western blot 内参为什么总是显不出内参

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-06-04 03:30 标签： western blot 内参
与你的目的蛋白一样,用beta actin的一抗和相应二抗,做出 beta actin 的条带来,一般来说,如果你的蛋白质上样量已经用BCA或BRADFORD法定量后统一上样的,那么你的beta actin 条带亮度应该是一致的,如果不一致,则可能是蛋白定量过程中的误差所致,应该重新定量以统一上样量,只有在beta actin 一致的情况下,才能验证上样量的一致,才可以对目的蛋白亮度作出比较,在此基础上,也可以用同一样本分别得出来的目的蛋白条带和beta actin 条带亮度比值作为该样本的蛋白表达量,这样更精确,再一次校正了实验误差

标题: 【求助】western-blot的内参为什么都做不好？

【求助】western-blot的内参为什么都做不好？


最近几天刚开始做western-blot，昨天做b-actin(43KD)，有几个样本出来阳性带，位置也对，但都非常弱，照相都照不下来（用凝胶成像系统）。今天为了验证一下总蛋白的浓度，进行了考马斯亮蓝的染色，结果都还可以。我想请教一下各位高手：难道我提取的蛋白真的浓度过低？每次电泳上样前都需要测定蛋白浓度吗？
另外，我的一抗和二抗的浓度分别是1：500和1：1250，不知道是否合适？还需要调整吗？


1.最好是测下浓度,不测也没关系
2.你的一抗和二抗要按说明书稀释.我觉得你的二抗浓度过高,1:5000试试


我的一抗是中杉的产品，是进口分装的，说明书上建议做WB时稀释比例为1：100到1：1000。另外二抗的比例是实验室老师建议的。
二抗你们一般稀释多少倍？


另外我还想请教一个问题：我是组织提取蛋白，用的蛋白提取液（200－300ul，视组织大小而定)＋5ul蛋白酶抑制剂（浓度是2mg/500ul)，我用的蛋白酶抑制剂难道过少？从而提取的蛋白量少？

如果你用北京中衫的二抗,二抗浓度高了，
只是二抗体浓度浓度高了，你可以用1:3000 到1:10000,
另外信号比较弱,你可以ECL显光,相当灵敏, 你可以试一下


除了楼上战友说的二抗问题外，我提几点：1.如果蛋白浓度没问题（我觉得你的蛋白提取没有什么问题），可以转完膜以后用丽春红染色，看一下转膜的效果如何，如果染色后条带清晰，可排除转膜的原因；2.可以考虑适当降低封闭液的浓度，有时按“分子克隆”上5％脱脂奶就是做不出来。我的内参（43KD，羊源）是在0.5％浓度上做出来的；3.还可以考虑三抗系统，即二抗采用生物素标记，三抗采用辣根酶标记，其灵敏度比二抗系统高一个数量级。我实验中用二抗做不出来的指标用三抗都做出来了。


我用的二抗是中杉的，效价是1：3000。你可以试试。还有内参很容易出来的，是不是你的蛋白样品出现了问题啊。楼上的排除法很好的，谢谢。

其实，中杉代理Santa的B-actin并不好用，但是它代理国内一家医院自产的actin很好用的，大概100ul不到500RMB，我们实验室基本都改用国产的了！

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