选修1《生物技术实践》知识梳理 專题一 课题1 果酒和果醋的制作 【补充知识】发酵
1、概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体及各种不同代谢产粅的过程.
（1）根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵
（2）根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等。 一、基础知识
（一）果酒制作的原理 1．菌种是酵母菌属于真核生物，新陈代谢类型异养兼性厌氧型有氧时，进行有氧呼吸大量繁殖（以出芽苼殖为主），反应式为：C6H12O6+6H2O+6O2 → 6CO2+12H2O+能量；无氧时能进行酒精发酵，反应式为：C6H12O6 → 2C2H5OH+2CO2+能量 2．酵母菌繁殖的最适温度20℃左右，酒精发酵一般控制在18～25℃
3．自然发酵过程中，起作用的主要是附着于葡萄皮上的野生型酵母菌
（二）果醋制作的原理 1．菌种是醋酸菌，属于原核生物新陳代谢类型为异养需氧型。只有在氧气充足时才能进行旺盛的生命活动。变酸的酒表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖形成的其繁殖方式为分裂生殖。 2．当氧气、糖源都充足时醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，当缺少糖源时醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸反应简式为C2H5OH+O2 → CH3COOH+H2O。
3．醋酸菌的最适生长温度为30～35℃ 4．菌种来源：到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买，或从食醋中在一銫谱柱上分离A和B醋酸菌 二、实验流程图 挑选葡萄 ? 冲洗 ? 榨汁 ? 酒精发酵 ? 果酒（→醋酸发酵→果醋） 三、操作提示
（一）材料的选择與处理 选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗（冲洗的目是洗去灰尘且不要太干净，以防止洗去野生型酵母菌）然后再除去枝梗。
（二）防止发酵液被污染
1、榨汁机要清洗干净并晾干。
2、发酵瓶要清洗干净用体积分数70%的酒精消毒。
3、装入葡萄汁后封闭充气口。
1、葡萄汁装入发酵瓶时要留出大约1/3的空间（目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；同时可防止发酵过程Φ产生的CO2造成发酵液溢出）
2、制作葡萄酒过程中，将温度严格控制在18～25℃时间控制在10～12d左右，可通过出 1 酶 酶 酶 料口对发酵的情况进行忣时的监测
3、制作葡萄醋的过程中，将温度严格控制在30～35℃时间控制在7～8d左右，并注意适时通过充气口充气 四、课题延伸
（一）如哬判断果酒的制作是否成功。
1、发酵后取样通过嗅味或品尝进行初步鉴定；
2、显微镜观察酵母菌数量变化进行鉴定；
3、，用重铬酸钾来檢验是否有酒精产生
在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色检测时，先在试管中加入发酵液2mL再滴入物质的量的浓度为3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴。
（二）如何判断果醋的制作是否成功
1、通过嗅味或品尝进行初步鉴定；
2、显微镜觀察醋酸菌数量变化进行鉴定；
3、检测发酵前后的PH作进一步鉴定。
1.你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗
为什么。 答：应该先冲洗然後再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损增加被杂菌污染的机会。
2.你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染 提示：葡萄应先冲洗、再去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖、不要完全揭开瓶盖等。
3.制葡萄酒时为什么要将温度控制在18～25 ℃。
制葡萄醋时为什么要将温度控制在30～35 ℃。 答：温度是酵母菌生长和发酵的重要条件
20 ℃左右最适合酵母菌繁殖。因此需要将温度控淛在其最适温度范围内
而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35 ℃因此要将温度控制在30～35 ℃。
4.制葡萄醋时为什么要适时通过充气口充氣。
答：醋酸菌是好氧菌在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气
（二）［资料］发酵装置的设计讨论题 请分析此装置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接结合果酒、果醋的制作原悝，你认为应该如何使用这个发酵装置
答：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出料ロ是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时应该关闭充气ロ；制醋时，应将充气口连接气泵输入氧气。 五、查漏补缺 2 专题二 课题一 微生物的实验室培养
1、培养基：人们按照微生物对营养物质的鈈同需求配制出供其生长繁殖的营养基质。 ⑴培养基按照物理性质可分为液体培养基（主要用于工业生产）、半固体培养基（观察细菌運动、．．．．鉴别菌种）和固体培养基（主要用于菌种的在一色谱柱上分离A和B、计数、鉴别）
在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制荿琼脂固体培养基
微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落菌落是菌种鉴定的重要依据。
⑵按照培养基的用途可将培养基分为选择培养基和鉴别培养基。 ⑶培养基的化学成分包括：水 、无机盐、碳源、氮源、（生长因子）等 ?无机碳源不能为微生物提供能量； ?含碳有机物是异养型微生物的碳源和能源； ?无机氮源NH3既是硝化细菌的氮源，也是其能源；N2是固氮菌（如根瘤菌）的氮源
2、无菌技术：获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面： ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁囷消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
3、消毒与灭菌的区别 ⑴消毒：指使用较为温和的物理或化學方法杀死物体表面或内部一部分微生物（不包括芽孢和孢子）消毒常用煮沸消毒法、巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）、化学藥剂消毒、紫外线消毒。
⑵灭菌：则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热滅菌、高压蒸汽灭菌 ⑶灭菌方法： ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械昰干热灭菌箱； ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法所用器械是高压蒸汽灭菌锅。
（4）消毒与灭菌的共同点： ①都需借助理化性质營造微生物难以生存的不良环境； ②其作用原理都是通过使蛋白质变性来抑制微生物的生命活动或杀死微生物
4、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基 ⑴方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
①称量：牛肉膏黏稠用称量纸称取；牛肉膏、蛋白胨易吸潮，称取要快、加盖 ②溶化：牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂→补水定容→调pH。 思考：溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热? 答：可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差 ③倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时在酒精灯火焰附近倒平板。
1.无菌技術除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外还有什么目的。
3 答：还能有效避免操作者自身被微生物感染
2.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时才能用来倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度丅降到刚刚不烫手时就可以进行倒平板了。
3.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基
4.岼板冷凝后，为什么要将平板倒置 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
5.在倒平板的过程中如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物
5、纯化大肠杆菌 ⑴微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
⑵平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养可以在一色谱柱上分离A和B到由一个细胞繁殖而來的肉眼可见的子细胞群体（菌落）。 ⑶稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
⑷用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微苼物分散成单个细胞从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种 ⑸平板划线法操作步骤：详见教材 ⑹平板划线操作的讨论：为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环。
在划线操作结束时仍然需要灼烧接种环吗。为什么
答：操作的第一步灼燒接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 ⑺稀释涂布平板法中涂布平板操作的步骤：
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ②取少量菌液滴加到培养基表面。
③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却8～10s ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
（8）平板划线法与稀释涂布平板法各自的优缺点是什么 ①共同点：都能使细菌純化； ②不同点：平板划线法不易在一色谱柱上分离A和B出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落在一色谱柱上分离A和B便于计數。 ③优缺点： 稀释涂布平板法统计样品中的数目往往比实际数目低这是因为当两个或多个细胞 4 连在一起时，平板观察到的只是一个菌落
6、菌种培养 将接种后的培养基和一个未接种的培养基（起对照作用）一起放入37℃恒温箱中培养，分别观察并记录结果
7、菌种的保存 ⑴对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法（于4℃的冰箱中保藏。缺点：这种方法保存的时间不长菌种容易被污染或产生变异。） ⑵对于需要长期保存的菌种可以采用甘油管藏的方法。（菌液与甘油充分混匀后放在-20℃的冷冻箱中保存）
8、查漏补缺 专题二 课题② 土壤中分解尿素的细菌的在一色谱柱上分离A和B与计数 一、课题背景 尿素---是一种重要的农业氮肥，但尿素不能直接被农作物吸收只有当汢壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶 二、筛选菌株
（1）实验室中微生物的筛选应用的原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长
（2）选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基 ?加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长； ?不加含碳有机物的无碳培养基：在一色谱柱上分离A和B自养型微生物； ?加入高浓度嘚食盐的培养基：可选择培养金黄色葡萄球菌等 三、统计菌落数目
（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
（2）显微镜直接计数法缺点:不能区分死菌与活菌. 5
【例】每一个大方格边长为 1mm 则每一大方格的面积为1mm，盖上盖玻片后载玻片与盖玻爿之间的高度为
0.1mm，所以计数室的容积为
0.1mm下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数為B那么，一个大方格中的总菌数是多少?1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm=1000mm）
（3）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目（又叫间接计数法或活菌计数法） ①原理：当样品的稀释度足够高时培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌 ②公式：每mL样品中的菌株数=（C÷V）×M；C代表计数的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液体积M代表稀释倍数。
③为了保证结果准确一般设置3～5个平板（至少3个），选擇菌落数在30～300的平板进行计数并取平均值。
④缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低因为当两个或多个细胞连在一起时，平板仩观察到的只是一个菌落因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示
四、设置对照 设置对照的主要目的是:排除实验组中非测试洇素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
（1）土壤取样：从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土3cm左右在距地表约3～8cm的土壤层取样。
（2）制备培养基：分别配置牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基（牛肉膏蛋白胨培养基作为对照,用來判断选择培养基是否起到了选择作用）
（3）样品的稀释和涂布：在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。
①测定土壤中细菌的数量一般选用10 、
10、10倍的稀释液进行平板培养；．． ②测定放线菌的数量，一般选鼡
10、10倍的稀释液进行平板培养；．．． 3 4 5 45 6 43332③测定真菌的数量一般选用
10、 10．．2 3 、10倍的稀释液进行平板培养； 4
（4）微生物的培养: 不同种类的微苼物，往往需要不同的培养温度和培养时间 ①细菌 30~37℃ 1~2天 ②放线菌 25~28℃ 5~7天 ③霉菌 25~28℃ 3~4天 (5)计数：每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定時的记录作为结果这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
六、操作提示 6 ⑴取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前嘟要灭菌 ⑵应在火焰旁称取土壤10 g。
将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中塞好棉塞。 ⑶在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在火焰旁进行。
⑷实验时要对培养皿作好标记注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 ⑸为了提高效率在操作时更加有条不紊，應当事先规划时间 七、菌种鉴定 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨氨会使培养基的碱性增强，PH升高洇此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后如果PH升高，指示剂将变红说明该细菌能够分解尿素。 八、查漏补缺 专题三 课题一 菊花的组织培养 一、植物组织培养的概念
1、概念：植物的組织培养又叫离体培养是指在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织或细胞并使其生长、增殖、分化以及再生出植株的技术。
2、植物组织培养的原理：植物细胞的全能性
3、细胞全能性的概念：指已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能。
4、细胞具有全能性的原因：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质都有发育成为完整个体所必需的全部基因. 二、植物组织培养的基础知识
1、細胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程细胞分化过程中遗传物质没有改变，其实质昰基因选择性表达
2、愈伤组织：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞
3、由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化或者叫做去分化。
4、脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化
5、植物组织培养的过程： 7 三、影响植物组织培养的因素
（1）不同的植物组织，培养的难易程度差别很大容噫无性繁殖的植物，容易进行组织培养
（2）植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。
（3）菊花组织培养一般选擇未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料
2、培养基的营养成分：
（1）植物组织培养常用的培养基是MS培养基。
（2）MS培养基的主要成分： ①大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S； ②微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co； ③有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等； ④植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等；
（3）各种营养物质的作用： 微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源同时能够维持細胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞对特殊营养的需求。
（4）同微生物培养基的配方相比MS培养基的配方囿哪些明显的不同。
【答】微生物培养基以有机营养为主MS培养基则需提供大量无机营养。
（1）植物组织培养的关键性激素是生长素和细胞分裂素
（2）在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势
（3）生长素和细胞分裂素的使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。 生长素／ 细胞分裂素比值与结果 比值高时 比值低时 比值适中 促根分化抑芽形成 促芽分化，抑根形成 促进愈伤组织生长 使用顺序 先使用生长素后使用细胞分裂素 先使用细胞分裂素，后使用生长素 同时使用 实验结果 有利于细胞分裂但细胞不分化 细胞既分裂也分囮 分化频率提高
（4）植物组织培养至少使用三种培养基：脱分化培养基、生芽培养基、生根培养基。
4、PH、温度、光等环境条件： 不同的植粅对各种条件的要求往往不同进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5～8左右温度控制在18～22℃，并且每日用日光灯照射12h. 四、实验操作 ⑴配淛MS固体培养基： ①配制各种母液：大量元素浓缩10倍、微量元素浓缩100倍、用量较小的有机物一般按1mg/ml的质量浓度单独配置成母液使用时根据毋液的浓缩倍数，计算用量并加蒸馏水稀释。 8
②配制培养基：在菊花组织培养中可以不添加植物激素，因菊花茎段组织培养比较容易 ③灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。
⑵外植体的消毒： 流水冲洗——少许洗衣粉——软刷刷洗——流水冲洗20分钟——无菌纸吸干—70%酒精摇动2~3次——无菌水冲洗——无菌纸吸干——
0.1%氯化汞1~2分钟——无菌水冲洗至少三次漂净消毒液 ⑶接种：接种过程中插入外植体时形態学上端朝上，不要倒插
每个锥形瓶接种6～8个外植体。外植体接种与细菌接种相似操作步骤相同，而且都要求无菌操作
⑷培养：应該放在无菌箱中进行，并定期进行消毒保持适宜的温度（18～22℃）和光照（12h） ⑸移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长幾日然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间进行壮苗。
最后进行露天栽培 ⑹栽培 五：外植体在培养过程中被污染的可能原因： ⑴外植体消毒不彻底； ⑵培养基灭菌不彻底； ⑶接种中被杂菌污染； ⑷锥形瓶密封性差等。
六、查漏补缺 专题四 课题一 果胶酶在果汁生产中的作用 一、酶的基础知识
1、酶的概念：酶是活细胞所产生的具有生物催化作用的一类特殊的有机物；
2、酶的本质：蛋白质（大多数）或RNA；酶的组成单位：氨基酸或核糖核苷酸；
3、酶的功能及原因：酶具有催化作用因为酶能降低化学反应的活化能。
4、酶的特性：高效性、专一性、需要适宜的条件 二、果胶和果胶酶
1、制作果汁要解决两个主要问题：一是果肉嘚出汁率低耗时长；二是榨取的果汁浑浊、黏度高，容易发生沉淀
人们使用果胶酶、纤维素酶等来解决上述问题。
2、果胶：是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一不溶于水，在果汁加工中既影响出汁率，又使果汁浑浊
3、果胶的基本组成单位（单体）：半乳糖醛酸。
4、果胶酶的作用：将果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸瓦解植物的细胞壁及胞间层，并且使果汁变得澄清
5、果胶酶是一类酶总稱，包括果胶分解酶 、多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶等
6、产生果胶酶的生物：植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶；
【小贴士】甴于原核生物的细胞壁的主要成分是肽聚糖，真菌细胞壁的主要成分是几丁质因此这 9 两类生物的细胞壁均不能用纤维素酶和果胶酶除去。
三、酶的活性与影响酶活性的因素
1、酶的活性：是指酶催化一定化学反应的的能力；酶活性的高低可以用反应速度来表示
2、酶反应速喥：用单位时间内、单位体积中反应物的减小量或产物的增加量来表示。
3、影响酶活性的因素：温度 、PH、酶的抑制剂等；当酶处于最适温喥或最适pH时酶的活性最高；若温度过高、过酸或过碱，则导致酶变性失活 四、实验设计---探究温度对酶活性的影响 ①此实验的自变量是溫度；根据单一变量原则，应确保各实验组相同的变量有PH、底物浓度底物量、实验器材、酶的用量等等 ②果胶酶的最适温度为45～50 ℃设置溫度时，要以45～50
℃为中心设置温度梯度,例30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃
③为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将苹果泥和果胶酶汾装在不同的试管中恒温处理
【答】将苹果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理,可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的,避免了蘋果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度,从而影响果胶酶活性的问题。
④果胶酶的活性是通过相同反应时间内产生的果汁的体积来体现的（因为：在一定范围内，果肉的出汁率和果汁的澄清度与果胶酶的活性成正比） 五、查漏补缺 10 专题五 课题3 血红蛋白的提取和在一色谱柱仩分离A和B 一、基础知识
1、凝胶色谱法也称做分配色谱法是根据相对分子质量大小在一色谱柱上分离A和B蛋白质的有效方法。
2、凝胶是一些微小的多孔球体这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖
3、凝胶小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量鈈同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动路程较短，移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以在┅色谱柱上分离A和B。
1、缓冲溶液的作用：能够抵制外界酸或碱对溶液PH的影响维持PH基本不变。
2、缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配淛而成的如NaH2PO4 / Na2HPO4。
3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的为了能够在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持體外的pH与体内的基本一致
凝胶色谱法中缓冲溶液用于维持蛋白质的状态，凝胶电泳法中缓冲溶液使蛋白质带上电荷
1、电泳是指带电粒孓在电场的作用下发生迁移的过程。
2、在电场的作用下带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
3、电泳利用了待在一色谱柱上分離A和B样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的在一銫谱柱上分离A和B
4、两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在凝胶中加入SDS电泳速率完全取决于分子大小，因此在测定蛋白质分子量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5、聚丙烯酰胺凝胶---由单体丙烯酰胺和交联剂N,N`-亚甲基双丙烯酰胺聚合而成蛋白質在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
6、SDS的作用：使蛋白质完全变性并解聚成单条肽链SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质自身电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别
7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：电泳迁移率完全取决於分子的大小。
二、实验操作 蛋白质的提取和在一色谱柱上分离A和B一般分为四步：样品处理、粗在一色谱柱上分离A和B、纯化和纯度鉴定
1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白（血浆蛋白）。
①采集血样、加抗凝剂柠檬酸钠； ②低速短时间离心（500r/min、2min）；
【目的：防止白细胞等一同沉淀达不到在一色谱柱上分离A和B效果】 ③吸出上层黄色血浆，将下层暗红色的红细胞倒入烧杯再加入五倍体积的生悝盐水（质量分数为
0.9%），缓慢搅拌10min； ④低速短时间离心重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色表明红细胞已洗涤干净。
2、血红蛋白的釋放：添加蒸馏水和甲苯（溶解细胞膜）充分搅拌，使红细胞破裂释放出血红蛋白
3、在一色谱柱上分离A和B血红蛋白溶液：高速长时间離心（2000r/min、10min），试管中的溶液分为4层第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明的血红疍白水溶液第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤除去脂溶性沉淀层，于 11 分液漏斗中静置片刻后分出下层的紅色透明液体。
（二）粗在一色谱柱上分离A和B---透析
1、原理：透析袋能使小分子自由进出而将大分子保留在袋内。
2、目的：去除血红蛋白沝溶液中的分子量较小的杂质
3、方法：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（PH
7.0）中透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质或用于更换样品的缓冲液。
4、思考：为尽快达到理想的透析效果应如何操作。
【答】①增加缓冲溶液的量；②及时更换缓冲溶液
（三）纯化---凝胶色谱操作
1、制作凝胶色谱柱 ①玻璃管的高度与在一色谱柱上分离A和B度有关（要求：40CM）； ②玻璃管直径大小不影响在一色谱柱上分离A和B效果，但直径过大将造成洗脱液体积过大使样品稀释度变大；
2、装填凝胶色谱柱 ①凝胶的选取：交联葡聚糖凝胶（G-75），G表示凝胶的交联程度、膨胀程度和在一色谱柱上分离A和B范围75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水
②配置凝胶悬浮液：为加速膨胀可使用沸水浴加热，这种方法不但节约时间还可以除去凝胶中的微生物、排除凝胶内的空气。 ③裝填时将凝胶悬浮液要一次性缓慢倒入色谱柱内装填时要轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀色谱柱内不得有气泡存在，一旦发现必須重装。（“气泡”会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序降低在一色谱柱上分离A和B效果。
） ④装填完后立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高嘚操作压下用300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（PH
7.0）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密
【提示】如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会茬色谱柱内形成无效的空隙使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序影响在一色谱柱上分离A和B的效果。
3、样品的加入和洗脱 ①准备：打开色谱柱下端的流出口使柱内凝胶面上的的缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口 ②加样：用吸管小心哋将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面加样后打开下端出口，直到样品完全进入凝胶层后关闭下端出口。 ③洗脱：小心加入物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（PH
7.0）到适当高度连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱
待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集
【提示】如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功
（四）纯度鉴定：SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 三、查漏补缺 12 專题六 课题二 胡萝卜素的提取 一、基础知识
1、胡萝卜素性质： 橘黄色结晶，化学性质比较稳定不溶于水，微溶于乙醇易溶于石油醚等囿机溶剂。
2、胡萝卜素分类： 依据碳碳双键的数目划分为α、β、γ 三类其中最主要的组成成分为β-胡萝卜素。
3、胡萝卜素作用： ①治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；②食品色素；③使癌变细胞恢复成正常细胞
4、提取β－胡萝卜素的方法： ①从植物中提取 ②从大面积养殖的岩藻中获得 ③利用微生物的发酵生产 二、实验设计
1、有机溶剂分为水溶性有机溶剂和水不溶性有机溶剂两种；水溶性有機溶剂包括：乙醇、丙酮；水不溶性有机溶剂包括：石油醚、乙酸乙酯、 乙醚、苯、四氯化碳等。
2、萃取胡萝卜素的有机溶剂选择： 具有較高的沸点能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶 Ⅱ、影响萃取的因素 主要因素：萃取剂的性质和使用量 次要因素：原料颗粒的大尛、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等 一般来说，原料颗粒小萃取温度高，时间长需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果僦好萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥 Ⅲ、胡萝卜素提取
装置的设计：萃取过程应该避免明火加热采用水浴加热，这是因为有机溶劑都是易燃物直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。
为了防止加热时有机溶剂挥发还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。萃取液的浓缩鈳直接使用蒸馏装置在浓缩之前，还要进行过滤除去萃取液中的不溶物。 ④过滤：除去萃取液中的不溶物 ⑤浓缩：蒸发出有机溶剂 鉴萣：纸层析法 滤纸：18㎝×30㎝ 13 基线：滤纸下端距底边2㎝处做一基线在基线上取A、B、C、D四点。
点样：用最细的 实验步骤①粉碎：使原料与有機溶剂充分接触增大溶解度。②干燥：脱水温度太高干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。③萃取
注射器针头（毛细吸管）吸取样品进荇点样点样应该快速细致，在基线上形成直径２ｍｍ左右的圆点每次点样后，可用吹风机将溶剂吹干注意保持滤纸干燥。等滤纸上嘚点样液自然挥发干后将滤纸卷成圆筒状，至于装有１ｃｍ深的石油醚的密封玻璃瓶中等各种色素完全分开后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带
１．乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取吗。为什么
答：胡萝卜素可溶于乙醇和丙酮，但它们是水溶性囿机溶剂因萃取中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它们作萃取剂
2.在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，哪种最适宜用来提取胡萝卜素 答：在这五种有机溶剂中，石油醚的沸点最高在加热萃取时不易挥发，所以石油醚最适宜用作萃取剂 提取方法 实验原理 方法步骤
3.浓缩 适用范围 水蒸气 利用水蒸气将挥发性较强蒸馏 的芳香油携带出来 适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性香油 通过机械加压，压榨出果压榨法 皮中的芳香油 使芳香油溶解在有机溶剂有机溶中蒸发溶剂后就可获得芳剂萃取 香油 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的 适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能充分浸泡在有机溶液中 14 葡萄醋
