为何要在细胞融合的方法有哪些前在96孔板中加入饲养细胞

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-04-06 09:06 标签： 细胞融合的方法有哪些

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    在体外培养细胞实验中对于难養的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长這就是饲养层细胞。至于饲养层细胞可以促进其它细胞生长的原理目前有两种解释：一种解释是饲养层细胞可以减小培养瓶或培养板对细胞的毒害作用；另一种解释是饲养层细胞可以释放出一些必要的生长因子可以促进目的细胞的生长。在单抗制备过程中刚刚融合的细胞和克隆化的细胞都比较难以生长，因此都需要添加饲养层才能较快地生长

    在介绍饲养层细胞之前，先来介绍一下制备单抗的培养基体系

Institute用来培养人的淋巴细胞的培养基，后来被广泛地应用到大部分悬浮细胞的培养中。商品化的1640大多以固体形式出售也有少数是配好嘚液体。有的商品化1640中不含碳酸氢钠（稳定pH作用）、不含HEPES（稳定pH作用）、丙酮酸钠（提供碳源）、谷氨酰胺配制前需要仔细阅读说明书，按照说明书的要求加入需要额外加入的成份尤其是谷氨酰胺，它是细胞增殖必不可少的成份（参见部分讲到的核酸的合成)而且谷氨酰胺特别容易分解，配制完培养基后应该尽快用完暂时不能用完的放在4℃或者-20℃保存。大部份商品化的1640培养基中都含有酚红作为酸碱指礻剂1640的pH为7.2-7.4，指示剂显示为红色（如果偏酸则显黄色偏碱则呈紫色）。

Eagle的基础上改进的最初用于鼠胚胎细胞的培养，后来广泛地应用於各种贴壁细胞的培养或者发酵罐培养与1640培养基相比，DMEM培养基营养更为丰富DMEM培养基有两种类型，一种是高糖型主要用来培养高密度懸浮细胞，另一种是低糖型主要用来培养普通的贴壁细胞，与1640培养基一样，商品化的DMEM培养基使用之间也要按照说明书的要求添加指定嘚成份

由于单抗制备（小鼠）中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞，因此上述两种培养基都可以用来培养杂交瘤细胞但是这些培养基并鈈能直接使用，而在使用之前需要加入15%-20%胎牛血清（推荐使用Hyclone公司、Gibco公司或四季青公司胎牛血清）胎牛血清可以为细胞提供更多的生长因孓和激素等活性物质，添加了胎牛血清的培养基称为完全培养基否则称作不完全培养基。在单抗制备中由于需要进行选择性杀死非目標细胞，所以使用添加HAT的选择性培养基通常HAT中，H（次黄嘌呤）的浓度为1×10-4MA（氨基蝶呤）为4×10-7M，T（胸腺嘧啶）为1.6×10-5M在HT培养基中，只需偠不加氨基蝶呤其它都同HAT。另外在细胞培养中，一般都加入抗生素防止细胞污染通常用的抗生素有青霉素（100U/ml）和链霉素（100ug/ml）、四环素(50ug/ml)、庆大霉素（50ug/ml），其中青霉素和链霉素联合使用较为常用俗称“双抗”。由于细胞培养中几乎所有的成份对高温都不稳定所以绝对鈈能使用高温灭菌，而是采用0.22um滤膜过滤除菌通常，先配好不完全培养基（要加抗生素）然后在超净台上抽滤、分装，取少量分装的培養基加入至液体LB培养基里37℃培养过夜进行无菌测试其它的培养基则放在-20℃保存。确认培养基无菌后才能使用HT、HAT则配成相应的母液（可鼡PBS配制，也可以用不完全培养基配制一般配为50×浓度保存）。培养基使用前根据需要加入HAT或HT以及血清才可以使用。

    讲完了培养基的基本知識现在转入正题，关于饲养层细胞的制备作为饲养层细胞，来源有两种一种是动物体内天然的细胞，另一种是经过处理的静息的肿瘤细胞单抗制备中可以使用的饲养层细胞有这么几种：

    （1）腹腔巨噬细胞。巨噬细胞不仅可以作为饲养层而且它还可以吞噬掉死亡的細胞碎片，起到环境清理的作用其制备方法是：杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢在超净囼上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤换一把干净镊子夹住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜用巴氏管向腹腔内加两至彡管不完全培养基，吹打几次吸出培养基，吸出的培养基里即含有腹腔巨噬细胞反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞1200RPM离惢5min去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基（用于刚融合的细胞需要加HAT用于克隆化的细胞需要加HT），用巴氏管反复吹打均匀可用血球计数板计数（一般一只老鼠的腹腔巨噬细胞约为3×106个）。根据计数的结果将巨噬细胞稀释到合适的浓度（以96孔板为例平均每孔含1×104個巨噬细胞为宜）,稀释好后，用巴氏管吸取此饲养层细胞按合适的体积滴到96孔板或24孔板上（平均每只老鼠的腹腔巨噬细胞可铺两至三块96孔板）饲养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细胞因子

    （2）脾脏细胞。脾细胞与杂交瘤的来源细胞上有很高的同源性因此与杂交瘤的“兼容性”较好，是作为饲养层的不错选择其制备方法和腹腔巨噬细胞过程类似，只是需要剪开腹膜取出脾脏，用鑷子剥去脾脏外的结缔组织将脾脏放在200目不锈刚细胞筛网上，用5ml注射器的针芯挤压脾脏使分散的脾细胞通过筛网落入下面的容器（建議使用一次性培养皿，养细菌用的那种比较便宜）用少量不完全培养基冲洗、吹匀脾细胞，收集离心计数稀释同腹腔巨噬细胞制备过程，一只老鼠的脾脏细胞总数约为2×108-3×108个以96孔为例，每孔需要约1×105个脾细胞

    （3）胸腺细胞。胸腺与脾脏中的淋巴细胞最初起源相同呮是各自在不同的器官成熟而已。因此胸腺也是作为饲养层的选择之一而且与脾细胞不同，胸腺细胞不会分泌抗体而对实验产生干扰其制备过程类似于脾脏细胞饲养层的制备。只是取胸腺的时候不是打开腹腔而是打开胸腔，胸腺是位于胸腔与心脏同侧的一小块白色器官取胸腺时不要与肺混淆。其分离过程与脾脏类似最终用量以96孔为例，每孔需要约5×105个胸腺细胞

    （4）放射线照射的成纤维细胞系。尛鼠成纤维细胞系易培养而且不需要以动物作为牺牲，加之技术比较成熟所以其应用也较多。具体操作是这样的：将NIH3T3细胞传代至细胞培养瓶密度不超过50%，用新鲜培养基培养24小时用胰酶消化下来，用培养基重悬至2-4×106个细胞/ml,用剂量为6000rad左右的60Co γ射线照射，换用新鲜的完全培养基稀释至需要的浓度（以96孔板为例每孔需要约2×104个细胞）滴在培养板里，此过程需要在使前12小时进行如果一次制备的这种饲养层較多，还可以将其冻存起来（48小时之内可以放4℃保存长时间则需在液氮中保存）。除了NIH3T3细胞外还可以使用STO细胞系或者MEF细胞系制备这种飼养层。由于60Co并不是每个实验室都具备因此这种饲养层的制备受到设备的限制比较大，一种比较好的解决方法就是用丝裂霉素C处理NIH3T3细胞莋为饲养层其方法是：将NIH3T3细胞传代至细胞培养瓶，密度不超过50%用新鲜的培养基培养24小时，向培养基中加入丝裂霉素C至终浓度为 10ug/ml继续培养12小时，弃去培养基用新鲜的培养基洗涤三次，最后一次洗涤放在37℃进行10-20min将洗好的细胞用胰酶消化下来， 用完全培养基重悬至合适濃度滴在培养板里（以96孔板为例每孔需要约2×104个细胞），此过程也应在使用前12小时进行注意：一定要洗干净丝裂霉素C，否则严重影响雜交瘤细胞的生长

    （5）SP2/0腹水。这种应用比较少这里只作为一种思路提出。将SP2/0细胞注射到小鼠腹腔待小鼠产生腹水（一般来说，这种細胞注射到小鼠腹腔内腹水产量较少可以注射细胞前三天用弗氏不完全佐剂注射腹腔致敏），杀死小鼠在超净台上取出腹水，其操作與取腹腔巨噬细胞类似取出腹水后离心去掉离下的细胞，保留上清将上清加入到完全培养基里即可，一般腹水的浓度为2.5%这种饲养层嘚优点是可以减小无关细胞的干扰。

    需要指出的是饲养层并不是培养杂交瘤细胞一定必须的，但是它确实可以在很大程度上提高细胞的荿活率、加快细胞生长速度因此强烈推荐使用饲养层。

    关于饲养层细胞的制备这一部分就写到这里如果还有什么问题可以在本站论坛仩发帖交流，也可以加入中国免疫学实验网QQ群和大家及时联系：中国免疫学实验网感谢您的光临！

[讨论帖]细胞融合的方法有哪些和雜交瘤技术

骨髓瘤细胞的培养 骨髓瘤细胞可用10%小牛血清的RPMI1640培养基以悬浮或半贴壁形式生长繁殖对于半贴壁细胞无需用胰蛋白酶消化，直接用吸管吹打即可使细胞分散传代培养要保持细胞的对数生长期，每3～5天传代一次


用于融合试验前必须做对HAT选择培养基敏感性试验，甴于HGRPTase缺损DNA合成障碍细胞，应发生死亡否则有变异，不能用于试验以SP2/0细胞为例，应在筛选建株时应用的8-氮鸟嘌呤致死剂的培养液中(20～30mg/L)培养一代后换成常规培养基培养。

制备免疫脾细胞悬液：通常在末次免疫后第3～4天以拉颈或断头处死小鼠用75%酒精浸泡消毒小鼠毛皮。嘫后打开腹腔无菌取脾去除脂肪和结缔组织，用无血清的培养液冲洗置100目不锈钢网筛上研磨脾脏，用洗液洗2～3次经1000r/min离心5分钟，弃上清加入完全培养基用吸管吹打分散，收集上层悬液除去沉下的大块。活细胞计数一般一只小鼠可获1～2.5×108脾细胞。


聚乙二醇（PEG）诱导細胞融合的方法有哪些法：PEG结构为HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH分子量从小于200至大于6000，均可作细胞融合的方法有哪些剂通常用分子量1000或4000的PEG作融合剂，50%溶液产生最多***細胞若用分子量较小的PEG时，以55%浓度为好PEG在pH6.0时细胞融合的方法有哪些率最高，融合时细胞密度不要太大常采用微孔膜过滤除菌，因高壓灭菌会产生有毒醛类化学物具体步骤如下：
(1)  将两种不同亲本细胞以10:1或5:1混匀，即作单克隆抗体杂交瘤细胞融合的方法有哪些试验时取107個免疫脾细胞加入108个SP2/0(或NS1)鼠骨髓瘤细胞，混匀后低速（200g）离心去上清叩松沉淀细胞。
(3)于2分钟内加入15ml预热的无血清1640培基以终止融合，1000r/min离心詓上清沉淀细胞悬浮于24ml HAT培基中。
(4)将细胞分种于含饲养细胞的24孔板中0.5ml/孔,置37℃含5%CO2的培育箱中培养，每3～4天半量换HAT培养,15天后改用HT培基3周后妀用完全RPMI16403培基。
(5)培养3～5天即可有小克隆出现杂交细胞较大，呈园形且透明，其它细胞透光性差并逐渐死亡
培养8-12天，克隆可长至底面積的1/3～1/2此时可取培养上清液，进行抗体检测
(7)一旦检测到分泌预定抗体的克隆，应及时将阳性克隆转入培养瓶扩大培养冻存部分克隆細胞，并尽快进行克隆化培养
病毒类  DNA病毒：水痘和疱疹病毒，天花（兔天花）病毒RNA病毒：仙台(HVj)病毒,NDV腮腺炎病毒,SV5,麻疹及呼吸道合胞病毒RNA致癌病毒：Rous肉瘤病毒，Visna病毒冠状病毒：禽类感染性气管炎病毒
化合物  水溶性：聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、ConA脂溶性：溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸

细胞性抗原ELISA测定法


1)制备细胞抗原板：先将贴壁生长的细胞消化制成细胞悬液接种96孔板，200ul/孔(细胞为105/孔)于37℃5%CO2培养24～48小时弃培养液，用PBS（pH7.2）洗3次然后用含1%牛血清白蛋白封板，用塑料袋密封4℃保存2周内可用。
2)检测抗体时取出检测板。
4)PBS洗3次每次3分钟。
5)每孔加入有克隆形成杂交瘤细胞培养上清液50ul37℃孵育1-5小时,或4℃过夜。
7)每孔加辣根过氧化物酶标记的兔(或羊)抗小鼠IgG 50ul[用稀释液（即PBS中含2%正常兔血清和10%甘油）稀释酶标抗体]，37℃孵育30分钟
8)PBS洗5次，每次3分钟
9)每孔加新鲜配制的0.1ml底物溶液(邻苯二胺20mg溶于50ml pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，用前加30%H2O2)25℃暗处反应30分鍾
11)判定结果：阴性对照孔应无色，阳性对照孔呈橙黄色试验孔的颜色与阳性对照孔颜色基本一样，可判定为阳性此外，也可在酶标儀的490nm波长下测定吸收值若试验孔的光吸收值大于或等于阳性对照孔的光吸收值，可判定为阳性
1）将细胞悬液于HT-1640培养液（含10~15%小牛血清）Φ计数细胞浓度，然后用该培养液稀释至每毫升分别含5、10和50个细胞的细胞悬液
例如：假设该细胞混合悬液的细胞浓度为3.5×105/ml，可按如下步驟稀释：
2)将上述稀释的细胞悬液C、D、E分别加入含有饲养细胞的96孔培养板的小孔中100μl/孔，使每孔分别含有0.5、1和5个细胞这种细胞的分布率，常常根据细胞的特性和试验条件而有所不同对于生长良好的细胞，其分布密度（分布率）可以适当低一些对于刚融合后的第一次阳性克隆筛选时，孔中的细胞密度要求高一些
3）培养板在5%CO237oC下培养至第3~4天，在显微镜下可观察到单细胞增殖情况，（培养当天或第二天板嘚U型底中开始为单细胞分布第3~4天细胞数明显增多）。
4）特异性抗体检测在克隆后的一周至第10天，显微镜下可观察到U型孔底约有1/2~1/3被细胞咘满当孔中细胞数达150~500个细胞时，即可吸出上清液用各种方法尽快检测相应的特异抗体，可选择抗体效价高呈单个克隆生长，形态良恏的细胞孔一部分细胞用于扩大培养冻存，一部分细胞可继续按同样的方法再克隆
为确定所得的杂交瘤细胞为单个细胞克隆，可用下述Poisson公式加以验证：
f（0）为无细胞生长孔λ为预定的每孔克隆数，e为自然对数的底，e=2.71828
由此可知要得到每孔只有一个克隆的概率，则有37%以仩的孔应无细胞生长如果连续两次克隆化都符合Poisson分布的单个克隆的生长孔数，而且全部克隆生长孔的上清均检测出阳性抗体就可以认萣已得到能分泌均一抗体的单克隆杂交瘤细胞系。

大家一块来努力吧,你们在实验过程中有那些不同以及有什么好的建议都来说说吧......

1 眼眶放血处死小鼠,酒精消毒
2 背部剪开小鼠外皮,暴露骨瘤
3 小心取出瘤子,放入少许hanks液中,碾碎,转入15ml的离心管中,静止几分钟,吸取上清入50ml离心管中,1000rpm离心5min,去上清,加入少许培养基,取瘤细胞镜检.

抛砖引玉啊,都来谈谈你们如何操作的吧

问个问题骨瘤细胞为什么还要制备？买来的细胞系不可以用吗
峩个人觉得单纯的细胞融合的方法有哪些技术是很成熟的，而抗体制备却是运气占很大成分的如果能把融合过程中，两个细胞的细胞器匼二为一的机理明白技术才会发展吧。

关于骨瘤细胞的制备,当然现在基本都是买来的细胞系体外培养,但如果为防止骨瘤细胞反祖,除了用8-AG篩选外还可以注射入皮下长瘤在保存.


偶以前也是做单抗的,感觉一个累啊.做了半天还没什么结果
感觉运气占一部分,不过个人觉得整个实验室嘚环境也很重要,有个有经验的师兄带着,大家相互帮忙,可能更容易出结果.


楼主能告诉下常用的小鼠骨髓瘤细胞株的特点是在哪里查到的么怹们各自的应用是是什么？

弱弱的问一下融合后的细胞全部换掉培养基之后要多长时间才能检测上清抗体浓度

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不知道你融合后細胞全部换掉培养基是什么时候，如果是细胞可以进行检测的时候想二次检测，那么一般在2-3天后；如果你融合的细胞生长的比较少的情況下你全部换液了（这是不推荐的，融合细胞容易死亡）想进行检测，就得等细胞培养基颜色变黄当然污染的除外。

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