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[毕业学位论文]奶牛胚胎移植及相关技术推广应用研究
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3秒自动关闭窗口胚胎移植在奶牛生产中的推广应用研究--《当代畜牧》1997年01期
胚胎移植在奶牛生产中的推广应用研究
【摘要】：3年共计超排供体高产奶牛68头次，获卵57头次，获卵率为83．82％；共获卵537枚，每头供体平均7．89枚，共获可用胚372枚，头平获可用胚5．47枚。移植低产奶牛受体253头，妊娠121头，移植妊娠率为48％。共产犊111头，其中母犊53头。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：S823.3【正文快照】：
牛胚胎移植是继50年代牛冷冻精液、人工授精之后的又一新技术，它利用外源激素的作用，使具有优秀遗传基因的个体大量生产胚胎，借腹怀胎，以此来扩大优良生产群体，加快育种速度，提高经济效益。本研究以优秀高产奶牛个体为供体，进行超排、授精，将其胚胎移植给低产牛，达到
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京公网安备74号动物胚胎移植技术研究与应用进展姓名：王*** 学院： 动物科技学院 学号：******* 班级：08 级 2 班 专业：制药专业摘要： 胚胎移植(Embryo transfer) ：是将从配种后的良种母畜(供体)体内取出的早期胚 胎， 或者是由体外受精及其他方式获得的胚胎， 移植到同种的生理状态相同或相似的母畜(受 体)体内，使之继续发育成为新
个体的过程，所以也称作借腹怀胎。胚胎移植技术不仅在研 究动物卵子和卵母细胞的成熟、 受精过程、 胚胎早期发育以及胚胎与子宫内环境的关系等繁 殖生物学问题上有着重要的应用,而且在促进动物体外受精技术、性别鉴定技术、转基因技 术、 胚胎分割技术和核移植技术等方面也起着至关重要的作用。 随着这一技术的日趋发展和 成熟,它已与发情控制、人工授精、超数排卵、动物克隆等现代生物技术和遗传育种理论紧 密地结合在一起,在畜牧生产中显示了广阔的应用前景。 关键词：牛羊等家畜 ； 胚胎移植 ； 状况及推广应用；引言胚胎移植技术作为现代生物技术中的一项重要的应用技术,将会随着研究的不断深入 而不断完善、 成熟.对胚胎移植相关学科和相关技术的研究,将会使人们对哺乳动物生殖机理 有更进一步的认识,以解决目前还未彻底解决的问题,同时也将会加快动物生产性能的改良 速度,特别在家畜育种方面将会实现常规选择和杂交不能实现的目标,从而培育出更多的符 合人类需要的理想的动物品种1. 胚胎移植的发展概况1.1 世界胚胎移植的发展情况胚胎移植是 1890 年由英国学者 Walter Heapel 用兔子试验成功。 20 世纪 30 年代以后，胚胎移植的研究越来越多，在多种家畜相继获得成功： ?1933 年 Nicholas 利用大鼠进行胚胎移植的研究又获成功， 同年 Cole & Millertjh 用 PMSG 诱导排卵获得成功。 ?1934 年绵羊（Warwick）胚胎移植获得成功。 ?1934 年山羊（Warwick）实施了自身重移植获得成功。 ?1949 年 Warwick＆Berry 又一次在山羊做了一次胚胎移植。 1949 年 Umbaugh 做了奶牛胚胎移植，但发生流产。11951 年 Willett 等做猪的胚胎移植获得成功。 ?1951 年 Kvasnickii 在奶牛的胚胎移植获得后代。 ?1964 年 Mutter 等首次利用非手术法成功地对奶牛实施胚胎移植。 ?1965 年 Robinson 的发情同期化试验获得成功。 ?1968 年由 Chang 在雪貂上获得成功，表明野生动物的胚胎移植也开始研究 ?1972 年，Whitenham et al.对鼠的胚胎冷冻保存获得成功。 ?1978 年 Steptoe & Edwars 的人类第一例试管婴儿研究的成功。 ?1979 年 Willadsen 成功地对胚胎进行分割1.2 我国胚胎移植技术的发展情况：(以牛、羊为例)1.2.1 我国牛胚胎移植发展情况我国牛胚胎移植技术于 1997 年开始研究，1980 年最为活跃。此时各大农业院校、科研 院所都在从事胚胎移植试验， 但由于当时的国际交流少， 牛胚胎移植技术和方法的研究进展 不快。)1985 年后，随着联合国的大力资助，国际交流的加强，最先进的技术和设备的引进， 我国牛胚胎移植的技术水平提高很快，此时牛头均获可用胚 5.54 枚、鲜胚移植受胎率达到 45%。但由于当时全国的良种奶、肉牛的价格低，移植产活一头良种牛比买一头良种牛要贵 得多，牛胚胎移植商业运作受阻，绝大部分项目被迫停产，只有少数重点实验室在进行学术 性研究。近年来，我国奶、肉牛产业化进程加快，高产良种奶、肉牛的供求缺口很大。用胎 移植方法解决高产良种牛短缺，成为极为有效的途径。目前我国牛的超数排卵、同期发情、 胚胎移植、胚胎冷冻、胚胎分割、性别鉴定等技术已与国外基本同步。在正常情况下，平均 每头供体牛获可用胚 5.6 枚，鲜胚移植受胎率为 55%~70%，冻胚移植受胎率为 45%~60%。前 几年每年实际移植受体牛在 6000 头以上.1.2.2 我国羊胚胎移植研究特点2.1 品种多元化 我国于 1974 年和 1980 年分别在绵羊和山羊鲜胚移植上取得成功,于 1980 年和 1987 年冻胚移植获得成功,当时用于胚胎移植研究的羊品种比较单一。自 1995 年 开始,我国从国外引进波尔山羊,用于改良本地山羊,许多地方通过胚胎移植技术迅速扩大了 纯种波尔山羊的数量。截至 2001 年,通过胚胎移植出生的波尔山羊数量达到 2 000 只以上, 用于胚胎移植供体羊的绵羊品种有德国肉用美利奴、 萨福克羊、 无角陶赛特羊、 特克塞尔羊、 洛来羊、波德代羊、兰德瑞斯羊、以及最新引进的杜泊羊等。为了顺应养羊业发展趋势和适 应市场需求,这些供体羊的共同特点是都为肉用品种羊。 2.2 操作逐步走向规范化 20 世纪 70 年代初至 80 年代中期,中国科学院遗传研究所、中 国农科院畜牧所、西北农业大学等单位开展牛、羊胚胎移植的试验研究,并先后在绵羊、牛、 山羊上获得成功,但由于实验头数少,经费投入有限,好多操作都靠逐步摸索、 总结,还没有足 够的实践经验使胚胎移植操作实现程序化。 随着试验群体的扩大和国内外胚胎移植学术交流 的不断加强,我国的羊胚胎移植工作已经逐步走向规范化,胚胎移植操作规程基本成熟。 2.3 移植成功率不断提高 随着我国养羊业的不断发展和羊胚胎移植工作的大规模开展, 胚胎移植及相关技术逐渐成熟,头均可用胚胎数和移植妊娠率不断提高。其中波尔山羊的胚 胎移植效果最为显著(见表 1)。
年召开的 3 次全国养羊生产交流会不完全统计, 据 波尔山羊超排头均可用胚胎大都超过 10 枚;新鲜胚胎移植妊娠率在 50%~70%.2 胚胎移植的应用范围（1）在家畜改良方面的应用 人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀种公畜的配种 效能。但对优秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种 更是如此。 通过超数排卵和胚胎移植技术 （multiple ovulation and embryo transfer:MOET)2牛羊的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高 80%和 70%；产奶性状提高 33%。 （2） 在特定品种扩繁上的应用 牛羊等低繁殖力家畜， 从引进到形成一个纯种群体需要 7-8 个世代，15-20 年。而采用 MEOT 法，一次就可获得一个纯种群体。n80 年代初，美、澳、新 从欧洲引进的大型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁。n2000 年前后，我国的波尔山羊也是 采用胚胎移植进行扩繁的。 （3）在动物生物多样性上的应用 在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭 绝的野生动物方面， 胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。 冷冻能够很好地保存濒临灭绝动 物的胚胎或生殖细胞， 但该种动物雌性个体的减少， 也是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得 到移植，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功。如斑马胚胎 移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。 （4）其它方面应用 ①胚胎移植是克隆技术的必须过程；体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的继续 发育。 ②转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚胎移植3 胚胎移植的生理学基础及原则3.1 胚胎移植的生理学基础1．母畜发情后生殖器官的孕向发育 大多数自发排卵的家畜，发情后不论是否配种，或配种后是否受精，生殖器官都会发生 一系列的变化，如卵巢上黄体形成，孕酮的分泌和维持，子宫内膜组织的增生和分泌机能的 增强，这些变化都为胚胎的着床、发育准备了条件。在正常情况下，发情、配种、受精和妊 娠都是连续发生的、不中断的自然生殖规律。所以，从生理过程看，母畜的每一次发情、配 种都是受精、妊娠的前奏。由此可见，配种后受胎的母畜与未受胎的母畜在发情后的最初数 日或十多天，其生殖系统发生的变化是相同的，而且在相同的时期，母畜所处的生理状态也 大致相同。只是到了一定期限(相当于周期黄体的寿命，时间长短固动物品种不同而异)，配 种后受胎的母畜其生殖系统朝着妊娠的方向继续发生变化以适应胚胎发育的需要， 如黄体的 持续存在及孕酮的高水平分泌和维持，子宫内膜的持续发育和为胚胎提供组织营养的加强。 而对于配种后未受胎的母畜，其生殖系统则会退回到发情前状态，这时其黄体消失，子宫内 膜复原。因此，排卵后形成的黄体，只有在这时才能判断是妊娠黄体还是周期黄体。此后， 未受胎的母畜重新表现发情，生殖器官再一次开始为受精和妊娠作准备，重复上述过程。可 见，在发情后的最初一段时间(周期性黄体期)，不论是否配种或受精，母畜生殖系统均处于 受精后的生理状态之下，在生理现象上，怀孕和未孕并无区别。妊娠特异性的生理变化是在 这个阶段之后才逐步出现。因此，发情后母畜生殖器官的孕向变化是进行胚胎移植时，受体 母畜接受供体母畜胚胎并代之完成妊娠、 分娩过程的主要生理学基础。 只要移植时受体的生 理状态与胚胎的发育阶段相适应，胚胎即可继续发育。 2．早期胚胎的游离状态 胚胎移植技术得以实施的另一个重要的生理学依据是胚胎在发育的早期有相当一段时间 是游离存在的。 这时的胚胎尚未与母体建立起实质性的联系， 其发育主要靠自身贮存的养分。 这样，将胚胎从母体内取出，在短时间内胚胎不至于死亡，而当将胚胎置入与母体相类似的 环境中时，胚胎可以进一步发育成新个体。 3．胚胎移植基本不存在免疫问题 受体母畜的生殖道对于植入的具有抗原性质的胚胎，一般来说，在同一物种之内并不产 生排斥现象。这一点对于将胚胎移植技术应用于生产实践是极为有利的。但是在猪，胚胎自3体移植的受胎率及产仔率均高于异体移植。 4．胚胎和受体的联系 经移植的胚胎，如果得以存活，胚胎必将在较短的时间内和受体母畜的子宫内膜及其内 分泌系统建立起生理上和组织上的联系，从而确保正常发育所需要的环境和营养物质。 5．胚胎的遗传特性 胚胎的遗传物质来源于供体母畜及与之交配的公畜，受体母畜对胚胎并不产生遗传上的 影响，不会改变新生个体的遗传特性，也不会减弱其优良性状在出生后的表现程度。3.2 胚胎移植的基本原则3.2.1． 胚胎移植前后所处环境的一致性 指胚胎移植后的生活环境与胚胎的发育阶段 相适应，具体包括以下几个方面。 (1)供体和受体种属上的一致性 即二者属于同一物种，但这并不排斥种属不同但在进化史上血缘关系较近、生理和解剖 特点相似个体之间胚胎移植成功的可能性。一般来说，在分类学上亲缘关系较远的物种，由 于胚胎的组织结构、 胚胎发育所需要的条件以及发育进程差异较大， 经移植的胚胎绝大多数 情况下不能存活或只能存活很短时间。 例如将绵羊、 牛的早期胚胎移植到兔的输卵管内， 猪、 仅可存活数日。胚胎日龄的增加更降低了异种之间胚胎移植成功的可能性。 (2)生理上的一致性 即受体母畜和供体母畜在发情时间上的同期性。一般相差不超过 24h，否则移植成功率 显著下降。 (3)胚胎收集和移植部位的一致性 即从供体输卵管内收集到的胚胎应该移植到受体的输卵管内， 从供体子宫内收集到的胚 胎应该移植到受体的子宫内。 胚胎移植之所以要遵循上述同一性原则， 是因为发育中的胚胎对于母体子宫环境的变化十 分敏感，后者在卵巢类固醇激素的作用下，处于时刻变化的动态之中。在一般情况下，受精 和黄体形成几乎是在排卵后相同时间开始的， 受精后胚胎和子宫内膜的发育也是同步的。 胚 胎在生殖道内的位置随胚胎的发育而移动， 胚胎发育的各个阶段需要相应的特异性生理环境 和生存条件。 生殖道的不同部位(输卵管和子宫)具有不同的生理生化特点， 与胚胎的发育需 求相一致。 了解了上述胚胎发育与母体生理变化的原理， 就不难理解受体母畜与供体母畜生 理状况同期化的重要性。 一旦胚胎的发育与母体生理状况的变化发生脱节或紊乱， 这将意味 着彼此之间的关系遭到破坏，其结果将导致胚胎的死亡或流产。 3.2.2．胚胎发育的期限从生理学的角度讲， 胚胎收集和移植的期限不能超过周期黄体的寿命， 最迟要在周期黄体 退化之前数日以及胚胎附植之前进行。因此，胚胎收集多在发情配种后的 3～8 天内进行， 受体在相同的时间内接受胚胎移植。3．2.3 胚胎的质量在胚胎移植的操作过程中，胚胎不应当受到任何不良因素(物理的、化学的、生物的) 的影响，移植的胚胎须经过鉴定确认是发育正常的。 按照上述原则，胚胎移植只是胚胎生存空间位置上的改变，而不是生理环境的改变。这种 空间位置上的改变不会影响胚胎的生长发育。所以将胚胎从一头母畜直接移植到另一头母 畜，或经过运输再移植，仍可以存活并正常发育，直到分娩。胚胎移植的技术程序胚胎移植 的技术程序包括供体和受体的准备，供体超数排卵处理和配种，胚胎的收集，胚胎的检查， 胚胎移植等 为了从供体母畜得到较多供移植的胚胎，需对供体母畜进行超数排卵处理。同时，胚胎4移植成功与否和供体、 受体发情同期化成度密切相关， 故需人为地控制供体和受体地发情时 间，进行同期化处理。所以，超数排卵和同期发情是进行胚胎移植必须首先完成地两个基本 步骤。4 胚胎移植的技术程序4.1 供体和受体母畜的准备供体应该是良种母畜，不仅应具有较高的育种价值，而且应该有良好的繁殖机能。经产 母畜应在生殖机能恢复正常后方可作为供体。如猪和牛在分娩两个月后方可用作供体母畜， 已证明对超数排卵处理发应良好的母畜可反复用作供体。 每头供体需准备数头受体，受体母畜可选用非良品种的个体，但应具有良好的繁殖性能 和健康状态，体况中上等。在拥有大量母畜的情况下，可选择与供体发情时间相同的自然发 情个体作受体， 供体与受体母畜发情时间前后相差不宜超过一天。 由于在一般情况下难以找 到足够数量的自然发情母畜作受体， 所以多采用对受体母畜进行同期发情处理， 其方法见发 情控制技术。如图（胚胎移植的过程）4.2 超数排卵处理在母畜发情周期中的适当时间， 注射促性腺技术， 是卵巢上有比自然生理状态下更多的 卵泡发育并排卵，这种方法称超数排卵（Superovulation） ，简称超排。 1．超排处理的意义 很显然，如果不能得到足够数量的胚胎，就无法充分发挥胚胎移植 的优势。所以对供体母畜进行超排处理已成为胚胎移植技术程序中不可缺少的一个环节。 从理论上讲经超排处理后排出的卵子越多越好， 而事实上如果一次排出的卵子太多， 往 往会因为促性腺激素使用剂量过大而影响胚胎的质量， 出现受精率降低， 同时胚胎的收集率 也降低。对于牛和羊一般认为一次排出 10－15 枚卵子的超排效果较为理想。 2．超排处理方法 在母畜发情周期的适当时期，利用外源性促性腺激素处理，增进卵巢 的生理活性，诱发许多卵泡同时发育成熟并排卵。 （1）母牛 在发情周期的第 16 或 17 天肌肉或皮下注射 PMSGIU。该方法是5按照发情周期的规律，在黄体期即将结束，卵泡期即将来临前，顺势促进较多的卵泡生长和 成熟。这种超排方法必须和发情周期的进程配合好，所以在时间安排上受到限制，应用很不 方便。另一种方法是在发情周期的中期，在注射促性腺激素的同时，注射或子宫灌注 PGF2a 或其类似物以溶解黄体。一般是在发情周期第 10～13 天内进行。具体做法是在注射 PMSG 后，隔日肌肉注射 PGF2a 或 5～10mg，或子宫灌注 PGF2a2～3mg。如用 FSH，则连续注射 4～ 5 天，每天两次，总剂量为 30～40mg（国产品 400～500 大鼠单位） ，在第 5 次注射 FSH 的同 时注射 PGF2a。 （2）母羊 在发情周期的第 16～18 天，一次肌注（或皮下）PMSG750～1500IU，或每天 注射两次 FSH， 3～4 天， 连 出现发情后或配种当日再肌注 hCG500～700IU。 也可象母牛一样， 在发情周期中期处理，即在注射 PMSG 之后，隔日注射 PGF2a 或其类似物。如采用 FSH，用 量为 10～20mg（或 200～300 大鼠单位） ，分 3 天 6 次注射，第 5 次同时注射 PGF2a。 用 PMSG 超排处理牛、羊，虽然使用方便，仅需注射一次，但由于其半衰期长，会产生 后效应，导至发情期延长。因此，用 PMSG 进行超排受到局限，结合注射 PMSG 抗血清可以消 除半衰期过长的副作用。目前多采用 FSH 进行超排，连续注射 3～5 天，每天 2 次，剂量均 等或递减，效果较好。 超排效果受动物的遗传特性、体况、年龄，发情周期的阶段、产后时间的长短、卵巢功 能、季节、激素的品质和用量等多种因素影响。所以，不同的品种，不同的个体，对超排处 理的反应差异极大，超排效果很不稳定。这方面迄今仍是胚胎移植中有待改进的问题之一。4.3 供体母畜的配种经超排处理夫人，母畜，在表现发情后，应根据育种的需要，选择优良公畜的精液，适 时进行人工授精。为了得到较多得发育正常的胚胎，应使用活率高、密度大的精液，而且可 适当的增加人工受精的次数，两次受精间隔 8～10 个小时.4.3.1 胚胎的收集胚胎的收集是利用冲卵液将胚胎由生殖道中冲出， 并收集在器皿中。 收集胚胎有两种方 法， 即手术法和非手术法， 前者可用于各种家畜胚胎的收集， 后者仅适用于牛、 马等大家畜， 且只能在胚胎进入子宫角后收集。 收集胚胎时应考虑配种时间、排卵的大致时间、胚胎运行的速度和发育阶段等因素。只 有这样才能顺利地完成胚胎的收集过程， 并得到较高的胚胎回收率。 各种家畜授精后胚胎发 育的速度和运行情况见表。 胚胎收集的时间不应该早于排卵后的第一天， 最早应在受精卵完成第一次卵裂之后， 否 则不易辨别卵子是否受精。收集时间一般在配种后的 3～8 天，牛最好是在配种后的 6～8 天，即胚胎发育至桑椹胚或者早期囊胚，以便非手术法收集和移植。 1．手术法收集胚胎 根据畜种的不同及外科手术的要求，在腹中线或腹侧作一切口，先 将一侧输卵管及子宫角移出腹腔， 用注射器吸取冲卵液注入输卵管或子宫角内进行冲洗， 并 观察卵巢上的排卵情况。然后将该侧送回腹腔，并移出另一侧，用同样方法进行冲洗。 手术法冲洗胚胎有以下几种方式。 一种方式是用注射器的磨钝针头刺入子宫角顶端， 注 入冲洗液，然后再输卵管的伞部接取冲卵液，这种方式适用于牛、羊、兔等。另一种方式冲 洗的方向与此相反，即由伞部注入冲洗液，在子宫角上端接取。猪和马的子宫角与输卵管的 接合部有一活塞结构，用第一种方式，冲洗液不易通过，因此多采用第二种方式。上述两种 方式是当胚胎还处于输卵管时采用。 当确认所有的胚胎都已进入子宫角内时， 可采用冲洗子 宫角的方式，即从子宫角上端注入冲卵液，由基部接取，或者相反。这种方式适合于各种家 畜。冲卵液用量以子宫角容积大小而异。冲卵操作，要求迅速准确，以防止对伤口、生殖器 官和冲卵液的污染，力求避免给动物带来刺激和对生殖器管造成损伤。一般来说，术后生殖6器官容易发生不同程度的粘联，严重时会造成不孕，这是手术法收集胚胎最大的缺点。冲洗 之后，应立即缝合伤口，母畜应单独饲养，并随时观察其伤口的愈合情况。 。 2.非手术法 非手术法主要用于牛。冲卵液多选用杜氏磷酸缓冲液（PBS）4.4 胚胎检查方法收集到的冲洗液移至 37℃温箱内的培养皿内，静置 10min。胚胎沉入培养皿底部，移去上 层液，在 20 倍左右的解剖显微镜下检查，然后在放大到 50～100 倍. 非手术法收集胚胎 牛、马也可采用非手术法收集胚胎，由于它比手术法简单易行，而且 对生殖器官的伤害程度较小，因此在生产中较多采用此法 牛的非手术法收集胚胎可利用双通式或三通式导管冲卵器， 其差别在于双通式采卵器冲 卵液注入和流出是经同一管道完成的， 而三通式采卵器冲卵液的注入和流出是经过两个不同 的管道完成的。无论是双通式还是三通式，其外管前端均连接一气囊。当冲卵器插入子宫角 内时，充气冲卵液流入子宫体并沿着子宫颈口流出。每侧子宫角需冲卵液 100～500ml。冲 卵液的导出应顺畅迅速，并尽可能将冲卵液全部收回。为此，冲卵时最好用手在直肠内将子 宫角提高并略加按压， 以利于冲卵液流出。 胚胎的回收率与冲卵液回收的完全程度呈正相关。 应用非手术法收集胚胎时，只有当胚胎都进入子宫角后方可进行。显然，这种方法无法收集 停留在输卵管内的胚胎，因此，用非手术法收集牛、马的胚胎时，一般在配种后的 6～8 天 进行。 收集胚胎的冲洗液有多种，主要有杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS） ，布林斯特氏液，合成输 卵管液（SOF） ，惠屯氏液，Ham’s F－110 以及 TCM－199，尤以 D-PBS 最常用。它们除含有 多种盐外，还含有多种有机成分，不但可用于胚胎收集，还可用于胚胎体外培养，冷冻保存 及解冻等。 收集胚胎的冲洗液可不含牛血清白蛋白，培养和保存时则需加入，或以胎犊血清代替。 血清白蛋白的含量一般为 0.3～1％，犊牛血清需在 56℃时持续灭活 30 分钟，冲卵液、培养 液中血清的含量一半分别为 5％、10～20％。4.5 胚胎保存4.5.1 、异种活体保存 4.5.2、常温保存 4.5.3、低温保存 4.5.4、冷冻保存：1、 常规的慢速冷冻 尽管低温生物学有了许多发展， 但新的胚胎冷冻方法却很少用于生产 实践。目前，大多数的哺乳动物胚胎采用传统的慢速冷冻方法冷冻保存，使用渗透较快的低 温保护剂，缓慢的冷却速度和比较快的解冻速度。传统的慢速冷冻方法分为以下几步：1） 室温下胚胎置于小分子量可渗低温保护溶液中（如乙二醇、甘油、二甲基亚枫或丙二醇） ， 且在胚胎和冷冻保护液之间达到平衡；2）一般在-5℃～-7℃植冰；3）可控的、缓慢降温 （0.33～1.0℃／分） ；4）降温到-30℃或-70℃时，投入液氮中保存；5）快速解冻；6）在 培养或移植前，在室温下除去低温保护剂，为保持细胞的正常生理功能。每一步冷冻方法都 是至关重要的。 2、 玻璃化冷冻 玻璃化冷冻定义为在冷冻液处于完全玻璃化状态下冷冻保存细胞， 组织或器 官（Rall，1985） 。为在一定冷冻速度下形成玻璃化（直接投入液氮，-2500℃/分） 。需要使 用高浓度的可渗低温保护剂，然而，浓度过高会对细胞有毒害作用。从理论上讲，如果要以 -1500℃/分的速率进行降温，那么，1.5M 的任何低温保护剂都可以形成玻璃化，但这需要 昂贵而复杂的仪器。 近几年， 人们通过减少冷冻液的体积和冷冻液与冷冻和解冻直接接触的7方法来提高冷冻和解冻速度， 从而最大限度的减少冷冻液对胚胎的损害， 其中 OPS 法 （Vajta， 1998a；1998b）和 cryoloop（Arav，1997；Martino，1996；Papis，2000）法获得较好的 效果。4.6 胚胎的移植：4.6.1 手术法移植在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，然后用注射器或移植 管将含有胚胎的培养液或冲冼液注入到子宫角内或输卵管内。4.6.2牛非手术法胚胎移植操作步骤1 、受体牛在发情后 6―8 天之间均可进行移植（发情之时定为 0 小时） 。移植前对受体牛进 行直肠触摸，检查黄体是否合格。合格者用于移植。 2、 在移植之前必须先进行尾椎硬膜外麻醉 ，擦拭外阴部。 3、 对照供体牛采胚记录表和合格受体的发情记录，合理地搭配受体和胚胎。 4、 解冻胚胎。 5、 重新将胚胎装入 0.25ml 塑料细管（直接解冻移植法不需要重新装管） 。 6、 细管装入移植枪。 7、 把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧，再套上软外套。 8、 将胚胎移植到受体黄体侧的子宫角大弯处。 9、 做好受体移植记录。4.6.3、妊娠的受体牛的饲养管理1、 在移植后 70―90 天对受体牛进行妊娠检查，对已妊娠的受体要加强饲养管理，避免应 激反应。 2、 妊娠受体在产前 3 个月要补充足量的维生素、微量元素，适当限制能量摄入，既要保证 胎儿的正常发育，又要避免难产5胚胎移植的影响因素5.1.1 胚胎的来源 胚胎的获得有两种途径，一是卵子和精子的结合是在体外环境中完成8的， 即体外胚； 另一种则是体内胚。 体外胚的生产是解决胚胎成本高、 来源匮乏的有效办法。 但经卵母细胞的体外成熟、 体外受精以及早期胚胎的体外培养所获得的体外胚胎与通过超数 排卵技术在体内完成受精所获得的体内胚胎相比发育潜力明显低， 移植后的受胎率也低。 目 前，体外胚的受胎率一般在 10%～30%之间。经胚胎超微结构的研究表明，牛体外受精胚胎 的细胞间连接数量明显少于体内胚胎， 内细胞团的细胞之间的紧密程度低于体内胚胎， 卵裂 球的胞质中出现高度的囊泡化， 这被人们普遍认为是体外胚妊娠率低的主要原因。 但是随着 体外受精技术和其他配套技术的不断完善， 尤其是牛活体采卵技术的应用， 体外胚移植效率 将得到很大的提高。5.1.2 胚龄 牛非手术采卵大都在发情后的第 7 d(6～8 d)，胚胎移动到子宫角时进行子宫胚胎采集。获得的胚胎胚龄为 7(6～8)日龄，这时的胚胎处于桑椹或囊胚期。由于囊胚期胚 胎的内细胞团细胞数量多， 细胞对不良环境因素的耐受力强， 进一步发育的潜力要比桑椹期 胚胎大，因此在早期胚胎的体外培养体系中大都以囊胚发育率作为衡量胚胎培养效率的指 标。总之，在供、受体牛发情相应同期的情况下，囊胚移植妊娠率要比桑椹胚高。5.1.3 胚胎的冷冻保存 胚胎超低温保存以及解冻的技术已相对成熟，但冷冻和解冻的过程对胚胎的细胞仍有伤害。 在操作合理的情况下， 冷冻和解冻后的胚胎存活力下降 20%左右。 如牛鲜胚移植的受胎率在 50% 左右，而冻胚的移植受胎率则为 40%左右。尽管如此，胚胎的 冷冻保存仍是胚胎移植不可缺少的技术环节之一，它可以使胚胎移植不受时间和空间的限 制，从而使胚胎移植技术的应用更具广泛性。5.1.4 胚胎的数量 一般情况下，1 头受体牛 1 次只植入 1 枚合格胚胎，但如果有 2 枚负 C 级胚胎，也就是说，这 2 枚胚胎发育潜力不大，但又有进一步发育的可能，如果将它 们单独移入，则发育成胎儿的可能性很小，但将它们同时植入 1 头受体牛子宫内，其发育 成 1 个甚至 2 个胎儿的机会就大大增加了。理论上的依据是 2 枚胚胎与 1 枚胚胎相比，2 枚胚胎向受体母牛传递信息的生物信号更强， 胚胎与母体之间易建立妊娠联系， 所以受孕机 会大。5.1.5 胚胎的发育潜力 胚胎的发育能力一般可由形态学鉴定来确定。但除了形态正常之外，胚胎发育的潜力也是胚胎能否存活并继续发育的重要因素。经研究发现，胚胎的发育潜 力与供体母牛的生殖能力有密切关系。 即生殖力正常的供体牛不仅其超排效果好， 且其胚胎 发育潜力要比低生殖力(不宜受胎的)母牛的大。5.1.6 受体牛 受体牛是接受胚胎的母体，被植入其体内的胚胎存活所需的免疫环境、继续发育所需的营养环境都是由它来提供的。 所以， 受体牛的质量好坏直接影响胚胎移植成功 率高低。5.1.7 受体牛与供体牛发情同期化程度 受体牛与供体牛发情是否同期， 也就是受体牛的发情后天数与胚胎日龄是否同步， 是胚胎移植成功的关键因素。 同期化程度或同步程度越 高，胚胎移植成功率越高(一般差异不超过 24 h)。因为子宫只允许同步胚胎发育而对非同 步胚胎有毒害因素；另外，不同步胚胎被移植前后所处的生理环境不同，不能存活也不能向 子宫发出它们存活的信息。那么两者之间不能建立妊娠联系，不能着床。5.1.8 受体牛的黄体状况 黄体是卵泡成熟、破裂、排出卵母细胞后，在原处由颗粒细胞增生形成的暂时性分泌组织。 它是卵巢排卵的标记， 也是分泌孕酮――维持妊娠所必需的激 素之一的组织。所以，胚胎移植时受体牛黄体的发育状况直接影响移植妊娠率。黄体质量的 判断，不同的人有不同的感觉和经验，一般根据黄体的大小、形状和弹性来判断。另外，胚 胎植入与黄体处于同侧的子宫角比植入对侧子宫角，受胎率要高。5.1.9 受体牛的子宫、卵巢的生理状况 受体牛的子宫是胎儿整个发育过程的场所，所以子宫的健康环境和机能状况直接影响胚胎的着床和胎儿的正常发育。 而卵巢的生理状况决 定着维持正常妊娠所需要的多种激素水平的平衡。在实践中，主要以子宫和卵巢的大小、形9状和弹性来判断。5.1.10 受体牛的孕酮水平 受体牛体内孕酮水平和变化指标可以直接反映母牛妊娠环境的好坏。上面所述的黄体质量等的检查都是通过直肠检查，凭感觉来判定的。一方面需要实 践经验的积累，另外，其准确性也受到限制。通过放免(或酶免)的方法监测受体牛乳(或血) 中的孕酮的水平变化，来判断牛的发情和黄体的状况更科学。在实践中，如果将两者结合起 来就会更理想。5.1.11 受体的营养和健康状况 健康和营养状况良好是母牛拥有正常繁殖的前提和基础。家畜的所有繁殖活动、生殖器官或组织的变化、各种激素的合成、分泌和调节以及神经 传导都要依赖物质和能量的积累和正常机能的具备。 而体况(膘情、 被毛的光泽等)是牛的营 养和健康状况最直观的反映，所以体况良好的母牛才能被选作受体牛。5.1.12 泌乳 泌乳活动不仅与母牛下一轮繁殖的发情、 排卵、 受胎、 妊娠争夺营养和能量， 维持泌乳所必需的促乳素也抑制卵泡发育、妊娠所必需的雌激素、孕激素的合成和分泌。处 于哺乳期的母牛如果被选作受体牛， 应尽快断奶， 以提高其发情、 排卵和移植后妊娠的比率。5.2 其他因素5.2.1 技术人员的操作 技术人员的正确操作是胚胎移植成功的前提和保证。 室内人员必须最大程度地控制环境条件， 比如周围空气的温度、 湿度、 清洁度； 处理胚胎的液体的温度、 渗透压以及暴露在外界的时间长短等等， 这些因素都直接作用于胚胎， 对其细胞产生不同程 度的伤害。 所以避免或减少外界有害因素对胚胎的伤害是室内人员操作的基本原则。室外 人员的移植操作是胚胎移植的最后一个环节。 操作者的熟练程度、 移植位置、 内膜破坏程度、 移植器械和生殖道的相对无菌程度等等这些都对胚胎移植的结果产生影响。5.2.2 季节 现在的肉牛、奶牛品种基本都是全年发情。但是温暖、湿润、饲草充足的季节无疑更适宜母牛繁殖， 这时进行胚胎移植， 受胎率相对也会提高。 季节对家畜繁殖的影响， 实际上是由于季节变化而带来的饲料、 光照、 舒适度等对家畜产生生理影响(包括营养储备、 生殖内分泌的调节等)，从而影响它的发情、排卵、以及受孕。 胚胎移植涉及的技术环节非 常多，任何一个环节的疏忽都会导致移植的失败。只有认真、规范地完成好每一个细节，以 排除对胚胎有不利影响和阻碍妊娠建立的一切内、 外因素的影响， 才能保证较高的移植成功 率。6如何提高胚胎移植成功率6.1 制定科学的品种改良实施方案俗话说“兵不在多，在于精”“畜不在多，在于良” 、 ，牲畜的良种化高低是衡量一个地区、 一个地方畜牧业发展水平的高低，尤其是在市场经济条件下，政府参与，政策引导、扶持， 制定切实可行的品种改良政策， 实现农牧民增收意义重大， 只有政府出台相应的品种改良措 施、方案，业务部门认真实施，这样才能做到任务明确、技术有保障，平时注重检查、督促， 逐渐形成一个良性循环， 为牲畜品种改良工作创造一个良好的环境氛围。 裕民县胚胎移植的 实施是从 2002 年开始，当年只有 8 头，2003 年 20 头、2004 年 223 头、2005 年 445 头，后 面几年每年保证移植 100 头。这几年移植数量的不断增加，无疑是行政措施到位、技术得到 保障、养殖户积极配合的结果。从这些年移植情况看，移植成功率平均为 46%，品种主要是 美国褐牛杂交一代以及荷斯坦牛。6. 2 抓好移植季节，确保胚胎移植成功率根据这些年的移植经验，受体牛的发情移植受气候的影响较大。裕民县主要是采取自然发情、报告、检查、移植等措施，每年基本是从 4 月份开始组织牛群，5 月份开始移植，到 10 月份结束，这 6 个月中，5 月、7 月、8 月上旬 移植受胎率较低，这些时间因气候较冷或气候炎热，饲养管理条件相对较差，这期间当地主10要是靠天然放牧而且补饲跟不上，造成母牛发情效果不好，检查卵巢质地较软，不充实，往 往出现母牛只发情不排卵，移植成功率较低，而在 6 月、8 月中下旬、9 月气候凉爽，牧草 生长旺盛，放牧条件较好，对于母牛的发情极为有利，移植成功率较高，这段时间牛的卵巢 检查质地较充实，黄体生长良好，胚胎移植成功率较高。6.3 饲养管理好坏直接影响母牛发情和移植效果牛的胚胎移植对受体牛要求较高，除牛 的本身条件外，饲养管理水平也至关重要，管理水平的好坏对移植工作影响很大，应在移植 的头一年就加强饲养管理，保证中等膘度，过瘦、过肥都不利于母牛的发情、排卵，所以平 时应饲喂优质干草和补充精料。 本县一养殖户 2005 年饲养 30 头母牛， 由于平时只添加农作 物秸秆， 没有补充精料、 微量元素和维生素等， 2～5 月移植的 20 头牛中， 在 只有 6 头妊娠， 且有 2 头在妊娠 40d 后因饲养管理不当而流产，而另外一饲养户在 2006 年移植的 9 头牛中 有 7 头妊娠，且成活率 100%，这说明饲养户注重饲养管理，饲喂优质干草，还补充精料、 微量元素和维生素。 所以饲养管理水平的好坏对于牛胚胎移植的成功率非常重要， 主要是影 响牛的发情排卵和妊娠。6.4 加强牛群的组织管理 牛的胚胎移植工作环节较多，任何一个环节出现差错，都会影响移植的成功率，所以开展牛的胚胎移植应根据当地实际情况来组织牛群，开展移植，本县 集中放牧较为普遍，所以应固定好牧工，同时做好母牛的发情观察、登记和报告工作，牛群 数量应以 100 头以内为宜， 太大不宜管理和也不易观察母牛发情， 牛群太小容易造成费用增 加。牛群组织前应进行生殖系统检查，生殖机能正常者组群，有异常者进行剔除，为了保证 做到母牛发情观察准确、及时，对牧工和养殖户进行必要的业务培训，同时在移植期间，发 情报告者必须与移植部门的业务人员联系畅通，做到发情观察准确、报告及时、检查移植到 位，不论气候恶劣与否做到检查移植雷打不动，始终保持移植工作的连贯性，从不间断，只 有这样才能保证较高的移植成功率。6.5 移植操作人员应操作熟练，判断准确移植检查人员应根据母牛发情后的卵巢、黄体变化情况，来判断是否移植，这一点至关重要；另一方面就是在移植过程中从各种器械的清 洗、消毒到胚胎的解冻、装枪、移植都应规范，尤其是在移植过程中，应注意黄体侧位的生 理变化， 即哪一侧的卵巢排卵、 生长黄体； 进移植器时动作应轻快， 不要人为损伤子宫内膜， 尽量把胚胎送到子宫角深处，特别是年轻母牛子宫颈口较细，进枪困难，所以应特别注意； 同时对于胚胎质量应严格把关，应从正规渠道购进胚胎，注意保存，移植完毕后，应对受体 牛佩戴标识。胚胎移植定胎，应在移植后 2 个月开始，太早易判断失误，太晚对于没移植成 功的牛造成空怀期延长，增加饲养成本。在牛的移植过程中，应尽量避免防疫注射，因为移 植后防疫易造成应激反应，影响受胎。业务部门还应做好移植前、中、后期的各项档案记录 工作，同时做好跟踪服务，加强管护，保证妊娠过程不中断，防止流产现象出现，在牛的整 个移植工作中，还应抓好种公牛的管理，严防偷配现象发生。牛的胚胎移植是发展畜牧业良 种的一项重要技术措施，涉及畜牧业多个技术环节，包括牲畜的饲养管理技术、疫病防治、 繁殖技术等的应用。从牛的品种改良角度来讲，应将牛的胚胎移植工作加以推广，使该项技 术工作发挥应有的作用，更好为畜牧业生产服务。7 胚胎移植技术的意义胚胎移植被认为是继家畜人工授精技术之后家畜繁殖领域的第二次革命。 人工授精技术极大 地提高了优秀种公畜的利用率， 胚胎移植技术则极大地增加了优秀母畜的后代数， 挖掘了母 畜的遗传和繁殖潜力。在畜牧业生产与科研中胚胎移植技术主要用于以下几个方面： （１）增加进口纯种畜和优秀个体的后代数。用于纯繁扩群，增加种畜的数量。 （２）缩短家畜的改良周期，加速品种改良。纯种牛的胚胎移植给黄牛，可将 15－20 年的 改良周期变为一年，大幅度地提高了家畜的遗传品质和生产性能。11（３）用于单胎动物的育种，可缩短选择种牛的年限。如牛的 MOET 育种方案比后裔测定育 种方法遗传进展快。 （４）移植产双胎，提高生产效率。对肉用家畜尤其有价值。同时移植双胚或双半胚或在配 种后第 7 天前后移植一枚胚胎，可获得 30%以上的双犊率。 （５）代替种畜的引进。 （６）保存品种资源。保存于具有优良遗传特性的家畜胚胎库、基因库，保护濒临灭绝的家 畜和动物品种。 （７）用于一些疾病的诊断和治疗。 （８）发展家畜生物技术的研究手段。这项技术是胚胎分割、嵌合、核移植、体外受精和转 基因动物等家畜生物技术不可缺少的技术革新手段，也可用于生物学和医学的研究。7.1 在牛上的具体方面7.1.1 发挥优良母牛的繁殖潜力，提高繁殖效率一般情况下，1 头优良成年母牛每年只能繁殖 1 头犊牛，而应用（鲜、冻）胚胎移植技术后， 每年可得到 15~16 枚可用胚胎， 直接移植后可产出 10~11 头优良母牛的后代， 若采用冷冻胚 胎移植也可产出 6~7 头优良母牛的后代，加速了良种牛群的建立和扩大。7.1.2 加速品种改良，扩大良种牛群自然生产的母牛，其产生的成熟卵子很少，且胚胎的发育还要在自己体内进行，妊娠期会占去一生中大部分时间。应用（鲜、冻）胚胎移植技术， 可使母牛排出多数卵子，同时解除孕育胚胎的职能，会使其产生大量的后代，能够使良种牛 群迅速建立和扩大，有利于选种工作的进行和品种改良规划的实施7.1.3 诱发肉牛怀双胎，提高生产效率对发情的母牛配种后再移植 1 个胚胎到排卵对侧 子宫角内。 这样配种后未受孕的母牛可能因接受移植的胚胎而妊娠， 而配种后受孕母牛则由 于增加了 1 个移植的胚胎而怀双胎。 另外， 也可对未配种的母牛在两侧子宫角各移植 1 个胚 胎而怀双胎，从而提高生产效率。 7.1.4 代替种牛的引进冷冻胚胎可以长期保存，这就使胚胎移植突破了时间和空间的限制。从国外进口种牛胚胎， 到国内进行移植，从而产下种牛，就会大大节约购买和运输种牛的费用。此外，利用引进胚 胎在国内移植产下的种牛，容易适应当地的环境条件，又可从养母那里得到免疫力，这些都 是优于直接引进活牛的优点。7.1.5 保存品种资源胚胎可以长期保存，是保存某品种牛的理想方式，比保存活牛的费用低得多。7.1.6 克服不孕如果优良的母牛容易发生习惯性流产或难产， 以及由于其他原因不宜负担妊娠过程， 可采用 移植技术，让其他牛将其后代繁殖产出。7.1.7 作为育种手段超数排卵和胚胎移植技术相结合形成了比人工授精更为先进的育种方式， 可显著地缩短世代 间隔，加大选择强度，提高选择的准确性，并且可以用大量的全同胞和半同胞后裔资料，避 免了耗资费力而又难于实施的后裔鉴定。7.1.8 提高经济效益和生态效益将高产奶牛胚胎移植给低产奶牛或黄牛，获得 1 头纯种奶牛需要 7 500 元，而通过人工授精 技术获得 1 头高产奶牛需要级进改良 3 个世代，按每个世代产 1 个母犊，则需 6 个世代即 15 年才能接近其父母代的生产水平，而每个世代直接培育费需 3 000 元左右，6 个世代需 1.8 万元，因此获得 1 头胚胎移植牛即可节约培育费 1.05 万元。应用胚胎生物技术，对受 体牛而言，其后代产奶量将提高 3.9 吨，每头奶牛可增收 5 850 元。通过胚胎生物技术，获12得 1 头高产奶牛缩短 6 个世代，可节约大量的饲草饲料资源，节省的资源可增加饲养奶牛 6 头，增收 1.8 万元。以上 3 项，获得 1 头胚胎移植牛可节支增收 3.435 万元左右。8结束语从理论上讲，胚胎移植可以提高繁殖力无数倍，但实际应用中，就现有的技术水平所取得的 结果而言，要比理论数据低得多。不过，胚胎移植在奶牛中的应用得到了飞速地发展，随着 体外受精技术、 性别控制技术和早期妊娠诊断技术的日益发展， 胚胎移植必将有更为广阔的 前景。 参考文献: [1] 闫秀林.生物技术概论[M].沈阳：辽宁科学技术出版社， [2]旭日干?哺乳动物繁殖生物学技术[M]?内蒙古:内蒙古大学出版社,? 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