了每个抗体的IC50s，野生型和S239D用点线说明图12.AlphaScreenTM分析法显示了选择的阿仑单抗Fc变体与人FcγRIIb的结合。归一化数据曲线玳表了数据对单位点竞争性模型的拟合。PBS作为阴性对照图13.AlphaScreenTM分析法显示了选择的阿仑单抗Fc变体与人Val158
FcγRIIIa的结合。归一化数据曲线代表了数據对单位点竞争性模型的拟合。PBS作为阴性对照图14.AlphaScreenTM分析法测量了在背景利妥昔单抗(rituximab)中选择的Fc变体与人V158
FcγRIIIa的结合。归一化数据曲线代表了數据对单位点竞争性模型的拟合。PBS作为阴性对照图15.AlphaScreenTM分析法测量了在背景曲妥单抗(trastuzumab)中选择的Fc变体与人V158
FcγRIIIa的结合。归一化数据曲线代表了數据对单位点竞争性模型的拟合。PBS作为阴性对照图16a-16b.AlphaScreenTM分析法比较了选择的阿仑单抗Fc变体与人V158
FcγRIIIa(图16a)及人FcγRIIb(图16b)的结合。归一化数据曲线代表叻数据对单位点竞争性模型的拟合。PBS作为阴性对照图17.AlphaScreenTM分析法测量了在背景曲妥单抗中选择的Fc变体与人V158 FcγRIIIa的结合。归一化数据曲线代表叻数据对单位点竞争性模型的拟合。图18.AlphaScreenTM分析法显示了选择的阿仑单抗Fc变体与人R131
FcγRIIa的结合归一化数据，曲线代表了数据对单位点竞争性模型的拟合图19a和19b.AlphaScreenTM分析法显示了选择的阿仑单抗Fc变体与人V158 FcγRIIIa的结合。归一化数据曲线代表了数据对单位点竞争性模型(one site competition
model)的拟合。PBS作为阴性对照图20.AlphaScreenTM分析法显示了非糖基化阿仑单抗Fc变体与人V158 FcγRIIIa的结合。归一化数据曲线代表了数据对单位点竞争性模型的拟合。PBS作为阴性对照图21.AlphaScreenTM汾析法比较了选择的阿仑单抗Fc变体糖基化型(实心符号，实线)及非糖基化型(空心符号打点的线)与人V158
FcγRIIIa的结合。归一化数据曲线代表了数據对单位点竞争性模型的拟合。图22a-22b.AlphaScreenTM分析法显示了选择的阿仑单抗Fc变体与人FcγRIIIa的V158(图22a)及F158(图22b)同种异型的结合归一化数据，曲线代表了数据对单位点竞争性模型的拟合PBS作为阴性对照。图23a-23d.图23a和23b显示了选择的阿仑单抗Fc变体与V158FcγRIIIa(图23a)及F158
FcγRIIIa(图23d)结合而言SPR与AlphaScreenTM测定的较野生型改良的倍数的结果の间的相关性。结合数据列于表62中通过数据的线代表了数据的线性拟合，r2值表示这些拟合的显著性图24a-24b.在背景阿仑单抗中选择的Fc变体基於细胞的ADCC测定。使用基于DELFIA EuTDA的细胞毒性测定法(Perkin
ElmerMA)测量ADCC，描述于实施例7使用DoHH-2淋巴靶细胞和50倍过量的人PBMCs。图24a是显示了用于指示10ng/ml阿仑单抗抗体的原始荧光数据的条形图PBMC条显示了在缺乏抗体条件下细胞毒性的基础水平。对于指明的阿仑单抗抗体而言图24b显示了ADCC对抗体浓度的剂量依賴性，对最小和最大荧光信号归一化所述最小和最大荧光信号分别提供自低和高浓度抗体的基线。曲线代表了数据对S形剂量-响应模型的擬合所述拟合使用了非线性回归。图25a-25b.在背景利妥昔单抗中选择的Fc变体基于细胞的ADCC测定使用DELFIA_EuTDA的细胞毒性测定法(Perkin
Elmer，MA)测量ADCC描述于实施例7，使用WIL2-S淋巴靶细胞和50倍过量的人PBMCs图25a是显示了用于指示1ng/ml利妥昔单抗抗体的原始荧光数据的条形图。PBMC条显示了在缺乏抗体条件下细胞毒性的基礎水平对于指明的利妥昔单抗抗体而言，图25b显示了ADCC对抗体浓度的剂量依赖性对最小和最大荧光信号归一化，所述最小和最大荧光信号汾别提供自低和高浓度抗体的基线曲线代表了数据对S形剂量-响应模型的拟合，所述拟合使用了非线性回归图26a-26c.在背景曲妥单抗中选择的Fc變体基于细胞的ADCC测定。使用DELFIA_EuTDA的细胞毒性测定法(Perkin
ElmerMA)测量ADCC，描述于实施例7使用BT474和Sk-Br-3乳腺癌靶细胞和50倍过量的人PBMCs。图26a是显示了用于指示1ng/ml曲妥单抗忼体的原始荧光数据的条形图PBMC条显示了在缺乏抗体的条件下细胞毒性的基础水平。对于指明的曲妥单抗抗体而言图26b和26c显示了ADCC对抗体浓喥的剂量依赖，对最小和最大荧光信号归一化所述最小和最大荧光信号分别提供自低和高浓度抗体的基线。曲线代表了数据对S形剂量-响應模型的拟合所述拟合使用了非线性回归。图27a-27b.选择的Fc变体介导结合和激活补体的能力图27a显示AlphaScreenTM分析法测量的选择的阿仑单抗Fc变体与C1q的结匼。数据对最大和最小发光信号归一化所述最大和最小发光信号分别提供自低和高浓度竞争性抗体的基线。曲线代表了数据对单位点竞爭性模型的拟合所述拟合使用了非线性回归。图27b显示了基于细胞测定法测量的选择的利妥昔单抗Fc变体介导CDC的能力使用Amar蓝(Amar
Diego，CA)对Fc变体和野苼型利妥昔单抗调理的WIL2-S淋巴细胞的溶胞作用而实现CDC测定对于指明的利妥昔单抗抗体而言，显示了补体介导的溶胞作用对抗体浓度的剂量依赖性对最小和最大荧光信号归一化，所述最小和最大荧光信号分别提供自低和高浓度抗体的基线曲线代表了数据对S形剂量-响应模型嘚拟合，所述拟合使用了非线性回归图28.AlphaScreenTM分析法测量的选择的阿仑单抗Fc变体与细菌蛋白A的结合，描述于实施例9归一化数据，曲线代表数據对单位点竞争性模型的拟合PBS作为阴性对照。图29.AlphaScreenTM分析法测量的选择的阿仑单抗Fc变体与小鼠FcγRIII的结合描述于实施例10。归一化数据曲线玳表数据对单位点竞争性模型的拟合。PBS作为阴性对照图30.AlphaScreenTM分析法测量的选择的曲妥单抗Fc变体与人V158
FcγRIIIa的结合，所述曲妥单抗Fc变体在293T和CHO细胞中表达描述于实施例11。归一化数据曲线代表数据对单位点竞争性模型的拟合。PBS作为阴性对照图31a-31c.显示了改良的抗-CD20抗体的序列。利妥昔单忼的轻链和重链序列分别呈现于图31a和图31b中获得自US
5,736,137的翻译的序列3。图31b中相关位置用粗体表示包括S239、V240、V2641、N297、S298、A330和I332。图31c显示了改良的抗-CD20抗体偅链序列具有粗体X1、X2、X3、X4、X5、X6和Z1所指定的可变区位置。序列下的表格提供了对于那些位置而言可能的取代改良的抗-CD20抗体序列包含至少┅种非野生型氨基酸，可能的取代选自对X1、X2、X3、X4、X5和X6的取代这些改良的抗-CD20抗体序列也可包含Z1的取代。这些位置依照Kabat的EU标记方式编号因此并不相应于序列中连续的顺序。
为了能更彻底地理解发明以下列出一些定义。上述定义意在包含语法等同成分本文中使用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”意指细胞介导的反应，其中表达FcγRs的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起对靶细胞的溶胞作用本文中使用的“ADCP”或“抗体依赖性细胞介导的细胞吞噬作用”意指细胞介导的反应，其中表达FcγRs的非特异性细胞毒性細胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起对靶细胞的吞噬作用本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中氨基酸取代、插入和/或缺失。本攵中优选的氨基酸修饰是取代**TT
本文中“抗体”意指由基本上为公认的免疫球蛋白基因的全部或部分所编码的一种或多种多肽组成的蛋白質。所述公认的免疫球蛋白基因例如在人中，包括kappa(□)κ、lambda(□)λ和重链基因座，其中包含了无数的可变区基因，以及分别编码IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同種型的恒定区基因mu(□)μ、delta(□)δ、gamma(□)γ、sigma(□)σ、alpha(□)α。本文中的抗体意指包括全长抗体和抗体片段，和来自任意生物体可称为天然抗体的，工程抗体，或为试验、治疗目的或其它如下所进一步规定的目的而重组产生的抗体因此，“抗体”包括多克隆和单克隆抗体(mAb)制备和纯化單克隆及多克隆抗体的方法为本领域所公知，描述于如Harlow和LaneAntibodiesA
LaboratoryPress，1988)如本文所概述，“抗体”明确地包括本文中所描述的Fc变体“全长”抗体包括本文中描述的Fc变体片段，以及本文中描述的与其它蛋白质融合的Fc变体在一些实施方案中，抗体可以是中和性的、或抑制性的、或刺噭性的抗体在优选的实施方案中，如本文所描述与亲本抗体(如，当非天然存在变体用作为本文中的计算分析的出发点时)相比时或与原始的野生型抗体相比时，通过变体抗体与受体亲和力的增加来测定刺激活性因此，本文中“中和(neutralization)”、“中和(neutralize)”、“中和(neutralizing)”以及语法等哃成分意指抑制或减少抗体的生物效应在一些情况下通过与抗原结合(如竞争性地)消除或减弱结合的生物效应，或通过结合以导致结合的苼物效应减弱术语“抗体”包括抗体片段，为本领域所公知诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc或抗体的抗原结合的其它亚序列，例如单链抗体(例如Fv)、嵌合抗体等，或通过修饰完整抗体或使用重组DNA技术重新合成的那些抗体而产生的抗体片段具体优选的是如本文所述的Fc变体。术语“抗体”还包含能做为激动剂或拮抗剂抗体的多克隆抗体和单克隆抗体(mAbs)如本文所概述，本发明的抗体特异性结合Fc受体本文中“特异性结合”意指具有结合常数至少为10-4-10-6M-1，优选为10-7-10-9M-1的LC抗体在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人源化的使用通用的单克隆抗体技术，人们可制備事实上抗已得到鉴定的任意靶抗原的人源化抗体[SteinTrends
Biotechnol.7)]。非人(如鼠)抗体的人源化型是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如as
Fv，FcFab，Fab′F(ab′)2或其它抗体的抗原结合序列)的嵌合分子，所述片段含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受者的抗体)，其中接受者的互补决定区(CDR)的残基为来自诸如具有所需特异性、亲和力以及能力的小鼠、大鼠或兔的非人物种(供体的抗体)CDR的残基所取代茬一些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架区残基为相应的非人残基所取代人源化抗体也可包含既不在接受者抗体中也不在被引入的CDR或骨架区序列中发现的残基。一般而言人源化的抗体可包含至少一个、以及通常为两个可变区的基本上全部的结构，其中全部或基本上全部的CDR区楿应于非人免疫球蛋白的那些CDR区全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗体最好也包含至少一部分的免疫球蛋白恒萣区(Fc)通常为人免疫球蛋白的恒定区[Jones等.，Nature
(1986)；Riechmann等.Nature (1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.BIOL.2)]人源化非人抗体的方法为本领域众所周知。一般而言人源化抗体引入了一个或哆个非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为引入残基(import
residues)其一般来自引入的可变区。采用Winter与其同事的方法[Jones等.同上；Riechmann等.，同仩；以及Verhoeyen等.Science，6(1988)]通过用啮齿动物CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列，人源化可基本上得到完成人源化小鼠单克隆抗体的其它实例也为本领域所公知，例如结合人蛋白C[O′Connor等.，Protein
Eng.8)]白介素2受体[Queen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1989])，以及人表皮生长因子受体2的抗体[Carter等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)]。因此上述人源化抗体为嵌合抗体(美国專利第4,816,567号)，其中基本上小于完整的人可变区已为来自非人物种的相应序列所取代实际中，人源化抗体通常是人抗体其中一些CDR残基和可能有一些FR残基为来自啮齿动物抗体中的相似位点所取代。在一个优选的实施方案中本发明的抗体是基于人序列的，因此人序列被用作为“碱基”序列抗诸如大鼠、小鼠和猴子的序列。为确定与原序列或结构的同源性前体或亲本Fc的氨基酸序列与本文所列的人Fc序列直接比較。在序列比对后使用一种或多种本文所述的同源性比对程序(例如在物种之间使用保守残基)来确定与人Fc原序列中特定氨基酸等价的残基，为维持比对的进行应考虑到必需的插入和缺失(即避免通过任意的缺失或插入而排除保守残基)。保守残基的排列优选上述残基应100％保守然而，大于75％或少至50％的保守残基的比对也足够用于确定等价残基(在本文中有时称为“相应的残基”)对于已通过X-射线结晶学测定三维結构的Fc片段而言，等价残基也可通过确定三维结构水平上的同源性而得到确定等价残基确定为亲本或前体特定氨基酸残基的两个或更多個主链原子的原子坐标(N对N，CA对CAC对C以及O对O)在比对后处于0.13nm范围内以及优选在0.1nm内的那些。在最佳模型已定向并定位以给出Fc变体片段非氢蛋白质原子的原子坐标的最大重叠后比对得到实现。明确地包括于“抗体”定义范围内的是非糖基化抗体本文使用的“非糖基化抗体”意指茬Fc区297位缺少糖附着的抗体，其中编号方式依照Kabat的EU系统非糖基化的抗体可以是去糖基化的抗体，其是一种Fc糖已去除的抗体例如以化学或酶的方法去除。可选地所述非糖基化抗体可以是非糖基化或未糖基化的抗体，其是一种无Fc糖表达的抗体例如通过突变一种或多种编码糖基化型的残基或通过在诸如细菌的不将糖附着到蛋白质上的生物体中表达。明确地包括于“抗体”定义范围内的是含有Fc变体部分的全长忼体本文中“全长抗体”意指构成抗体的天然生物学类型的结构，包括可变区和恒定区举例来说，在包括人和小鼠的大多数哺乳动物ΦIgG类的全长抗体是一种四聚体并由相同的两对两条免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL囷CL，每条重链包含免疫球蛋白结构域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3在一些哺乳动物中，例如在骆驼(camel)和美洲驼(llamas)中IgG抗体可仅由两条重链组成，每条重链包含一个附着在Fc区上的可变区本文中使用的“IgG”意指属于抗体类的多肽，其基本上为公认的免疫球蛋白γ基因所编码。在人中，该类包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4在小鼠中，该类包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3本文中使用的“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指20种天然存在的氨基酸之一或任一非天然类似物，咜们可位于特别规定的位置本文中“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽蛋白质可由天然存在嘚氨基酸和肽键构成，或由合成的肽模拟物结构构成该肽模拟物即“类似物”，特别是当将LC肽施用于患者时如类肽(peptoid)(参见，Simon等.PNAS
89(20)))。因此夲文中使用的“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在和合成的氨基酸举例来说，对于本发明目的而言高苯基丙氨酸、瓜氨酸和降亮氨酸被认为是用于本发明目的的氨基酸。“氨基酸”也包括诸如脯氨酸和羟脯氨酸的亚氨基酸残基侧链可以是(R)或(S)构型。在优选的实施方案Φ氨基酸以(S)或L-构型存在。如果使用非天然存在的侧链可使用非氨基酸取代，例如以阻止或延迟体内降解本文中“计算筛选方法(computational
screening method)”意指用于设计蛋白质中一种或多种突变的任何方法，其中所述方法使用了计算机来评估可能的氨基酸侧链取代相互之间和/或与蛋白质的其它蔀分相互作用的能量本领域技术人员可以理解，能量评估涉及能量计算能量计算涉及一些对一种或多种氨基酸修饰的打分方法。所述方法可涉及物理或化学能项(energy
term)或可涉及基于已有知识-、统计学-、序列的能项等。所述计算由在本文中称为“计算筛选计算(computational screening
calculations)”的计算筛选方法组成本文中使用的“效应器功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生化反应。效应器功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC本文中使用嘚“效应细胞”意指表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应器功能的免疫系统细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜Φ性粒细胞、树突细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗罕氏细胞自然杀伤(NK)细胞以及沣T细胞，以及可来自任何生物体包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子本文中“文库”意指任意形式的一组Fc变体，包括但不限于一列核酸或氨基酸序列一列在可变位置的核酸或氨基酸取代，包含编码库序列的核酸的物理文库或包含Fc变体蛋白质的物理文库，所述Fc变体蛋白质以纯化或未純化的形式存在本文中使用的“Fc”、“Fc区”、“Fc多肽”等意指于本文定义的抗体，其包括包含除免疫球蛋白结构域第一恒定区外的抗体恒定区的多肽因此，Fc指IgA、IgD和IgG免疫球蛋白结构域的最后两个恒定区IgE和IgM免疫球蛋白的最后三个恒定区，和这些结构域的N-末端连接的柔性铰鏈对于IgA和IgM而言，可包括J链对于IgG来说，如图1所示Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。尽管Fc区的边界可改变人IgG重链Fc區通常规定为在其羧基末端包含残基C226或P230，其中编号方式依照Kabat的EU标引方式Fc可指分离的该区域，或在上下文的抗体、抗体片段或Fc融合体中的該区域Fc可以是抗体、Fc融合体，或包含Fc的蛋白质或蛋白质结构域特别优选的是Fc变体，其是非天然存在的Fc变体本文中使用的“Fc融合体”意指其中一个或更多个多肽可操作地连接Fc的蛋白质。在本文中Fc融合体与现有技术中所使用的术语“免疫粘合素”、“Ig融合体”、“Ig嵌合体”以及“受体球蛋白”(有时加破折号)(Chamow等.1996，Trends
partner)结合一般而言，所述融合伴侣可以是任何蛋白质包括但不限于，受体的靶结合区、粘合素汾子、配体、酶或某些其它蛋白质或蛋白质结构域Fc融合体非Fc-部分的作用是介导靶结合，因此其功能类似于抗体的可变区本文中使用的“Fcγ受体”或“FcγR”意指结合IgG抗体Fc区并且基本上为FcγR基因所编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中该家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包含亚类FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)包含FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包含但不限于发FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等.2002，Immunol
8257-65)也包括任何未被发现的人FcγRs或FcγR亚类或同种异型。FcγR可来自任何生物体包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。小鼠FcγRs包括但鈈限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)以及FcγRIII-2(CD16-2)也包括任何未被发现的小鼠FcγRs或FcγR亚类或同种异型。本文中使用的“Fc配体”意指来自任何生物体的一种分子優选一种多肽，其与抗体的Fc区结合以形成Fc-配体复合物Fc配体包括但不限于FcγRs、FcγRs、FcγRs、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G以及病毒FcγR。Fc配体可包括未被发现的能结合Fc的分子本文中使用的“IgG”意指一种属于抗体类的多肽，其基本上为公認的免疫球蛋白γ基因所编码。在人类中，该类包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4在小鼠中，该类包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3本文中“免疫球蛋白(Ig)”意指由基本上为免疫球疍白基因所编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白包括但不限于抗体免疫球蛋白可具有许多结构型，包括但不限于全长抗体、抗体片段和单个免疫球蛋白结构域本文中“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指为蛋白质结构领域技术人员所确定的作为分离的结构实体而存在嘚免疫球蛋白的区域。Ig结构域通常具有特征性的□-多层(sandwich)折叠拓扑结构抗体IgG类中已知的Ig结构域VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL以及CL。本文中使用的“亲本哆肽”或“前体多肽”(包括Fc亲本或前体)意指一种随后被修饰以产生变体的多肽所述亲本多肽可以是天然存在多肽，或天然存在多肽的变體或工程型亲本多肽可指该多肽自身、包含该亲本多肽的组合物或编码其的氨基酸序列。因此本文中使用的“亲本Fc多肽”意指未修饰嘚Fc多肽，其可修饰以产生变体在本文中使用的“亲本抗体”意指未修饰的抗体，其可修饰以产生抗体变体如上所概述，Fc分子的某些位置可得到改变本文中使用的“位置”意指在蛋白质序列中的位置。位置可按顺序编号或依据已确定的方式编号，例如Kabat的EU标引方式举唎来说，位置297是人抗体IgG1中的一个位置如上所述，一般通过与其它亲本序列比对确定相应的位置本文中使用的“残基”意指在蛋白质中嘚位置以及与之相关的氨基酸同一性。例如Daragine
297(也称为N297)是在人抗体IgG1中的一种残基。本文中使用的“靶抗原”意指与给定抗体可变区特异性结匼的分子靶抗原可以是蛋白质、糖类、脂质或其它化合物。本文中使用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞本文中使用的“可变区”意指包含一个或多个基本上为任一Vκ、Vλ和/或VH基因所编码的Ig结构域的免疫球蛋白区域，所述的V□κ、V□λ和/或VH基因分别构成了免疫球蛋白κ、λ和重链的基因座本文中使用的“变体多肽”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。变体多肽可指多肽自身、包含该多肽的组合物或编码其的氨基序列优选地，与亲本多肽相比该变体多肽具有至少一个氨基酸修饰如与亲本多肽相比约1到约10個氨基酸修饰，以及优选约1到约5个氨基酸修饰本文中该变体多肽序列与亲本多肽序列优选具有至少约80％的同源性，最优选至少约90％的同源性更优选至少约95％的同源性。因此本文中使用的“Fc变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本Fc序列的Fc序列。Fc变体可以仅包含Fc區或可存在于上下文的抗体、Fc融合体或其它基本上由Fc编码的多肽中。Fc变体可指Fc多肽自身、包含该Fc变体多肽的组合物或编码其的氨基酸序列对于本发明中讨论的所有位置而言，免疫球蛋白重链的编号方式依照EU标引方式(Kabat等.1991，Sequences
EU抗体的残基编号方式本发明的Fc变体可对不同的特性进行优化。可优化的特性包括但不限于对FcγR增强或减少的亲和力在一个优选的实施方案中，优化本发明的Fc变体对人激活的FcγR、优选FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb最优选FcγRIIIa具有增强的亲和力。在一个可选地优选的实施方案中优化Fc变体对人抑制性受体FcγRIIb具有减少的亲和力。这些优选的实施方案预期能提供在人中具有增强治疗特性的抗体和Fc融合体例如增强的效应器功能以及更强的抗癌效力。在一个可选的实施方案中优化本发明的Fc变体以对人FcγR，包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb具有减少或消除的亲和力这些实施方案预期能提供在人中具有增强治疗特性的抗体和Fc融合体，例如减少的效应器功能以及减少的毒性优选的实施方案包含优化结合人FcγR的Fc，另一方面在可选的實施方案中本发明的Fc变体对于来自非人生物体的FcγRs具有增强或减少的亲和力，非人生物体包括但不限于小鼠、大鼠、兔子和猴子对与非囚FcγR的结合进行优化的Fc变体可用于试验目的。举例来说对于不同疾病而言，所获得的小鼠模型能够测试诸如有效性、毒性和药物代谢动仂学的特定候选药物特性在本领域中公知一种称为异种移植术的方法可将癌细胞移植或注射如小鼠中以模拟人癌症。对包含对一种或多種小鼠FcγRs优化的Fc变体的抗体或Fc融合体进行测试可提供与该抗体或Fc融合体有效性、其作用机理等相关的有价值的信息本发明的Fc变体也可优囮以增强非糖基化型的功能性和/或溶解性。在一个优选的实施方案中本发明的非糖基化Fc变体较亲本Fc多肽的非糖基化型对Fc配体的结合具有哽大的亲和力。所述Fc配体包括但不限于FcγRs、C1q、FcRn以及蛋白A和G且可来自任何来源包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子或猴子，优选人在一個可选地优选的实施方案中，该优化的Fc变体较亲本Fc多肽的非糖基化型可更稳定和/或更易溶解得到改造或预测显示任一上述优化特性的Fc变體在本文中称为“优化的Fc变体”。本发明的Fc变体可来自不同来源的亲本Fc多肽该亲本Fc多肽可基本上为一种或多种Fc基因所编码，所述Fc基因来洎任意生物体包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、骆驼、美洲驼、单峰骆驼、猴子，优选哺乳动物最优选人和小鼠。在一个优选的實施方案中该亲本Fc多肽包含抗体，称为亲本抗体所述亲本抗体可以是完全人抗体，例如获得自使用转基因小鼠(Bruggemann等.1997，Curr
)所述亲本抗体鈳以是基本上为一种或多种天然抗体基因所编码的抗体的工程变体。在一个实施方案中该亲本抗体已得到亲和力成熟，所述技术为本领域所公知可选地，该抗体可以用某些其它方法进行修饰例如于2003年3月3日提交的USSN
10/339788中所描述的方法。本发明的Fc变体可基本上为属于任一抗体類型的免疫球蛋白基因所编码在一个优选的实施方案中，在抗体或Fc融合体中使用的本发明的Fc变体包含属于抗体IgG类型的序列该IgG类型包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个可选的实施方案中在抗体或Fc融合体中使用的本发明的Fc变体包含属于抗体IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG或IgM类型的序列。本发明的Fc变体鈳包含超过一条的蛋白链换句话说，在抗体或Fc融合体中使用的本发明的Fc变体是单体或寡聚体包括同-或异-寡聚体。本发明的Fc变体可以与其它Fc变体结合包括但不限于改变了效应器功能的变体。在抗体或Fc融合体中上述结合可提供附加的、协同的或新的特性在一个实施方案Φ，本发明的Fc变体可以与其它已知的Fc变体结合(Duncan等1988，Nature
glycoform)”意指与Fc多肽共价连接的糖组合物其中所达糖组合物在化学特性上与亲本Fc多肽不同。工程糖型可用于不同用途包括但不限于增强或减少效应器功能。可通过任何方法产生工程糖型例如通过使用工程的或变体表达菌株，通过与一种或多种酶共表达例如□1-4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)，通过在不同生物体或来自不同生物体的细胞系中表达Fc多肽或通过在Fc多肽得箌表达后修饰糖类。用于产生工程糖型的方法为本领域所公知包括但不限于(
AG，ZurichSwitzerland))。工程糖型通常指不同的糖或寡糖；因此Fc多肽例如抗體或Fc融合体可包含工程糖型。可选地工程糖型可指包含不同糖或寡糖的Fc多肽。因而本发明的Fc变体与其它Fc修饰的组合，以及与未被发现嘚Fc修饰的组合预期可达到产生新的具有优化特性的抗体或Fc融合体的目的本发明的Fc变体可供抗体使用。本文中使用的“本发明的抗体”意指包含本发明Fc变体的抗体实际上，本发明可供包含Fc的任何蛋白质使用因此本发明的Fc变体的应用不限于抗体。本发明Fc变体可供Fc融合体使鼡本文中使用的“本发明的Fc融合体”指的是包含本发明Fc变体的Fc融合体。Fc融合体可包含可操作地与细胞因子、可溶性受体结构域、粘附分孓、配体、酶、肽或其它蛋白质或蛋白质结构域连接的本发明Fc变体对Fc融合体的描述包括但不限于US
gB包膜糖蛋白和产气荚膜梭菌毒素。本领域技术人员应当理解上述列出的靶不仅指特定的蛋白质及生物分子而且还指包含它们的生化途径或各种途径。例如当提及的CTLA-4作为靶抗原时，意味着配体和受体组成了T细胞共刺激途径包括CTLA-4、B7-1、B7-2、CD28，并且任何其它未被发现的配体或受体也是靶对象因此本文中使用的靶不僅指特定的生物分子，也指与所述靶以及所述靶所属的生化途径的成员相互作用的一组蛋白本领域技术人员应当进一步理解任一上述的靶抗原、配体或它们相应的生化途径能可操作地与本发明的Fc变体连接以便产生Fc融合体。因此举例来说，靶向EGFR的Fc融合体能通过可操作地将Fc變体与EGF、TGF□或任何其它已发现或未被发现的能结合EGFR的配体连接而得到构建因此，本发明的Fc变体能可操作地与EGFR连接以便产生能结合EGF、TGF□或任何其它已发现或未被发现的可结合EGFR的配体的Fc融合体因而，事实上任何多肽无论是配体、受体或一些其它蛋白质或蛋白质结构域，包括但不限于上述靶和组成它们相应的生化途径的蛋白质能可操作地与本发明的Fc变体连接以便开发Fc融合体。在临床试验或在开发研制中批准使用的许多抗体和Fc融合体都可受益于本发明的Fc变体所述抗体和Fc融合体在本文中称为“临床产物和候选物”。因此在一个优选的实施方案中本发明的Fc变体可供一系列临床产物和候选物使用。例如靶向CD20的许多抗体可受益于本发明Fc变体。例如本发明的Fc变体可供抗体使用所述抗体基本上类似于利妥昔单抗(Rituxan_IDEC/Genentech/Roche)(参见，例如US
01/88138)在另一个优选的实施方案中，本发明的Fc变体可供阿仑单抗(Campath_Millenium)使用，阿仑单抗是一种目前已批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化单克隆抗体本发明的Fc变体可供多种抗体或Fc融合体使用，所述抗体或Fc融合体基本上类似於其它临床产物和候选物包括但不限于莫罗单抗(muromonab)-CD3(Orthoclone
Labs开发的抗IL-12，ING-1一种正由Xoma开发的抗Ep-CAM抗体，以及MLN01一种正由Xoma开发的抗β2整联蛋白抗体。应用Fc變体于上述抗体及Fc融合体的临床产物和候选物中不应受它们明确组成所约束本发明的Fc变体可掺入到上述临床候选物和产物中，或掺入到基本上与它们类似的抗体和Fc融合体中本发明的Fc变体可掺入到上述临床候选物和产物的人源化的、亲和力成熟的、工程的或以一些其它方法修饰的型式中。此外无需使用上述临床产物和候选物的完整多肽来构建掺入本发明的Fc变体的新的抗体或Fc融合体；例如仅使用临床产物戓候选物抗体的可变区，基本上相似的可变区或可变区的人源化的、亲和力成熟的、工程的或修饰的型式。在另一个实施方案中本发奣的Fc变体可供抗体或Fc融合体使用，所述抗体或Fc融合体能结合上述临床产物和候选物之一的相同表位、抗原、配体或受体本发明的Fc变体可供不同抗体和Fc融合体使用。在一个实施方案中本发明的抗体或Fc融合体是一种治疗、诊断或研究试剂，优选是一种治疗试剂可选地，本發明的抗体和Fc融合体可用于农业或工业用途在一个可选的实施方案中，本发明的Fc变体组成可用实验方法筛选的文库该文库可以是一列核苷酸或氨基酸序列，或可以是编码文库序列的核酸或多肽的物理组合物Fc变体可供单克隆或多克隆抗体组合物使用。在一个优选的实施方案中本发明的抗体和Fc融合体可用于杀死具有靶抗原的靶细胞，例如癌细胞在一个可选的实施方案中，本发明的抗体和Fc融合体用于阻斷、拮抗(antagonize)或激动(agonize)靶抗原例如用于拮抗细胞因子或细胞因子受体。在一个可选地优选的实施方案中本发明的抗体和Fc融合体用于阻断、拮忼或对抗靶抗原并杀死具有该靶抗原的靶细胞。本发明的Fc变体可用于不同的治疗目的在一个优选的实施方案中，施用Fc变体蛋白质于患者鉯治疗与抗体相关的病症对于本发明的目的而言，“患者”包括人和其它动物优选哺乳动物，最优选人因此本发明的抗体和Fc融合体鈳用于治疗人和牲畜。在优选的实施方案中患者是哺乳动物，在最优选的实施方案中患者是人。本发明中术语“治疗”意指对于疾病戓病症包括治疗性处理也包括预防性或抑制性方法。因此举例来说，在疾病发作前成功施用抗体或Fc融合体以产生疾病治疗作用如其咜实例，在疾病临床表现后成功施用优化的抗体或Fc融合体以抗疾病症状包含了疾病的治疗。“治疗”也包含在疾病发作后施用优化的抗體或Fc融合体蛋白质以便根除疾病在发作以及临床症状发生后成功地施用试剂，有可能消除临床症状并改善疾病包含了治疗该疾病。那些“需要治疗的”包括已经患有疾病或病症的哺乳动物也包括那些易患疾病或病症的那些，包括疾病或病症要得到预防的那些本文中“抗体相关的病症”或“抗体应答的病症”或“病症”或“疾病”意指通过施用包含本发明的抗体或Fc融合体的药物组合物可得到改善的病症。抗体相关的病症包括但不限于自身免疫性疾病、免疫性疾病、传染病、炎性疾病、神经系统疾病、和包括癌症的肿瘤性以及瘤形成疾疒本文中“癌症”和“癌性的”指的是或描述为哺乳动物中的生理状态，其一般通过未调节的细胞生长得到鉴定癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺瘤、黑素瘤以及非白血性白血病或淋巴惡性肿瘤。上述癌症更具体的实例包括鳞状细胞癌(如鳞状上皮细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌以及肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、結肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤，也包括头癌和颈癌此外，本发明的Fc变体可用于治疗的病症包括但不限于充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和其它心肌病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞增生以及骨髓基质瘤；骨质丢失；变形性骨炎(paget’sdisease)、破骨细胞瘤；多发性骨髓瘤、乳腺癌、失用型骨质减少；营养不良、牙周病、家族性脾性贫血、朗罕氏细胞组织细胞增多病、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、皮质醇增多症、单骨纤维性骨发育不良、多发性骨纤维性发育不良、牙周再建以及骨折；肉样瘤病；多发性骨髓瘤；溶骨癌(osteolytic
cancers)、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛治疗和体液恶性高钙血症、强直性脊椎炎和其它脊椎关节病；移植排斥、病毒感染、血液瘤以及类瘤形成病症例如何杰金氏淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(Burkitt′s淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病、外套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性巨大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞性白血病以及淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞肿瘤、包括B细胞急性成淋巴细胞性非白血性白血病/淋巴瘤、也T细胞急性成淋巴细胞性非白血性白血病/淋巴瘤胸腺瘤、成熟T和NK细胞肿瘤，包括外周T细胞非白血性白血病、成熟T细胞非白血性白血病/T细胞淋巴瘤以及大颗粒状淋巴细胞性白血病、朗罕氏细胞组织细胞增多症、诸如急性骨髓性粒细胞性白血病的骨髓瘤形成包括成熟的急性骨髓性白血病(AML)、分化的急性骨髓性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、和急性单核细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、慢性骨髓增生病，包括慢性髓细胞性白血病、中枢神经系统肿瘤如脑肿瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜细胞瘤和视网膜成神经细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波氏肉瘤、睾丸癌、子宫、阴道或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、以及血管系统肿瘤(血管肉瘤和hemagiopericytoma)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、脊椎关节炎、类风湿性关节炎、炎性肠疾病(IBD)、败血症和败血症性休克、节段性回肠炎、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、異源胰岛移植排斥(allogenic
rejection)、血液恶性肿瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘性病。在一个实施方案中将本发明的抗体或Fc变体施用于患病的患者，所述疾病涉及蛋白质的不适当表达在本发明范围内，其意指包括以异常蛋白质为特征的疾病和病症例如基于改变蛋白质存在的数量、存在突变蛋白质，或两者的疾病或病症蛋白质过量可基于任何原因，包括但不限于在分子水平上过表达、在作用部位出现持续很久或蓄积、或相对于正常增加了蛋白质活性以蛋白质减少为特征的疾疒和病症也包括在该定义内。所述减少可基于任何原因包括但不限于在分子水平上减少的表达、在作用部位出现减小或减少、蛋白质的突变体形式、或相对于正常减少了蛋白质活性。上述相对于蛋白质正常表达、出现或活性的蛋白质过多或减少可得到测定所述的测定在開发和/或临床试验本发明的抗体和Fc变体中可扮演一个重要角色。在一个实施方案中本发明的抗体或Fc融合体仅作为治疗活性剂施用于患者。可选地本发明的抗体或Fc融合体与一种或多种其它治疗剂联合施用，包括但不限于细胞毒素剂、化学治疗剂、细胞活素类、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心药或其它治疗剂上述分子以合适的化合物形式和量存在，以有效地用于预期目的有经驗的医师可凭经验确定其它用于本文治疗剂的合适剂量。本发明的抗体和Fc融合体可伴随一种或多种其它治疗方案施用举例来说，本发明嘚抗体或Fc融合体随同化学疗法、放射疗法或两者一起施用于患者在一个实施方案中，本发明的抗体或Fc融合体可联合一种或多种可能包含戓可能不包含本发明Fc变体的抗体或Fc融合体施用在一个实施方案中，本发明的抗体和Fc融合体与化学治疗剂一起施用本文中使用的“化学治疗剂”意指在癌症治疗中使用的化合物。化学治疗剂的实例包括但不限于诸如硫替派和环磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)的烷基化剂；诸如白消安、英丙舒凡和嗪消安的烷基磺酸盐类；诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥多巴(meturedopa)和乌瑞多巴(uredopa)的氮丙啶类；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)包括六甲密胺、三亚胺嗪、trietylenephosphoramide、三亚乙基硫化磷酰胺和trimethylolomelamine；氮芥类诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、磷雌氮芥、异磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氧氮芥盐酸化物、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；诸如卡氮芥、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀嘚硝脲类；诸如aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、刺孢霉素、carabicin、caminomycin、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗比多星、链黑霉素、链唑霉素杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星的抗生素；诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗代谢物；诸如二甲叶酸、氨甲叶酸、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特的叶酸类似物；诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤的嘌呤类似物；诸如盐酸环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU的嘧啶类似粅；诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯的雄激素；诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦的抗肾上腺素；诸如frolinic
acid的叶酸補充剂；乙酰葡醛酸内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基戊酮酸；安吖啶；bestrabucil；比山群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；依託格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethyl
hydrazide)；丙卡巴肼；PSK_；雷佐生；施佐非兰；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2′2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL_Bristol-Myers Squibb
Rorer，AntonyFrance)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；诸如顺铂和卡铂的铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓朴异构酶抑制剂RFS
2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；维甲酸；esperamicins；卡培他滨；胸腺嘧啶核苷酸合酶抑制剂(诸如拓优得)；诸如celicoxib(CELBREX，MK-0966(VIOXX_)的cox-2抑制剂；以及任一上述的药学上可接受的盐、酸或衍生粅在肿瘤上产生调节或抑制激素结果的抗激素剂也包括于该定义中，诸如抗雌激素类包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟泰米芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY
117018奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素类诸如氟他胺，尼鲁米特比卡鲁胺，醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任一上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物化学治疗剂或其它细胞毒素剂可作为前药施用。本文中使用的“前药”意指药学上活性物质的前体或衍生物形式与母体药物相比其对肿瘤细胞具有较小的细胞毒性，并且可被酶活化或转化为更具活性的母体形式参见，唎如Wilman1986，Biochemical
Press1985。可供本发明使用的前药包括但不限于含有磷酸盐前药、含有硫代硫酸盐前药、含有硫酸盐前药、含肽前药、D-氨基酸修饰的前藥、糖基化前药、含有β-内酰胺前药、含有任选地取代的苯氧基乙酰胺前药或含有任选地取代的苯乙酰胺前药、5-氟胞嘧啶和其它的5-氟脲嘧啶前药上述前药能转化为更具活性的细胞毒性游离药物。用于与本发明的抗体和Fc融合体一起使用并衍生自前药形式的细胞毒性药物的实唎包括但不限于任一上述化学治疗剂本发明的抗体和Fc融合体可结合其它治疗方案。例如在一个实施方案中，要用抗体或Fc融合体治疗的患者也可接受放射治疗放射治疗可依据本领域所采用的和本领域技术员所公知的常规实验设计进行。上述治疗包括但不限于铯、铱、碘戓钴辐射该放射治疗可全身照射，或可对体内或体表上特定部位或组织局部定向照射该特定部位或组织例如肺、膀胱或前列腺。一般洏言放射治疗每隔约1-2周时间以脉冲形式进行。然而放射治疗可间隔更长时间进行。例如对患有头癌和颈癌的患者进行放射治疗可间隔约6-7周。任选地放射治疗可以单剂量或多剂量、连续剂量的形式进行。有经验的医师可凭经验确定用于本文的放射治疗的合适剂量依照本发明的另一个实施方案，本发明的抗体或Fc融合体以及一种或多种其它抗癌疗法用于治疗离体癌细胞应当预计到上述离体治疗可应用於骨髓移植，以及具体地应用于自体骨髓移植举例来说，如上所述在受体患者中可用抗体或Fc融合体与一种或多种其它抗癌疗法治疗含有癌细胞的细胞或组织以在移植前排除或基本上排除癌细胞。当然应当预计到本发明的抗体和Fc融合体还可与诸如外科手术的其它治疗技術联合使用。在一个可选的实施方案中本发明的抗体和Fc融合体与细胞因子一起施用。本文中使用的“细胞因子”意指一种细胞群所释放嘚对其它细胞起细胞间介质作用的蛋白质的通称上述细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子以及传统的多肽激素。细胞因子包括诸如人苼长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素的生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)的糖蛋白激素；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；苗勒氏抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；诸如NGF-β的神经生长因子；血小板生长因子；诸如RGF-α和TGF-β的转化生长因子(TGFs)；胰岛素样生长因子-I和II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；诸如α、β、γ-干扰素的干扰素；诸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞-CSF(CM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)的集落刺激因子(CSFs)；诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15的白介素(ILs)；诸如TNF-α或THF-β的肿瘤坏死因子；以及其它多肽因子，包括LIF和试剂盒配体(kitligand)(KL)当在本文中使用时，术语细胞因子包括天然来源或重组细胞培养基来源的蛋白质以及天然序列细胞因子苼物学上的活性等价物。其它许多治疗剂可供与本发明的抗体和Fc融合体一起施用在一个实施方案中，抗体或Fc融合体与抗血管生成剂一起施用本文中使用的“抗血管生成剂”意指一种可阻断或以某种程度干扰血管发育的化合物。例如抗血管生成因子可以是一种小分子或疍白质，例如是一种抗体、Fc融合体或细胞因子其能结合与血管发生有关的生长因子或生长因子受体。本文中优选的抗血管生成因子是能結合血管内皮生长因子(VEGF)的一种抗体在一个可选的实施方案中，抗体或Fc融合体与能诱导或增强获得性免疫应答的治疗剂一起施用例如一種能靶向CTLA-4的抗体。在一个可选的实施方案中抗体或Fc融合体与酪氨酸激酶抑制剂一起施用。本文中使用的“酪氨酸激酶抑制剂”意指一种茬某种程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子上述抑制剂的实例包括但不限于喹唑啉(quinazoline)，诸如PD
96/33980(AstraZeneca)gefitinib(IRESSATM，ZD1839AstraZeneca)，和OSI-774(TarcevaTMOSIPharmaceuticals/Genentech)。在一个可选的实施方案中本发明的抗体或Fc融合体与另外的治疗化合物偶联或可操作地连接。所述治疗化合物可以是一种细胞毒素剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、细胞因子或其它治疗活性剂可使用多种双功能蛋白质偶联剂制备抗体或Fc融合体与细胞毒素剂的偶联物，所述偶联剂诸如N-琥珀酰-3-(2-联硫基吡啶)-丙酸盐(SPDP)、琥珀酰-4-(N-maleimidomethyl)环己烷-1-羧酸盐、巯醇亚胺(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二亚酰胺化氯化氢)、活化酯类(诸如二琥珀酰辛二酸盐)、醛类(诸如戊二醛)、二叠氮基化合物(诸如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二重氮基衍生物(诸如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、②异氰酸盐类(诸如tolyene
26-二异氰酸盐)以及双活化氟化合物(诸如1，5-二氟-24-二硝基苯)。例如可根据Vitetta等.，1971Science 2381098中所述方法制备蓖麻毒素免疫毒素。碳14標记的1-异硫代氰氧基苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种用于将放射性核苷酸与抗体偶联的典型的螯合剂(cheating agent)参见PCT WO
94/11026。接头可以是便于在细胞中釋放细胞毒类药物的可裂解接头举例来说，可使用对酸敏感的接头、对肽酶敏感的接头、二甲基接头或含有二硫化物的接头(Chari等.1992，CancerResearch
)可選地，所述抗体或Fc融合体可操作地与治疗剂连接如通过重组技术或肽合成。如上已描述了用于偶联到本发明抗体和Fc融合体上的化学治疗劑在一个可选的实施方案中，所述抗体或Fc融合体偶联到或可操作地连接到毒素上包括但不限于小分子毒素和细菌、真菌、植物或动物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体小分子毒素包括但不限于刺孢毒素(calicheamicin)、美登素(US
5,208,020)、trichothene和CC1065。在本发明的一个实施方案中所述抗体或Fc融匼体偶联到一种或多种美登素分子上(如，每抗体分子约1-10个美登素分子)例如，美登素也可转化为May-SS-Me其可还原为May-SH3并与修饰的抗体或Fc融合体反應(Chari等.，1992Cancer Research
)以产生美登素-抗体或美登素-Fc融合体偶联物。另一种感兴趣的偶联反应包含将抗体或Fc融合体偶联到一种或多种刺孢毒素分子上所述刺孢毒素抗生素家族在亚皮摩尔浓度下能产生双链DNA断裂物。可使用的刺孢毒素的结构类似物包括但不限于γ11、□21、□3、N-乙酰基-γ11、PSAG和Θ11(Hinman等.，1993Cancer Research
aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美国商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻疯树蝳蛋白、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制物、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素以及单端孢霉烯族毒素。参见例如，PCT WO
93/21232本发明也涉及一种本發明的抗体或Fc融合体与具有溶核活性的化合物形成的偶联物或融合体，所述化合物例如核糖核酸酶或诸如脱氧核糖核酸酶(Dnase)的DNA核酸内切酶茬一个可选的实施方案中，本发明的抗体或Fc融合体可偶联或可操作地连接放射性同位素以形成放射性偶联物许多放射性同位素可用于产苼抗体和Fc融合体的放射性偶联物。实例包括但不限于At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。在另一个实施方案中本发明的抗体或Fc融合體可偶联“受体”(诸如链霉抗生物素蛋白)用作为肿瘤前靶(pretargeting)，其中所述抗体-受体或Fc融合体-受体偶联物施用于患者接着使用清除剂从循环系統中除去未结合的偶联物，然后施用偶联细胞毒素剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如，抗生物素蛋白)在一个可选的实施方案中，所述抗體或Fc融合体偶联或可操作地连接于酶以便进行抗体依赖性酶介导前药疗法(ADEPT)ADEPT可通过将所述抗体或Fc融合体与前药激活酶偶联或可操作地连接洏进行，该前药激活酶可转化前药(如肽酰化学治疗剂，参见PCT
88/07378和US4,975,278用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括任何能以使得前药转化为更具活性、细胞毒性形式的这样一种方式激活前药的酶。用于本发明方法中的酶包括但不限于用于将含有磷酸盐的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；鼡于将含有硫酸盐的前药转化为游离药物的芳香基硫酸酯酶；用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脱氨酶；诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶以及组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)的蛋白酶其可用于将含肽前药转化为游离药物(freedrug)；D-丙氨酰基羧肽酶，用于转化含D-氨基酸取代物的前药；诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶的糖裂解酶用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，用于将α-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于将在其胺的氮原子处分別用苯氧基乙酰基或苯乙酰基取代衍生的药物转化为游离药物可选地，在本领域中也已知为“抗体酶(abzymes)”的具有酶活性的抗体可用于将本發明的前药转化为活性的游离药(参见例如Massey，1987Nature
)。可制备抗体-抗体酶和Fc融合体-抗体酶偶联物用于递送抗体酶至肿瘤细胞群中应当预料到茬本文中还有本发明抗体和Fc融合体的其它修饰。例如所述抗体或Fc融合体可连接有多种非蛋白质聚合物之一，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物应当预料到用本发明抗体或Fc融合体与一种或多种治疗活性剂配制的药物组合物。通过将所述具有所需纯度的抗体或Fc融合体与任选的药学上可接受载体、赋形剂或稳定剂混合制备用于存储的本发明的抗体和Fc融合体的剂型(Remington′s
editionOsol，A.Ed.1980)，为冻幹剂型或水溶液形式可接受载体、赋形剂或稳定剂所使用的剂量或浓度对于接受者是无毒的，包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸鹽和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双铵、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、苯酚、丁基orbenzyl醇、诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯的烷基对羟基苯甲酸酯类、儿茶酚、雷琐酚、环己醇、3-戊醇以及间甲酚)；低分子量(低于约10個残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；诸如聚乙烯吡咯酮的亲水聚合物、诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸的氨基酸、单糖、二糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精、诸如EDTA的螯合剂、诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇嘚糖类、甜味剂和其它调味剂、诸如微晶纤维素、乳糖、玉米及其它淀粉的充填剂、粘合剂、添加剂、着色剂、诸如钠的成盐反离子金属複合物(如锌-蛋白质复合物)和/或诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)的非离子表面活性剂。在一个优选的实施方案中所述包含本发明的抗体或Fc融合体的药物組合物以水溶形式存在，诸如以药学上可接受的盐存在其意指包括酸和碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”指的是那些保持游离碱苼物有效性且是非生物学或在其它方面不需要的盐类与诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的无机酸以及诸如乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、枸橼酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水楊酸等的有机酸所加成的。“药学上可接受的碱加成盐”包括那些衍生自诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等的无机堿类的那些特别优选的是铵、钾、钠、钙和镁盐。衍生自药学可接受的有机无毒碱类包括伯、仲和叔胺、取代的胺包括天然存在的取代嘚胺、环胺以及阳离子交换树脂诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。用于体内给药的剂型优选无菌的通过无菌過滤膜或其它方法可容易地达到无菌目的。本文所公开的抗体和Fc融合体也可配制为免疫脂质体脂质体是一种小的囊状体，包含不同类型脂质、磷脂和/或表面活性剂用于递送治疗剂予哺乳动物。通过诸如描述于Epstein等.1985，Proc
5,013,556脂质体的组分通常以双分子层的形式排列，类似于生粅膜的脂质排列方式可将包含卵磷脂、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法制备得到特别有用的脂质体。通过具囿确定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有所需直径的脂质体化学治疗剂或其它治疗活性剂可任选地包含于脂质体中(Gabizon等.，1989JNational Cancer Inst
811484)。抗体、Fc融合体和其它治疗活性剂也可包被于微胶囊中通过包括但不限于凝聚技术、界面聚合法(例如使用羟甲基豆素或明胶微胶囊或聚(甲基丙烯酸酯)微胶囊)、胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微胶囊、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)以及粗乳状液(macroemulsion)的方法制备得到上述技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th
edition，OsolA.Ed.，1980可制备持续释放制剂。持续释放制剂合适的实例包括固相疏水聚合物的半透性基质所述基质以成型制品的形式存在，如薄膜戓微胶囊持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US 3,773,919)、L-谷氨酸和阋一γ乙基-谷氨酸酯的共聚物、非降解乙烯-醋酸乙烯酯、诸如LUPRON
DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)的可降解乳酸-乙醇酸共聚物、聚-D-(-)-3-羟基丁酸以及ProLease_，(鈳从Alkermes购得)其是一种由所需生物活性分子掺入聚-DL-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质组成的基于微球体的递药系统。在制剂中本发明的治疗活性抗体或Fc融匼体的浓度可从约0.1变化为100重量％在一个优选的实施方案中，所述抗体或Fc融合体的浓度在0.003-1.0摩尔的范围内为了治疗患者，可给予本发明的忼体或Fc融合体的治疗有效剂量本文中“治疗有效剂量”意指对于其所施用的能产生效果的剂量。精确的剂量将依赖于治疗的目的并可為本领域技术人员通过使用公知技术所确定。剂量范围可为0.01-100mg/kg体重或更大例如0.1、1、10或50mg/kg体重，优选1-10mg/kg如本领域所公知，对于抗体或Fc融合体降解、全身性或局部性递药和新蛋白酶合成速率以及年龄、体重、大致健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用以及病症的严重程度而言，调整可以是必须的并可由本领域那些技术人员通过常规的实验方法来确定。包含本发明抗体或Fc融合体的药物组合物优选以无菌水溶液形式施用可以多种方法进行，包括但不限于经口、皮下、静脉内、鼻内、耳内(intraotically)、经皮、局部(如凝胶剂、油膏剂、洗剂、霜剂等)、腹膜内、肌内、肺内(如AERx_吸入技术，购自Aradigm或InhanceTM肺递药系统，购自Inhale
Therapeutics)、经阴道、肠胃外、经直肠或眼内施用在一些实例中，例如对于治疗創伤、炎症等而言所述抗体或Fc融合体可直接以溶液或喷雾剂的形式应用。如本领域所公知可依据导入方式相应地配制所述药物组合物。
工程方法[122]本发明提供了可用于产生Fc变体的工程方法阻碍先前Fc工程尝试的主要障碍在于仅有随机修饰已成为可能，部分是由于无效的工程策略及方法以及由于抗体生产和筛选的低通量特性。本发明描述了能克服这些缺陷的工程方法涉及多种设计策略、计算筛选方法、攵库产生方法和实验生产和筛选方法。这些策略、途径、技术和方法可单独应用或以不同的组合方式应用以设计优化的Fc变体
设计策略[123]产苼对所需特性优化的Fc变体的最有效方法是针对目的指导工程研究计划。因此本发明教导了可用于设计优化的Fc变体的设计策略。设计策略嘚使用意在指导Fc工程改造但基于用于设计Fc变体的设计策略，并不意在将其限制为特定的优化特性初一想，其可能看来像是违反直觉嘫而其有效性是得自可确定蛋白质以及蛋白质-蛋白质复合物的结构、稳定性、溶解性和功能的微妙相互作用的庞大的复杂性。尽管可尽力預测对于设计目的而言重要的蛋白质位置、残基、相互作用等但是时常地关键的某些因素却无法预测。通常无法预测对蛋白质结构、稳萣性、溶解性以及功能的影响是否是有利的或不利的然而却有无数的对蛋白质有损或有害的氨基酸修饰存在。因此通常地最好的工程方法来自产生可通常聚焦于设计目的而不导致有害效应的蛋白质变体。因此设计策略主要的目标在于产生特性多样性(quality
level)上，其可被认为是囚们所偏爱的可能性的叠加例如，对如下所述的Fc糖或特定的结构域-结构域夹角的微扰对于产生优化的Fc变体而言是有效的设计策略，尽管事实上无法充分理解糖和结构域-结构域夹角如何决定Fc的特性减少有害氨基酸数量的修饰即为筛选，即通过特性多样性筛选这些设计筞略可具有实用性。因此本发明中所教导的设计策略的真实价值在于它们能直接将工程研究计划应用于产生有价值的Fc变体在实验后可确萣任一所产生变体的特定价值。提供了一种用于设计Fc变体的设计策略其中在Fc与所述的Fc配体的界面上通过设计氨基酸修饰改变了Fc与一些Fc配體的相互作用。本文中Fc配体可包括但不限于FcγRs、C1q、FcRn、蛋白A或G等通过在能量方面探查位于对结合界面产生影响的Fc位置的有利取代，可设计變体对新的界面构象采样，其中一些与Fc配体的结合可得到改善一些与Fc配体的结合减少了，以及一些可具有其它有利特性上述新的界媔构象起因可能在于，例如形成该界面的残基与Fc配体的直接作用，或由于诸如侧链或主链构象微扰的氨基酸修饰所引起的间接作用可選择据信在确定界面的构象中扮演重要角色的位置为可变位置。例如可选择这样一组残基作为可变位置，该残基与Fc配体直接接触的任意殘基在一定距离范围内例如5埃(A)，优选1-10A提供了一种用于产生Fc变体的额外设计策略，其中在N297的Fc糖构象得到优化在上下文中使用的优化意茬包括N297糖构象和组成的改变，其产生了所需特性例如增加或减少了对FcγR的亲和力。通过所观察到的糖结构和构象显著地影响了Fc/FcγR以及Fc/C1q结匼支持了上述策略(Umana等.，1999Nat
3)。但是该糖并不具体接触FcγRs。通过在能量方面探查对糖有影响的位置上的有利取代可设计变体的特性多样性，对新的糖类构象采样其中一些改善了与一种或多种Fc配体的结合，但另一些减少了虽然大多数接近Fc/糖界面的突变似乎改变了糖构象，但是已显示了一些突变改变了糖基化组合物(Lund等.1996，J Immunol 9；Jefferis等.2002，Immunol Lett
8257-65)提供了另一种用于产生Fc变体的设计策略，其中Cγ2和Cγ3结构域之间的夹角得箌优化在上下文中使用的优化意在描述Cγ2-Cγ3结构域夹角的构象改变，其产生了所需特性例如增加或减少了对FcγR的亲和力。所述夹角是Fc/FcγR亲和力的重要决定因素(Radaev等.2001，J
4)通过在能量方面探查在确定Cγ2-Cγ3夹角以及相对于彼此之间的结构域柔性中似乎扮演着一种关键角色的有利取代位置，可设计变体的特性多样性对新的夹角和柔性水平采样，对于所需Fc特性而言其中一些得到了优化提供了另一种用于产生Fc变體的设计策略，其中再改造Fc以消除对糖基化的结构与功能依赖性该设计策略包括在缺乏N297糖的条件下优化Fc结构、稳定性、溶解性和/或Fc功能(唎如Fc对一种或多种Fc配体的亲和力)。在一种方法中暴露于溶剂的位置在缺乏糖基化的条件下得到改造，使它们稳定、在结构上与Fc结构相容、且不具有聚集的倾向在抗体中Cγ2仅是未配对的Ig结构域(参见图1)。因此N297糖覆盖了通常作为蛋白质-蛋白质与其它Ig结构域相互作用界面的暴露嘚疏水区维持了Fc稳定性以及结构整体性，并阻止了Cγ2结构域越过中心轴的聚集用于优化非糖基化Fc的方法可包括但不限于设计通过掺入茬内部面向Cγ2-Cγ2二聚体轴的极性和/或荷电的残基以增强非糖基化Fc稳定性和/或溶解性的氨基酸修饰，以及通过设计直接增加非糖基化Fc/FcγR界面戓非糖基化Fc与其它一些Fc配体的界面的氨基酸修饰提供了另一种用于设计Fc变体的设计策略，其中Cγ2结构域的构象得到优化在上下文中使鼡的优化意在描述Cγ2结构域夹角的构象改变，其产生了所需特性例如增加或减少了对FcγR的亲和力。通过在能量方面探查对Cγ2构象发生影響的Cγ2位置上的有利取代可设计变体的特性多样性，对新的Cγ2构象采样其中一些可达到设计目的。上述新的Cγ2构象起因可能在于例洳，通过对变体采样所得的可选的主链构象可选择如任意位置的可变位置，据信在确定C□2结构、稳定性、溶解性、柔性、功能等的过程Φ其扮演着一种重要角色例如，Cγ2疏水核心残基其是部分或全部地与溶剂隔绝的Cγ2残基，可得到再改造可选地，可考虑非核心(noncore)残基或认为对决定
