日本那么多樱花赏，哪里的樱花最美呢？看樱花应该注意什么？樱花的花语又是什么？选择什么样的樱花礼物带回国呢？
说到日本，几乎所有人都会想到日本春季盛开的樱花，尤其三到四月份，很多人都有到日本赏樱花的愿望，幻想自己走在花雨中的感觉，没有比这更浪漫的了。但是日本那么多樱花赏，哪里的樱花最美呢？看樱花应该注意什么？樱花的花语又是什么？选择什么样的樱花礼物带回国呢？今天编辑就带你走进春季的樱花日本~
去哪看樱花？
推荐地点1：大阪造币局
大阪造币局樱花通道从19世纪末开始就成为大阪春天的象征，院内的樱花有关山、普贤象、松月、红手球、芝山、黄樱等约120个品种。在造币局里，每年4月中旬左右，都会配合该年度樱花的开花时间，将南门(天满桥一侧)至北门(樱桥一侧)全长560米的通道对外开放1周。每当此时，通道两旁皆是樱瓣舞，美丽非凡。
推荐地点2：东京-上野恩赐公园
如果你只去东京游玩，那么位于东京都台东区的上野恩赐公园就是你赏樱花的不二之选。这里是日本第一座公园，公园内种植有大量的染井吉野樱花和山樱花，是东京都内屈指可数的观赏樱花的著名公园之一。赏樱之余，现在的上野公园由上野动物园、国立西洋美术馆、国立科学博物馆、东京国立博物馆等构成，艺术气息浓郁，是东京不可错过的好去处。
樱花的花语是什么？
樱花花语：热烈、纯洁、高尚，是爱情与希望的象征。因为樱花的生命很短暂，所以在日本有一民谚说：“樱花7日”,就是樱花从开放到凋谢大约为7天，整棵樱树从开花到全谢大约16天左右,形成樱花边开边落的特点。也正是这一特点才使樱花有这么大的魅力。被尊为国花，不仅是因为它的妩媚娇艳，更重要的是它经历短暂的灿烂随即凋谢的“壮烈”，日本人认为人生短暂，活着就要像樱花一样灿烂，即使死，也该果断离去。
赏樱花最该注意什么？
这里需要注意的是，樱花花期很短，古话所谓的樱花七日实际上也并不过分，这恐怕也是日本人之所以迷恋樱花的原因之一吧，因此请不要在犹豫什么了，趁日本樱花的满开日还没到来，赶紧收拾行装，让我们相约日本，共同追逐这朵飘荡在日本岛上的梦幻云彩吧~
送什么样的樱花礼物？
推荐礼物1：SK-II肌源赋活修护节日礼盒
春季到日本赏樱花，应该选择什么样的礼物买给自己或送给亲朋好友呢？小编推荐这款SK-II肌源赋活修护节日礼盒哦！其中不但含有SK-II明星产品-神仙水，还包含家喻户晓的面膜和面霜以及各款护肤产品，樱花设计更有纪念。而且SK-II在最具权威的美容化妆品排行榜之一的Cosme美容大赏获得非常好的排名！这个套装只在日本免税店有售哦，价格相较于中国国内更是享受42%的折扣，是你不错的樱花伴手礼选择~更多优惠请搜索
推荐礼物2：荣太楼樱花果冻
另外，春季到日本赏樱花，一定少不了的就是这款樱花布丁，它出自日本三百年的老字号荣太楼，樱花布丁属于樱花季限定产品，每颗布丁里面都包裹着一朵完整的八重樱，上层是果冻，下层是布丁，看起来晶莹剔透，每年只有樱花盛开的一个多月内能够品尝到，赏味期较短，只有60日元，越是新鲜就越发显得娇嫩，一定不要忘记品尝哦！
推荐礼物3：和服推荐梦馆
去看樱花怎么能不穿着日本的传统服饰和服呢？！和服起源可追溯至公元3世纪。到了奈良时代，日本遣使来中国，获赠大量夺目的朝服。次年，日本效仿隋唐服饰，至室町时代，和服在沿承唐朝服饰基础上改进，而和服腰包则是受基督教传教士穿长袍系腰带影响而创造，日本人将他们对艺术的感觉也淋漓尽致地表现在和服上，所以去看樱花，可以选择和服哦！推荐这家梦馆，你可以在网络上搜索到官网，而且经常有特价活动，超高性价比是你的不错选择~
这一趟春季樱花之旅一定会让你收获最美丽春天回忆！总之视觉味觉都满足了，还收获了实用的护肤品，你心动了吗？
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祖先崇拜与中国古代神话――兼论中西神话不同历史命运的宗教思想根源赵沛霖&&& 1121985
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原载：天津社会科学
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WIPO Patent Application WO/
The invention discloses an angiogenesis inhibitor, which has an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and a molecular weight of
daltons as determined by non-reducing SDS-PAGE. The invention further discloses a purification method of the angiogenesis inhibitor by anion-exchange chromatography and immunoaffinity chromatography, and a pharmaceutical composition and an injection comprising the angiogenesis inhibitor.
Inventors:
LI, Xiaoyi (Room 110-111, Bio-Informatics CentreNo. 2 Science Park West Avenue,Hong Kong Science Park, Shati, New Territories Hong Kong, Kong, CN)
李小羿 (中国香港特别行政区沙田香港科学园科技大道西二号生物资讯中心110-111室, Hong Kong, Kong, CN)
DAI, Xiangrong (No.30 Tian Zhi Road, New and High-Tech Industrial Development ZoneHefei, Anhui 8, 230088, CN)
戴向荣 (中国安徽省合肥市高新区天智路30号, Anhui 8, 230088, CN)
YANG, Zhongqiang (Room 110-111, Bio-Informatics CentreNo. 2 Science Park West Avenue,Hong Kong Science Park, Shati, New Territories Hong Kong, Kong, CN)
杨中强 (中国香港特别行政区沙田香港科学园科技大道西二号生物资讯中心110-111室, Hong Kong, Kong, CN)
ZHANG, Guohui (Room 110-111, Bio-Informatics CentreNo. 2 Science Park West Avenue,Hong Kong Science Park, Shati, New Territories Hong Kong, Kong, CN)
Application Number:
Publication Date:
02/16/2012
Filing Date:
06/16/2011
Export Citation:
ZHAOKE PHARMACEUTICAL (HONG KONG) COMPANY LIMITED (Room 110-111, Bio-Informatics CentreNo. 2 Science Park West Avenue,Hong Kong Science Park, Shati, New Territories Hong Kong, Kong, CN)
兆科药业（香港）有限公司 (中国香港特别行政区沙田香港科学园科技大道西二号生物资讯中心110-111室, Hong Kong, Kong, CN)
LI, Xiaoyi (Room 110-111, Bio-Informatics CentreNo. 2 Science Park West Avenue,Hong Kong Science Park, Shati, New Territories Hong Kong, Kong, CN)
李小羿 (中国香港特别行政区沙田香港科学园科技大道西二号生物资讯中心110-111室, Hong Kong, Kong, CN)
DAI, Xiangrong (No.30 Tian Zhi Road, New and High-Tech Industrial Development ZoneHefei, Anhui 8, 230088, CN)
戴向荣 (中国安徽省合肥市高新区天智路30号, Anhui 8, 230088, CN)
YANG, Zhongqiang (Room 110-111, Bio-Informatics CentreNo. 2 Science Park West Avenue,Hong Kong Science Park, Shati, New Territories Hong Kong, Kong, CN)
杨中强 (中国香港特别行政区沙田香港科学园科技大道西二号生物资讯中心110-111室, Hong Kong, Kong, CN)
International Classes:
C07K14/435; A61K38/17; A61P35/00; C07K1/18; C07K1/22
View Patent Images:
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Foreign References:
CN1733913ACN1737133ACNA
Other References:
HIROSHI MIZUNO ET AL.: "Crystal structure of an anticoagulant protein in complex with the Gla domain of factor X", PNAS, vol. 98, no. 13, 19 June -06-19), pages 7230 - 7234, XP, DOI: doi:10.1073/pnas.
DATABASE GENBANK 13 May -05-13), "C-type lectin [Deinagkistrodon acutus]", Database accession no. AAM22788.1
Attorney, Agent or Firm:
BEIJING EASTKING PATENT AGENT FIRM (Room 1807, Hengrun International Mansion No. 32 North Third Ring Road Wes, Haidian District Beijing 6, 100086, CN)
权 利 要 求 书
1、 一种抑血管生成素， 其特征在于， 其氨基酸序列选自 SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2 , 具有用非还原性 SDS- PAGE法测定的 25000 ~ 35000 道尔顿之间的分子量， 具有抑血管生成活性。
2、 如权利要求 1所述的抑血管生成素， 其特征在于， 采用还原性 SDS-PAGE 法测定显示为两条带， 分别称 α链和 β链， 分子量分别为 12000 ~ 22000道尔顿、 9000 ~ 19000 道尔顿， 其中， α链的氨基酸序 列如 SEQ ID NO. 1所示， β链的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2所示。
3、 如权利要求 2所述的抑血管生成素， 其特征在于， 经双向电泳 后会分別产生与所述 α链和 β链对应的异构体各三个。
4、 如权利要求 1所述的抑血管生成素， 其特征在于， 其与杂交瘤 细胞株 1D91D9 , 保藏号 CCTCC C201036 , 分泌的单克隆抗体特异性结 合， 该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的主要抗性为与抑血管生成素 特异性结合。
5、 如权利要求 1所述的抑血管生成素， 其特征在于， 其能够抑制 肿瘤生长。
6、 如权利要求 5所述的抑血管生成素， 其特征在于， 所述肿瘤选 自人的黑色素瘤、 He la细胞以及 Κ562细胞。
7、 如权利里要求 1至 6任一项所述的抑血管生成素的纯化方法， 包括如下步骤：
( a )将尖吻蝮蛇粗毒溶解于緩沖液中， 其中蛇毒与緩冲液的体积 比为 1 ~ 2： 10, 离心得到上清液；
( b )将所得上清液过二乙胺乙基阴离子交换层析柱进行层析， 得 到抑血管生成素粗溶液；
( c )将杂交瘤细胞株 1D91D9 , 保藏号 CCTCC C201036 , 分泌的单 克隆抗体与亲和层析载体偶联， 制备得免疫亲和层析柱； (d) 用所得免疫亲和层析柱纯化步骤 （b) 所得抑血管生成素粗 溶液， 以洗脱緩冲液洗脱， 收集得到所述抑血管生成素。
8、 如权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 步骤 （a) 所述緩冲 液为 H 7.0~ 9.0的 0.01 ~ 0. lmol/L的 Tris-HCl緩沖液。
9、 如权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 步骤（&&所述尖吻 蝮蛇粗毒离心 1次， 离心速度为 4000r/min， 每次离心 15min。
10、 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于， 步骤（b)所述层析 pH 6.0 ~ 9.0 的 0.01 ~ 0.05mol/L 的 Tris-HCl 緩冲液和 0.05 ~ 0.6mol/L NaCl 溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱， 洗脱时间为 I440min, 洗脱流速 5ml/min。
11、 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于， 步骤（c)所述亲和 层析柱载体为 4B琼脂糖凝胶、 二乙氨基葡聚糖凝胶、 羧曱基葡聚糖凝 胶中的任意一种。
12、 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于， 步骤（d)所述洗脱 緩冲液为 pH2.0 ~ 4.0、 0.01 ~ 0.03 mol/L的 Gly-HCl緩冲液。
13、 一种药物组合物， 其特征在于， 含有权利要求 1 的抑血管生 成素， 并含有药学可接受的载体。
14、 一种注射剂， 其特征在于， 含有权利要求 1 的抑血管生成素 和药学可接受的赋形剂、 稳定剂。
15、 如权利要求 14所述的注射剂， 其特征在于， 每毫升所述注射 剂含有至少 lmg的抑血管生成素。
16、 如权利要求 14或 15任一项所述的注射剂， 其特征在于， 每 毫升所述注射剂包含抑血管生成素至少 lmg、 右旋糖酐 32~48mg、 海 藻糖 1.6~2.4mg。
Description:
抑血管生成素、 其纯化方法及包含其的药物组合物
本发明属于生物医药领域， 具体涉及一种血管生成抑制物， 更具 体地说， 本发明涉及一种抑血管生成素、 其纯化方法， 以及含有它们 的药物组合物。 背景技术
肿瘤血管生成（ang iogenes i s)是指血管内皮细胞从现存的血管系 统中分化、 迁移而形成新的微血管的复杂生物学过程。 成人的血管内 皮细胞基本处于静止状态， 在伤口愈合、 组织修复、.女性生育和月经 期、 胎儿发育等生理刺激下会生成新的血管， 这属于生理性血管生成。 此时的血管生成是处于刺激因子和抑制因子的严格控制和协调下， 在 有限时间内的一种有序的生理过程， 增生的内皮细胞很快恢复为正常 的静止状态。 当血管生成调节机制失控和血管生成过度时， 则成为致 病因素， 导致风湿性关节炎、 糖尿病性或黄斑变性视网膜病变、 婴儿 血管瘤和恶性肿瘤等血管生成依赖性疾病的发生和发展。早在 1971年， Folkman阐明了肿瘤血管生成在肿瘤发展、 转移和扩散中的重要意义， 并提出血管发生的抑制剂可能会成为一种新型的、 有价值的肿瘤治疗 手段。 目前， 破坏血管生成在癌症研究中占据重要的地位。 内源性和 外源性的肿瘤血管生成抑制物为这类疾病的治疗提供新的临床用药方 向。
蛇毒是从毒蛇的毒腺中分泌出来的一种毒液， 主要有蛋白质、 多 肽及一些酶类， 具有广泛的生物学活性。 目前， 蛇毒的许多組分已得 到了较为深入的研究， 并且它们在抗血栓、 止血、 镇痛及抗肿瘤方面 具有良好的作用。 自从 1965年开展蛇毒分离纯化工作以来， 已可以找 到具有专一性的抗肿瘤组分， 进入细胞及分子水平的研究， 其中许多 单一纯组分都被发现有不同程度的体内或体外抗癌活性。 持续的血管生成是肿瘤生长的特征。 血管生成不但是肿瘤生长所 必需的， 而且肿瘤细胞与新生血管系统的接触还是导致远处转移的原 因。 近年来， 对肿瘤的治疗主要依赖于新型药物的开发以及基因治疗 方面。 如题为 "血管生成抑制多肽及其制备方法和应用" 的中国专利 2QQ61Q( 929S. 2就公开了一种通过对内皮抑素的第 6-49氨基酸进行修 饰后得到的多肽， 其具有比内皮抑素更强的体内抗肿瘤活性及肿瘤靶 向性。 其中， 该发明所采用的大肠杆菌表达系统虽然表达量高， 但得 到的包涵体蛋白难溶解、 难复性， 易造成应用不便； 即使蛋白重新折 叠可溶， 此过程会损失大量蛋白， 导致利用率不高。 另外， 内皮抑素 在体内的半衰期较短， 且该血管生成抑制多肽其制备工艺复杂， 成本 相对较高， 不利于大规模生产。 因此， 对一些恶性程度高、 手术根治 率低、 且对放化疗不敏感的肿瘤， 积极寻求新的安全有效的抗肿瘤药 物显得非常重要。 发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本 发明的一个目的在于提供一种抑血管生成素， 其通过抑制肿瘤血管生 成以实现抗肿瘤的作用。
本发明的另一个目的在于提供用于纯化该抑血管生成素的方法。 本发明的再一个目的是提供用于抑制肿瘤血管生成以实现抗肿瘤 作用的药物组合物。
为实现上述发明目的， 本发明提供了一种抑血管生成素， 其氨基酸 序列选自 SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2 , 具有用非还原性 SDS-PAGE (非 还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳）法测定的 25000 ~ 35 t)D0道尔顿之间的分 子量， 具有抑血管生成活性。
根据本发明的抑血管生成素， 能有效抑制不需要的血管生成， 特别 是与肿瘤生长有关的血管生成， 在抗肿瘤及肿瘤转移中效果较为明显。
根据本发明的实施方式，所述抑血管生成素釆用还原性 SDS-PAGE(还 原性聚丙烯酰胺凝胶电泳）法测定显示为两条带， 分别称 CX链和 β链， 分 子量分别为 12000 ~ 22000道尔顿、 9000 ~ 19000道尔顿， 其中， α链的 氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示， β链的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2所示。
根据本发明的实施方式，所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代、 缺失、 或添加且具有抑血管生成活性的由其衍生的蛋白质。
本发明所述抑血管生成素可在抑制血管生成活性不受影响的条件 下对其氨基酸序列进行改进， 如将一个或几个氨基酸分别突变、 缺失 或添加一个或几个氨基酸不影响蛋白质的活性， 甚至一些氨基酸改变 可能使抑制血管生成的特性优化， 本领域的技术人员可以用标准做法 来实现。
根据本发明的实施方式，所述抑血管生成素经双向电泳后会分别产 生与所述 α链和 β链对应的异构体各三个。
在经双向电泳即等电聚集电泳和还原 SDS-PAGE电泳后， 所述抑血 管生成素可得到六个条带， 其中 o链和 β链对应各有三个条带。 六个 条带经质谱做鉴定后表明， 其分别为 α 、 β两个亚基的异构体形式， 即该蛋白在等电聚集条件下因其结构方面的特异性， 会产生异构体， 从而导致双向电泳时会出现六个条带， 不具备单一等电点。
根据本发明的实施方式， 所述抑血管生成素与杂交瘤细胞株 1D91D9 , 保藏号 CCTCC C201036 , 分泌的单克隆抗体特异性结合， 该杂 交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的主要抗性为与抑血管生成素特异性结 合。 该杂交瘤于 2010年 4月 14 日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武 汉大学的中国典型培养物保藏中心， 名称为杂交瘤细胞株 1D91D9 , 保 藏编号为 CCTCC C201036。
根据本发明的实施方式， 所述抑血管生成素其能够抑制肿瘤生长， 其中， 所述肿瘤选自人的黑色素瘤、 He la细胞以及 K562细胞。 国内外 文献报道的与抗肿瘤作用有关的蛇毒， 最多的是眼镜蛇和蝮蛇， 金环 蛇、 尖吻蝮蛇、 响尾蝮蛇蛇毒次之。 目前蛇毒的来源主要是采取捕蛇 或养蛇提取蛇毒方法进行， 但蛇毒种类不同、 产地不同、 甚至同种蛇 毒毒液收集时期不同其成分也有差异， 因此， 蛇毒的纯化工艺很难固 定。 尖吻蝮是蝰科蝮亚科尖吻蝮属中唯一的一种， 又名放丝蛇， 在我 国分布较广， 其中以武夷山山区和皖南山区贮量最多。 生活于山区或 丘陵林木茂盛的阴湿地方， 垂直分布范围海拔 100 - 1350米。 本发明 所使用的尖吻蝮蛇毒购自黄山市徽州毒蛇研究所。
为制得高纯度的抑血管生成素， 经过反复研究， 本发明采用现代 免疫学原理， 结合抗原抗体特异性反应与亲和层析技术， 从尖 蝮蛇 粗毒中进行分离纯化抑血管生成素。 该方法首先从尖吻蝮蛇粗毒中提 取得到抑血管生成素粗溶液， 再将所得粗溶液分别经阳离子交换层析 和凝胶层析， 制备得抑血管生成素的初纯物； 然后以该初纯物为抗原， 制备针对其的特异性单克隆抗体； 随后再与适宜的亲和层析载体偶联， 制备成抗体亲和层析柱； 最后使用偶联得到的抗体亲和层析柱， 即可 对具有抑制血管生成活性的的抑血管生成素粗溶液进行免疫亲和层 析， 制备得到高纯的抑血管生成素。
优选地， 本发明的抑血管生成素的纯化方法， 包括如下步骤： (a)将尖吻蝮蛇粗毒溶解于緩冲液中， 其中蛇毒与緩沖液的体积 比为 1~2 : 10, 离心得到上清液；
(b)将所得上清液经 DEAE (二乙胺乙基） 阴离子交换层析， 得到 抑血管生成素粗溶液；
(c)将杂交瘤细胞株 1D91D9, 保藏号 CCTCC C201036, 分泌的单 克隆抗体与亲和层析载体偶联， 制备得免疫亲和层析柱；
(d) 用所得免疫亲和层析柱纯化步骤 （b) 所得抑血管生成素粗 溶液， 以洗脱緩冲液洗脱， 收集得到所述抑血管生成素。
其中， 步骤 (a)所述緩冲液为 pH7.0~9.0的 0.01 ~ 0. lmol/L的 Tris-HCl緩沖液。所述尖吻蝮蛇粗毒离心 2次，离心速度为 4000r/min， 每次离心 15min。
步骤 (b) 用 pH 6.0~9.0的 0.01 - 0.05mol/L的 Tris-HCl緩冲 液和 0.05 ~ 0.6mol/L NaCl溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱。 步骤（c ) 所述亲和层析柱载体为 4B 琼脂糖凝胶、 二乙氨基葡聚 糖凝胶、 羧甲基葡聚糖凝胶中的任意一种。
步骤（d ) 所述洗脱緩沖液为的 pH2. 0 ~ 4. 0、 0. 01 0. 03 mol /L G ly-HCl缓冲液， 洗脱时间为 480min， 洗脱流速 5ml /mi.n。
本发明还提供一种用于抑制肿瘤血管生成以实现抗肿瘤作用的药 物组合物。 所述药物组合物含有抑血管生成素， 并含有药学可接受的 载体。 本发明还提供的注射剂， 含有抑血管生成素和药学上可接受的 赋形剂、 稳定剂。
根据本发明的实施方式， 每毫升所述注射剂含有至少 l mg 的抑血 管生成素原料， 然后经常规加工直接或间接地加入药学上可接受的赋 形剂、 稳定剂以制成注射剂。
根据本发明的实施方式， 每毫升所述注射剂包含抑血管生成素至 少 lmg、 右旋糖酐 32 - 48mg、 海藻糖 1. 6 ~ 2. 4mg。
本发明所述抑血管生成素具有以下几方面优点： 首先， 特异性强。 癌症治疗目前临床通常采用手术、 放疗、 化疗、 生物疗法及联合疗法， 可用于化疗的各种抗癌药物的共同特点是对所有快速分裂的细胞的增 殖起抑制作用， 但是缺乏对抗癌细胞增殖的特异性，在抗癌细胞增殖的 同时， 对骨髓胃肠及其他组织器官中快速分裂的细胞有很大的毒副作 用。 本发明所述抑血管生成素特异性强，.能通过抑制不需要的血管生 成， 特别是与肿瘤生长有关的血管生成， 从而有效抑制肿瘤的生长和 转移； 其次， 利用率高， 制备工艺相对简便。 相对于目前的关于血管 生成抑制物的制备， 本发明所述的抑血管生成素制备工艺较为简便， 能克服内源性血管生成抑制物的半衰期短的缺点， 以及EUR免了因重组 或转基因导致的转染率较低、 蛋白利用率低和费用昂贵等问题， 并且 重复性强， 成本低， 利于工业化生产； 另外， 蛇毒具有抗血栓、 止血、 镇痛以及其在抗肿瘤方 3/4 的作用， 已收到世界范围内的广泛关注。 我 国蛇毒资源丰富， 具有广阔的研究和应用前景。 附图说明
本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例 的描述中将变得明显和容易理解， 其中：
根据本发明所建立的杂交瘤细胞株已于 2010年 4月 14 日保藏于 湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心 ( CCTCC ) ， 保藏编号为 C201036 , 分类命名为杂交瘤细胞株 1D91D9。
图 1是根据本发明的抑血管生成素的制备工艺流程图；.
图 2 是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素制备工艺中阴离 子交换柱层析的紫外吸收 （ 280nm ) 图谱；
图 3 是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素制备工艺中阳离 子交换柱层析的紫外吸收（ 280nm ) 图谱；
图 4 是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素制备工艺中凝胶 S-100柱层析的紫外吸收 ( 280nm ) 图谘；
图 5 是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素制备工艺中亲和 层析柱层析紫外吸收（ 280nm ) 图谱；
图 6 是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素非还原性 SDS-PAGE电泳图谱；
图 7 是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素双向电泳图谱 ( 28-1、 28-2、 28-3、 28-4、 28-5分别代表五个条带斑点） ； .
图 8 是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素体外对鸡胚绒毛 尿囊膜模型中鸡胚血管生成抑制作用效果图；
图 9 是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素对抗转基因鼠结 肠癌体内药效试验中给药后 4周小鼠体重变化图；
图 10是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素对抗转基因鼠结 肠癌体内药效试验中抑血管生成素对肿瘤节的影响图；
图 11是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素对抗转基因鼠结 肠癌体内药效试验中抑血管生成素对不同大小肿瘤数目的影响图。 具体实施方式
本发明采用现代免疫学原理，结合抗原抗体特异性反应与亲和层析 技术， 从尖吻蝮蛇粗毒中进行分离纯化抑血管生成素。
图 1是根据本发明的抑血管生成素的制备工艺流程图。如图 1所示： 首先，.将尖吻蝮蛇粗毒溶于緩冲液一定时间后离心取上清， 得尖吻蝮 蛇毒溶液； 再将所得蛇毒溶液经阴离子交换层析得抑血管生成素的粗 溶液， 接着取适量粗溶液先后经阳离子交换层析和凝胶层析， 制备得 抑血管生成素的初纯品； 然后， 以该初纯品为抗原， 制备针对其的特 异性单克隆抗体； 随后， 再与适宜的亲和层析载体偶联， 制备成抗体 亲和层析柱； 最后， 使用偶联得到的抗体亲和层析柱， 对前面制备的 具有抑制血管生成活性的抑血管生成素粗溶液进行免疫亲和层析， 制 备得到高纯的抑血管生成素。
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局 限于这些实施例， 这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。 本领 域的技术人员在权利要求的范围内所作出的某些改变和调整也应认为 属于本发明的范围。
实施例 1 高纯度抑血管生成素的制备
1、 蛇毒粗毒的处理
首先， 准确称取购自黄山市徽州毒蛇研究所的尖吻蝮蛇蛇毒 5g, 用 0.02mol/L pH 8.0的 Tris-HCl緩冲液将其置于 4°C水箱内溶解， 溶 解时间 6~ 12h， 然后以 4000r/min 离心， 分别离心两次， 每次离心 15min, 收集上清液待用。
2、 初步純化得到用于制备单抗的抗原
( 1 ) 阴离子交换层析
首先，取所得上清液以流速 3. Oml/min上样于已平衡的阴离子交换 层析 DEAE柱中， 上样后先以 0.02mol/L pH 8.5的 Tris- HCl緩沖液洗 脱不能被层析介质吸附的杂蛋白，洗脱时间 360min,洗脱流速 3ml/ 然后，再以 0.02mol/L pH 6.5的 Tris-HCl緩沖液加入 0.5mol/L的 NaCl 进行梯度洗脱， 梯度 0~100%, 洗脱时间 1440min， 洗脱流速 5ml / 最后， 收集具有抑制血管生成活性的组分。 蛋白检测采用纯化系统 ( AKTA prime plus ) 自带紫外检测器在 280nm处检测， 其紫外吸收图 谱如图 2 所示， 收集以系统所带分部收集器收集， 收集设置为 4min/ 管， 即得抑血管生成素的粗溶液。
(2) 阳离子交换层析
首先，将所收集的抑血管生成素粗溶液用截留分子量为 1万的滤膜 进行超滤， 浓缩至体积为 30~80ml, 再转入已煮过的透析袋中， 置于 4°C冰箱内透析 6~ 12h。 然后， 将透析后所得样品以流速 3. Oml/min上 样于已平衡的阳离子交换层析 CM (羧曱基纤维素）柱中， 上样后先以 0.02mol/L pH6.5的 Tris- HCl緩沖液洗脱不能被层析介质吸附的杂蛋 白 ,洗脱时间 360min，洗脱流速 3ml/随后再以 0.02mol/L, pH8.5 的 Tris-HCl緩沖液加入 0.5mol/L的 NaCl进行梯度洗脱 (0-100%) ， 洗脱时间 1440min, 洗脱流速 5ml/min。 最后， 收集具有抑制血管生成 活性的组分。 蛋白检测采用纯化系统 AKTA prime plus 自带紫外检测 器在 280nm处检测， 其紫外吸收图谱如图 3所示， 收集以系统所带分 部收集器收集， 收集设置为 4min/管， 即得抑血管生成素的初品。
( 3 )凝胶层析
首先，将收集得到的抑血管生成素初品溶液用截留分子量为 1万的 滤膜进行超滤， 浓缩至体积为 30~80ml， 再以 millopore ultra系列 离心超滤管于 4 °C下进行低温离心超滤浓缩， 浓缩体积到 5~15ml。 然 后， 将浓缩后所得样品以流速 1. Oml/min 上样于已平衡的凝胶层析 S- 100柱中，并以 0.02mol/L pH7.6的 Tris-HCl緩沖液加入 0.15mol/L 的 NaCl进行洗脱， 洗脱时间 960min, 洗脱流速 0.3ml/min。 最后， 收 集具有抑制血管生成活性的组分。 检测方法同上， 蛋白检测采用纯化 系统 AKTA prime plus 自带紫外检测器在.28Gnm处检测， 其紫外吸收 图谱如图 4所示，收集以系统所带分部收集器收集，收集设置为 lOmin/ 管， 所得样品为抑血管生成素的初纯品。 3、 抑血管生成素特异性单抗的制备
( 1 )抗原鉴定： 先将所得抑血管生成素的初纯品进行 SDS- PAGE电 泳鉴定， 其纯度不低于 85%， 显示为一条主带， 且活性检测有抑制瑞斯 托霉素诱导的血小板聚集作用后， 方可用于制备单抗。
( 2 )抗原的动物免疫： 选用 6-12周龄 Ba lb/c小鼠免疫抗原， 分 为三次免疫。 第一次以每支小鼠 0. lmg (约 0. 2ml )加等量弗氏完全佐 剂注射小鼠腹腔免疫； 待 2-4 周后加强免疫， 量减半， 改用不完全佐 剂； 第三次冲击免疫在融合前 3天进行， 每只小鼠 0. 03mg， 融合成功 的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性 B 细胞， 并以 间接 ELISA法 （间接酶联免疫吸附测定法）检测血清中抗体效价。
( 3 ) 杂交瘤细胞株建立： 首先， 取免疫小鼠脾细胞悬液和骨髓瘤 细胞以 1 : 5 的比例在聚乙二醇作用下按常规法融合。 然后， 以间接 ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，筛选阳性克隆后，再进行亚克隆化， 并进行扩增冻存。 随后， 经过 3 次有限稀释克隆化， 将分泌特异性抗 体的杂交瘤细胞系大量扩增并冻存， 长期传代培养后，· 以相同的方法 再次克隆化筌定之。 建立的杂交瘤细胞株已于 2010年 4月 14 日保藏 于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心 ( CCTCC ) , 保藏编号为 C201036 , 分类命名为杂交瘤细胞株 1D91D9。
( 4 )单克隆抗体的制备与纯化： 将上述所得的杂交瘤细胞株以无 血清培养基在体外进行增量培养， 获得的培养液过以 Prote inA, 重组 金黄色葡萄球菌蛋白 A， 偶联的亲和层析柱， 亲和层析纯化以得到抗抑 血管生成素的特异性单克隆抗体。
4、 抑血管生成素特异性单克隆抗体亲和层析柱的制备
首先， 将上述纯化得到的抑血管生成素单克隆抗体以 0. lmo l /L 柠 檬酸钠緩冲液于 4 °C透析过夜， 再加 10ml CNBr-Sepharose 4B, 溴化 氰偶联的琼脂糖凝胶 4B, 到 10ml抗体溶液中， 将其置于摇床或振荡器 上， 于 4 °C下轻轻振摇过夜。 然后， 加入 lml 2mo l /L的乙醇胺溶液封 闭 CNBr-Sepharose 4B残余的活性基团， 并于 4 °C下继续振摇 1小时。 随后， 将偶联好抗体的 Sepharose 4B (琼脂糖凝胶 4B )柱装到适当的 层析柱中。 用 0. lmo l /L 的柠檬酸钠緩沖液洗柱， 接着用两倍柱体积 0. lmol /L、 pH6. 5、 含 lmo l /L的 NaCl柠檬酸钠緩沖液洗脱。 最后， 用 两倍柱体积的 PBS (磷酸緩沖液） 洗脱。 另外， 凝胶在使用和保存时， 须始终保持在液面以下， 不得干燥。
5、 制备高纯度的抑血管生成素
首先， 将步骤 2 ( 1 ) 中经阴离子交换层析得到的抑血管生成素的 粗溶液超滤浓缩后用亲和层析平衡緩沖液， 具体为 0. 02mol /L 的 Tr i s-HCl緩冲液， pH7. 8、 含 0. 25mo l /L的 NaCl透析。 然后， 上抗体 亲和层析柱， 并用上述亲和层析平衡緩冲液平衡至洗脱液洗脱曲线在 紫外检测上显示为基线后。 最后， 用 pH4. 0、 0. 02mo l /ml 的 G ly- HC1 緩冲液， 甘氨酸-盐酸緩冲液， 作为亲和层析洗脱液进行洗脱， 收集活 性峰。 检测方法同上， 蛋白检测采用纯化系统 AKTA pr ime p lus 自带 紫外检测器在 280mn处检测， 其紫外吸收图谱如图 5所示， 收集以系 统所带分部收集器收集， 收集设置为
1/2 in/管， 所得样品即为高纯度的 抑血管生成素。 将上述制备方法重复 10次， 编号 1-10组。
实施例 2 本发明所述抑血管生成素的质量研究
1、 纯度及结构鉴定
纯度鉴定：随机抽取一组实施例 1中所得高纯度的抑血管生成素第 3组样品进行非还原性 SDS-PAGE电泳 （聚丙烯酰胺凝胶电泳） ， 如图 6所示， 显示为一条带， 分子量为 道尔顿。
结构鉴定： 将上述抽取的第 3组样品进行经双向电泳即等电聚集电 泳和还原 SDS-PAGE电泳， 如图 7所示， 所述抑血管生成素经双向电泳 后可得到六个条带， 其中 α链和 β链对应各有三个条带。 六个条带经 质谱做 ID鉴定后表明， 其分别为两个亚基的异构体形式， 即该蛋白在 等电聚集条件下因其结构方面的特异性， 会产生异构体， 从而导致双 向电泳时会出现六个条带， 不具备单一等电点。
2、 神经毒、 出血毒、 内毒素检测 ( 1 )抑血管生成素出血毒检验标准： 先随机选取实施例 1所得三 组（第 1组、 第 4组、 第 9组） 高纯度的抑血管生成素适量， 分别用 氯化钠注射液制成每 lml 中含 20单位的溶液； 再选取体重为 18 ~ 22g 的小白鼠 15只， 每组样品 5只 , 于背部皮下注射 0. 2ml所制溶液； 随 后， 在注射 24小时后处死动物， 剥皮观察， 小鼠背部未见出血现象。
经检测， 所测的高纯度的抑血管生成素样品均符合规定。
( 2 )抑血管生成素神经毒检验标准： 再取上述第 1组、 第 4组、 第 9组中高纯度的抑血管生成素适量， 用氯化钠注射液制成每毫升.中 含有 20单位溶液；再选取取体重 300 ~ 500g鸽子 9只，每组样品 3只； 所用剂量按每公斤注射 0. 5ml， 静脉给药， 观察 24小时， 动物不得出 现抽搐、 死亡。 如每组样品中， 3只中有一只出现抽搐或死亡， 应另取 5只复试， 均未出现死亡。
经检测， 所测的高纯度的抑血管生成素样品均符合规定。
( 3 )抑血管生成素内毒素检测标准： 再取上述第 1组、 第 4组、 第 9组中高纯度的抑血管生成素适量， 依中国药典 2005年版二部附录 XIE检查。
经检测， 每单位样品中内毒素含量不高于 20EU。
实施例 3 高纯度抑血管生成素原料药含量检测方法
为检测血清中抑血管生成素含量， 以便用于药代动力学试验， 建立 了一套采用双抗体夹心法检测抑血管生成素原料药含量的方法， 该方 法检测灵敏度能够达到 lng/ml。
具体检测方法如下：
1、 包被一个单抗： 先用 0. 05mo l /L pH9. 6的碳酸盐緩沖液将实施 例 1 中所制备的单抗作适当稀释， 在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中 加 0. 1ml , 于 4 °C过夜或保持 18-24h。 次日， 弃去孔内溶液， 用洗涤緩 冲液洗 3次， 每次 3min (简称洗涤， 下同）。
2、 加样： 加入待检样品或作适当稀释的标准参考品于反应孔中， 同时作空白孔、 阴性和阳性孔对照。 于 37 °C孵育 1小时， 洗涤。 3、 加 HRP标记， 即辣根过氧化物酶标记， 的另一个单抗： 将已作 适当稀释的 HRP 标 i己的另一个自行制备的抑血管生成素单抗， 加于酶 标板中， 每孔 0. 1ml， 于 37 °C孵育 30 ~ 60min, 洗涤。
4、 底物显色： 于上述各反应孔中加入临时配制 0PD (邻苯二胺） 底物反应溶液 0. 1ml , 于 37 °C下反应 10 ~ 30min, 再加 2mol /L 0. 05ml 的 H2S04以终止反应。
6、 结果判定： 上述酶标板置于酶标仪上于 450mn处测 0D值。 根据 相应已知浓度对照品的 0D值与浓度关系， 绘制标准曲线。 再由待测样 品所测 0D值， 代入标准曲线中， 求得相应样品中抑血管生成素浓度。 本方法检测灵敏度能够达到 lng/ml。
实施例 4 注射用抑血管生成素制备方法
1000 ± 20mg
1 ± 0. 2g
按照 0. 5ml /支分装， 共分装 1000支。
首先，在局部百级洁净区内，按照配方将本发明实施例 1所制备并 经各项检测合格的抑血管生成素作为原料药， 与右旋糖酐等辅料准确 称量在配液容器内， 加注射用水充分溶解或稀释， 使右旋糖苷浓度为 1 % , 搅拌混匀后， 得到制剂中间体。 然后， 除菌过滤， 其中过滤前后 应对除菌过滤系统进行完整性测试。 随后， 将过滤后的中间体按装量 装入西林瓶中， 再分装过程中应进行至少 4 次装量检查， 保证每一只 瓶内装入的药量准确。 最后， 将装入药品的西林瓶冻干， 再抽真空， 在真空状态下缓慢升温至 35 ~ 40°C， 保持一定时间后再降至室温并取 出， 压塞、 轧盖得成品。
成品经检验， 符合注射用抑血管生成素盾量标准后， 入库存放。 实施例 5 注射用抑血管生成素的药效学评价
将实施例 4制备的射用抑血管生成素用于下列试验。
1、 鸡胚绒毛尿嚢膜模型体外评价
以鸡胚绒毛尿嚢膜为模型， 将阳性对照药物 VEGF (血管内皮生长 因子） 和相应给药剂量混合到一起作为实验组， 进过三次试验， 结果 表明如图 8所示： （ 1 ) VEGF和药物混合后给药剂量与对鸡胚血管抑制 效果呈现剂量关系， 随着给药剂量增加， 抑制效果越明显， 1 0ng 药物 对血管生长没有明显抑制， 25ng有一定抑制效果， 50和 l O Ong抑制效 果较明显， 而大剂量方面， 500ng剂量依然没有杀死鸡胚， 因此致死剂 量摸索依然需要进一步增加用药量。 （ 2 )将药物和其单抗（过量） 充 分结合后给药的情况下 ·， 药物对鸡胚血管生长基本没有抑制， 和阳性 对照组血管生长一样旺盛， 说明是由于药物作用而抑制血管生长。 同 时， 将药物和其单抗（过量） 充分结合后给药的情况下， 药物对鸡胚 血管生长基本没有抑制， 和阳性对照组血管生长一样旺盛。
2、 细胞学试验 '
在体外进行了药物对 HUEVCs (人脐带静脉内皮细胞）进行增殖、 分化、 迁移、 粘附等的影响试验， 结果表明： 5 y mo l /L 的样品对 FBS (胎牛血清）和 VEGF诱导的细胞增殖均没有明显抑制效果， 但对 VEGF 和 FBS诱激产生的管状网络结构有一定阻止作用； 细胞趋化性试验表 明， 抑血管生成素对 FBS、 FGF (成纤维细胞生长因子）和 VEGF诱导的 细胞迁移运动有明显抑制作用， 且在高剂量条件下， 迁移细胞恢复到 基线水平。 抑血管生成素对生长因子诱导的通过基质胶表面的 HUEVCs 细胞侵入运动明显减少， 且这种减少与给药剂量间有剂量依赖性关系。 为判定抑血管生成素是否是整连蛋白受体抑制剂， 设计了 HUEVCs细胞 的粘附试验， 以现有已知的整连蛋白抑制剂作为对照组， 结果表明， 样品对整合素 avb 3/avb5介导的粘附作用没有明显影响。
以上两次细胞学试验结果表明，抑血管生成素对内皮细胞分化、 迁 移和侵入有直接和明显抑制作用， 但是对内皮细胞的增殖和粘附没有 明显影响。 这说明抑血管生成素机理与生长因子（VEGF和 FGF2 )或者 络氨酸蛋白酶受体相关信号途径没有明显关系。
3、 MTT ( 3- (4 , 5-二曱基噻唑 _2)- 2, 5-二苯基四氮唑溴盐； 商品 名：噻唑蓝）法检测蛋白对黑色素瘤、 Hela细胞以及 K562的抑制作用。
血管生成素对黑色素瘤、 Hela细胞以及 K562细胞的体外抑制作 用的试-验结果表明： 相对 avastin (阿瓦斯丁， 又名 bevacizumab, 人 类血管内皮生长因子 VEGF单克隆抗体）和顺铂， 抑血管生成素对黑色 素瘤 A375细胞有明显抑制作用， 对 Hela细胞也有明显抑制效果， 对 K562细胞抑制效果不是很明显。
4、 抗转基因鼠结肠癌体内药效试验
对转基因鼠植入结肠癌，从植入瘤细胞后第 13周开始，到第 17周， 通过观察结肠节评价药物对肿瘤细胞抑制效果。 给药方式为腹膜内注 射， 每周 2次， 共 4周。 试验设计对照组（生理盐水， 3只鼠） 、 试验 组 1 (低剂量组， 10 yg, 3 只鼠） 、 试验组 1 (高剂量组， 45yg， 3 只鼠） ， 结果检查方法 ^显微镜检查法， 检测和测定主要参数包括： 鼠体重变化、 肿瘤结节数目、 有效实体瘤大小。
试验结果表明： （ 1 )如图 9所示， 鼠体重在对照组和试验组之间 没有明显区别， 说明测试药物低剂量和高剂量对小鼠的毒性均很小。 ( 2 )如图 10 所示， 试验组两个剂量均能显著、 有效抑制总肿瘤结节 数， 低剂量组抑制率 16.22%, 高剂量抑制率 28.64%。 （ 3)如图 11所 示， 试验组两个剂量组均能显著、 有效抑制 l_2mm 大小的实体瘤。 上 述结果表明， 药物在转基因鼠植入结肠癌模型中可以有效抑制结肠癌 生长。
实施例 6 注射用抑血管生成素急性毒性评价
通过观察抑血管生成素单次静脉注射给予昆明小鼠后的急性毒性 反应， 初步估计最大耐受量或半数致死剂量 （LD5。） 。
试验用昆明小鼠 8只， 设 4个剂量组， 每组 2只， 雌雄各半。 静脉 注射给药， 给药容量为 0.25mL/10g, 给药剂量为 14.5、 10.88、 8.16、 6. 12 mg/kg体重， 药后连续观察 4天。
结果显示，注射用抑血管生成素单次静脉注射给予小鼠后所有动物 均精神状态良好， 活动正常。 试验期间未出现动物死亡， 大体解剖观 察各组织脏器未见异常。
在本试验条件下，注射用抑血管生成素单次静脉注射给予昆明小鼠 的最大耐受量 （MTD ) 大于等于 14. 5mg/kg体重
上述对注射用抑血管生成素的药效学评价表明： VEGF 和药物混合 后给药剂量与对鸡胚血管抑制效果呈现剂量关系， 随着给药剂量增加， 抑制效果越明显； 并且注射用抑血管生成素对内皮细胞分化、 迁移和 侵入均有有直接和明显抑制作用， 同时对内皮细胞的增殖和粘附没有 明显影响。另外，注射用抑血管生成素对黑色素瘤、 He l a细胞以及 K562 均有不同程度的抑制作用， 且在转基因鼠植入结肠癌模型试验中能有 效抑制结肠癌生长。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领 域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明 的原理， 属于本发明的保护范围之内。
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