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瓷珠菌种保存法
时间： 16:05:00 来源：食品伙伴网
传统的菌种保存方式简介
斜面保存法：微生物保存最基本的方法，可广泛用于细菌、真菌等，保存期限非常短，斜面容易干裂。
液体石蜡保存法：可用于保存霉菌、酵母菌、放线菌及需氧菌，方法简便，可防止斜面干燥和氧气进入，但一些固氮菌、分枝杆菌、毛霉、厌氧菌等不适宜用此法。
甘油冷冻保存法：用于一般细菌的保存，需使甘油终浓度为20%左右，然后-20℃或-70℃以下保存。融化时需要水浴溶化。
真空冷冻保存法：具有低温、干燥、无氧的保存条件，适用于98%以上菌种的保存，但操作复杂，一般实验室难以使用。
液氮保存法：基本所有微生物均可保存，并且保存时间长，但操作较为复杂而且需要设备，不适用于一般实验室保存菌种。
沙土保存法
半固体保存法
瓷珠菌种保存法的原理
瓷珠菌种保存管是实验室保存菌种的容器，管内有表面凹孔小瓷珠用于细菌的吸附和保存，放置于-20℃或-80℃下便可创造干燥、低温、缺营养的环境，使菌株处于“休眠” 状态，方可长期保存（视不同菌种与保存温度，一般可保存3-10 年）, 同时菌种保存管的取用和保存较为便利（取用复苏及保存菌种仅需1分钟）。
瓷珠菌种保存管的优点
用途：菌种保存、复苏和运输。
优点：操作简单方便、菌种保存快速、包装物体积小、菌种保存时间长。
操作简单方便：挑取细菌新鲜纯培养物，接入菌种保存管。
菌种保存快速：混匀后，吸出冷冻保存液。
包装物体积小：1.8ml冷冻管。
菌种保存时间长：2-8℃可保存6个月；-20℃可保存12个月；-80℃可保存24个月。
瓷珠菌种保存管的使用方法
菌种保存流程
1.从培养18h以上的平板上刮去新鲜纯培养物于菌种保存管中，配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液。
2.拧紧保存管，来回颠倒几次使细菌乳化，不能旋摇。
3.用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净，妥善放置被吸出的液体。
4.拧紧保存管，迅速将其置于-20℃或-70℃冰箱中。
使用时的注意事项
被保存的菌种要求是经过纯化后培养 18-24h 内的新鲜菌种（细菌18-24h，酵母菌需3 天，形成孢子的微生物保存孢子，而放线菌和丝状真菌需培养7 天后保存），不宜使用老化或未经鉴定的菌种。
菌种保存浓度必须要做3-4 麦氏比浊度，如接种浓度过低将会降低复苏效果。
待保存于菌种保存管中的菌种完全乳化均匀吸附在多孔小瓷珠后，要将多余的菌种保存液吸取出来并弃之，否则在复苏时的冻融过程中会损伤菌株活性。
做厌氧菌保存时，应提供厌氧的环境，如厌氧箱、厌氧袋，菌种保存管中可通入氮气来驱除保存菌种时所引入的氧气。菌种复苏时，也要创造厌氧的环境。
菌种复苏完成后，对使用菌株需要进行再次纯化，以保证菌株的单一性。
常见问题答疑
1、菌种保存管能保存霉菌及酵母菌吗？
答：可以。对于霉菌等真菌需培养7 天进行保存，而酵母菌需培养三天将孢子洗脱下来进行保存，保存管中的小瓷珠可以作为介质来吸附孢子和菌丝，相当于砂土保存法中砂土作为载体起到的作用。
2、所有的菌都能保存吗？如果不是的话，什么样的菌可以保存？什么样的菌不可以保存？
答：可以。菌种保存的原理是预防或减缓DNA 复制时自发突变导致菌种退化，因此要创造代谢不活泼的状态，而菌种保存时使菌种进入休眠态（孢子、芽孢)，并创造干燥、低温、缺氧、缺营养的环境，创造的环境越接近此状态，所保存的菌种的时间就越长，所以从原理上讲，所有菌种都可用这种方法保存， 但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血杆菌、脑膜炎萘瑟氏菌）等特殊细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。
3、能用菌种保存管永久保存菌株吗？
答：温度越低，保藏效果越好。从目前的试验数据及实际保存效果来看，-20℃可保存1-5 年，-80℃或液氮中可保存5-10 年，不同菌种及不同的保存温度保存时间会有所不同（例如：大肠、沙门等常规细菌-20℃我们目前可以保存到6年）。但需要注意的是所保存的菌种需每年抽检进行生化特征的鉴定，确定菌株无变异。
4、菌种保藏时为什么要进行分离纯化？
答：分离纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则。
5、菌种保存管对于平板来说，对挑选菌落个数有要求吗？还是将整个平板的菌落全部刮入管中？
答：对于要保存的细菌一般是要进行2-3 次的纯化，要保证一个平板上的菌是由单一菌落传代而来的，所以在细菌保存的过程中，为了保证制备的菌悬液可以达到3-4MCF，是可以将整个平板的的细菌全部刮到管中的，如果平板长的比较满一般半个平板就够用，具体用量也根据菌种的不同有所差异，如霉菌、酵母菌在保存时，不适合用浊度法。
6、对于液体培养基培养的纯菌，是否也可以用咱们的菌种保存管？如果可以的话，怎么操作？
答：是可以用的，如果液体培养基能保证是纯菌的话，可以直接离心，弃掉上清，然后把保存管中液体吸进去充分混匀，然后再转移到菌种保存管中，整个过程要注意无菌操作。不过，一般菌种保存管最好选择平板菌落进行保存，因为液体培养基中有杂菌是不易观察出来的。
7、为什么在菌种保存时，要上下颠倒？为什么不能旋摇？
答：上下颠倒，可使菌悬液充分混匀，菌株充分、均匀地吸附到小瓷珠上，旋摇不利于菌悬液充分混匀,反而会使菌株全部沉淀于管底。
8、为什么在使用时要将管内的液体尽可能多的吸出？
答：吸出液体可避免反复冻融形成的冰晶对菌株的损伤，加快复苏的过程，因此，要尽可能的将与菌种混匀后的保存液吸净。而常用的甘油法，在复苏的过程中需用水浴锅快速溶解，在此过程中，对菌株伤害较大。
9、在使用后，菌种保存管的保存环境？需要-80℃冰箱吗？
答：本公司菌种保存管采用的是低温冷冻保存法，因此，使用后，需放置低温环境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且温度越低，保存效果越好。用户需根据菌种的保存要求选择具体保存温度。
10、为什么说，如果有条件的话，菌种保存管最好置于-80 冰箱或液氮中？
答：因为，贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，可极大降低冰晶形成对细菌的伤害，同时可为被保存的菌种创造更低的代谢环境，从而延长细菌保存的时间。
11、为什么在取用菌株时，操作过程要求快速？
答：菌种保存复苏的原则，要求慢冻快融，之所以要求快速，是因为在菌种复苏的过程中, 长时间的溶解过程会对所保存的菌种造成损伤，而我们经过改良的保存方法最大程度的避免复苏所造成的影响，但我们还是建议遵循菌种的保存复苏原则，保证所复苏菌种的复苏率。
12、将菌株反复冻存，到底对菌株有什么影响？
答：低温会使菌株细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。细胞体积大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。如果放到低温（不是一般冰箱）进行冷冻时，会产生冰晶，冰晶呈针状，极易导致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔，当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会变大，故反复冻存，会对菌株造成极大损伤。
13、为什么有时候菌种的保存效果不佳？
答：1、可能是由于保存后未将保存液吸尽，反复冻融形成冰晶损伤菌株细胞，影响了菌株活性。
2、确定所保存的菌种是否为对数生长期的菌种，我们建议普通菌种保存为18小时内的新鲜菌种，而霉菌需要待孢子出现后保存其孢子。
14、该产品能否用于菌种的运送，如果可以在什么条件下运送？
答：就目前试验数据而言，我们建议可主要用于普通细菌的短期运送，对于厌氧菌在运送时最好让其处于厌氧环境下，2-8℃运送不超过5 天。另外需要说明的是如弧菌属和绿脓杆菌需要常温运送，其对2-8℃温度极其敏感。
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来源：北纳生物
摘要：分离纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则
1、保存管能保存及吗？
答：可以。对于霉菌等需培养7 天进行保存，而酵母菌需培养三天将孢子洗脱下来进行保存，保存管中的小瓷珠可以作为介质来吸附和，相当于砂土保存法中砂土作为载体起到的作用。
2、所有的菌都能保存吗？如果不是的话，什么样的菌可以保存？什么样的菌不可以保存？
答：可以。菌种保存的原理是预防或减缓DNA 复制时自发突变导致菌种退化，因此要创造代谢不活泼的状态，而菌种保存时使菌种进入休眠态（孢子、芽孢)，并创造干燥、低温、缺氧、缺营养的环境，创造的环境越接近此状态，所保存的菌种的时间就越长，所以从原理上讲，所有菌种都可用这种方法保存， 但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血杆菌、脑膜炎萘瑟氏菌）等特殊细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。
3、能用菌种保存管永久保存吗？
答：温度越低，保藏效果越好。从目前的试验数据及实际保存效果来看，-20℃可保存1-5 年，-80℃或液氮中可保存5-10 年，不同菌种及不同的保存温度保存时间会有所不同（例如：大肠、沙门等常规细菌-20℃我们目前可以保存到6年）。但需要注意的是所保存的菌种需每年抽检进行生化特征的鉴定，确定菌株无变异。
4、菌种保藏时为什么要进行分离纯化？
答：分离纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则。
5、菌种保存管对于平板来说，对挑选菌落个数有要求吗？还是将整个平板的菌落全部刮入管中？
答：对于要保存的细菌一般是要进行2-3 次的纯化，要保证一个平板上的菌是由单一菌落传代而来的，所以在细菌保存的过程中，为了保证制备的菌悬液可以达到3-4MCF，是可以将整个平板的的细菌全部刮到管中的，如果平板长的比较满一般半个平板就够用，具体用量也根据菌种的不同有所差异，如霉菌、酵母菌在保存时，不适合用浊度法。
6、对于液体培养基培养的纯菌，是否也可以用咱们的菌种保存管？如果可以的话，怎么操作？
答：是可以用的，如果液体培养基能保证是纯菌的话，可以直接离心，弃掉上清，然后把保存管中液体吸进去充分混匀，然后再转移到菌种保存管中，整个过程要注意无菌操作。不过，一般菌种保存管最好选择平板菌落进行保存，因为液体培养基中有杂菌是不易观察出来的。
7、为什么在菌种保存时，要上下颠倒？为什么不能旋摇？
答：上下颠倒，可使菌悬液充分混匀，菌株充分、均匀地吸附到小瓷珠上，旋摇不利于菌悬液充分混匀,反而会使菌株全部沉淀于管底。
8、为什么在使用时要将管内的液体尽可能多的吸出？
答：吸出液体可避免反复冻融形成的冰晶对菌株的损伤，加快复苏的过程，因此，要尽可能的将与菌种混匀后的保存液吸净。而常用的甘油法，在复苏的过程中需用水浴锅快速溶解，在此过程中，对菌株伤害较大。
9、在使用后，菌种保存管的保存环境？需要-80℃冰箱吗？
答：本公司菌种保存管采用的是低温冷冻保存法，因此，使用后，需放置低温环境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且温度越低，保存效果越好。用户需根据菌种的保存要求选择具体保存温度。
10、为什么说，如果有条件的话，菌种保存管最好置于-80 冰箱或液氮中？
答：因为，贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，可极大降低冰晶形成对细菌的伤害，同时可为被保存的菌种创造更低的代谢环境，从而延长细菌保存的时间。
11、为什么在取用菌株时，操作过程要求快速？
答：菌种保存复苏的原则，要求慢冻快融，之所以要求快速，是因为在菌种复苏的过程中, 长时间的溶解过程会对所保存的菌种造成损伤，而我们经过改良的保存方法最大程度的避免复苏所造成的影响，但我们还是建议遵循菌种的保存复苏原则，保证所复苏菌种的复苏率。
12、将菌株反复冻存，到底对菌株有什么影响？
答：低温会使菌株细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。细胞体积大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。如果放到低温（不是一般冰箱）进行冷冻时，会产生冰晶，冰晶呈针状，极易导致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔，当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会变大，故反复冻存，会对菌株造成极大损伤。
13、为什么有时候菌种的保存效果不佳？
答：1、可能是由于保存后未将保存液吸尽，反复冻融形成冰晶损伤菌株细胞，影响了菌株活性。
2、确定所保存的菌种是否为对数生长期的菌种，我们建议普通菌种保存为18小时内的新鲜菌种，而霉菌需要待孢子出现后保存其孢子。
14、该产品能否用于菌种的运送，如果可以在什么条件下运送？
答：就目前试验数据而言，我们建议可主要用于普通细菌的短期运送，对于厌氧菌在运送时最好让其处于厌氧环境下，2-8℃运送不超过5 天。另外需要说明的是如弧菌属和绿脓杆菌需要常温运送，其对2-8℃温度极其敏感。
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标题: 请问划线的平板保藏问题(离心管,菌种,单菌落,划线平板)
摘要: [请问划线的平板保藏问题(离心管,菌种,单菌落,划线平板)] 我的平板划线后37℃经过12小时后挑了单菌落，但是当时忘了把平板保存起来了，现在过了两天了，请问有什么影响吗？我是最好再重新划线再保存吗？另外我接菌种的离心管（甘油：菌液＝1：1）用0 4mlLB（LB加入了Amp）悬浮后划线，然后离心管放入－20℃冰箱保存，请问还能用来划线吗？划线平板一般是怎么保存的啊？ 关键词:[离心管 单菌落 菌种 划线平板 菌液 甘油]……
我的平板划线后37℃经过12小时后挑了单菌落，但是当时忘了把平板保存起来了，现在过了两天了，请问有什么影响吗？我是最好再重新划线再保存吗？另外我接菌种的（甘油：菌液＝1：1）用0.4mlLB（LB加入了Amp）悬浮后划线，然后放入－20℃冰箱保存，请问还能用来划线吗？划线平板一般是怎么保存的啊？
回复接种过的平板一般不用来做的保存，要保存的话需要用斜面保存，置4度冰箱中即可，这样一般一个月也需重新传代一次。你说的第二种情况一般可以做长期保存。但不能反复冻融。回复划线平板放在4℃冰箱中保存即可，具体能保藏多长时间还要依不同的菌而定！你说的过了两天， 能不能继续用要看你的试验要求，过了两天的菌的活力肯定不如刚长好的！最好是用新鲜的！划线后的重新放－20℃保存，当然还可以划线，只要里面有活菌就能长出菌落的！回复谢谢，我的菌一般用来提质粒，是(Escherichia coli)DH5α，过了两天应该没事吧？
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实验四 微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏(张理珉)
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微生物学实验
内容提要 《微生物学实验》是配合武汉大学、复旦大学编的《微生物学》一书的实验教材。第二 版做了较大修改，增添了许多新技术和方法，实验由原来的 40 个增至 63 个，并按类规纳成 15 个部分。每一部分冠以综合性说明，简单介绍该部分内容及其在微生物学工作中的作用。 第二版仍着重微生物学实验的基本操作和技能训练。 为方便教学， 每一实验基本上仍按 照目的要求、基本原理、器材、操作步骤及实验报告（包括实验结果和思考题）五部分。书 后附有染色液、培养基、试剂和溶液的配制方法、本书使用的菌种名称，微生物学中常用的 计量单位及主要参考书目。 第二版实验内容较多，各校可根据具体条件酌情选做。 第一版前言 《微生物学实验》 一书是根据 1977 年 10 月成都综合性大学生物类教材会议制定的大纲 编写的。在编写过程中，为配合武汉大学、复旦大学编的《微生物学》教材，在内容上有所 增加和修改。 本书共有实验 40 个，内容较多，其中包括与《微生物学》相配合、印证理论以及进行 微生物实验所需的基本操作和技能的训练两大部分。各校可根据具体条件酌情选做。 本书为方便教学，每一实验基本上都按目的要求、基本原理、器材、操作步骤及结果与 思考题等五个部分来编写的， 各实验所用染料、 培养基、 溶液与悬液等的配制均列在附录内。 由于编者水平所限，在取材、实验方法和编排等方面肯定有不少缺点与错误，希望读者 批评指正。 在编写过程中承武汉大学生物系微生物教研室基础微生物学教学小组的大力支持， 武汉 大学生物系陈宝联同志绘制插图，在此一并表示感谢。 范秀容 沈萍 第二版前言 《微生物学实验》第一版自 1980 年出版以来已有七八年了，在此期间，经过多次印刷， 印数已达十余万册。 它在微生物学的教学和稳定教学秩序方面起了积极的作用， 但是也存在 不少缺点，加上近年来微生物学技术发展迅速，因此我们进行了出版第二版的修订工作。 修订内容和特点如下： 1．将繁多的实验按类归纳成 15 个部分，以求条理清楚，概念分明。每一部分冠以综合 性说明，主要简单介绍该部分的内容，阐述其在整个微生物学工作中的作用等。再在每一部 分选择有代表性的重点，列出实验，进行操作。 2．继续着重微生物学实验的基本操作和技能的训练。 3．实验内容做如下调整： (1)为了加强学生对微生物及其应用和无菌概念重要性的认识，以及对实验工具的质量 要求和洗涤方法的了解， 增加了 “微生物学实验室常用的器皿” “环境中的微生物” “食 、 和 品微生物学”等部分。 (2)使一些领域的内容更加全面，例如在“显微镜的结构、性能和使用方法”部分增加 了相差显微镜和电子显微镜； “微生物的纯培养”部分增加了厌氧培养；微生物的遗传方面 增加了药物抗性菌的分离和细菌的接合作用等实验。 (3)适当增加新技术的介绍，例如生化反应中的微量简易诊检系统；菌种保藏中的液氮 冷冻保藏法；水的微生物学检查中增加了滤膜法等。 (4)此外，在基本操作训练方面集中介绍了动物的几种不同途径的注射方法。 (5)由于“环境中的微生物”包括了空气中微生物的检查，故没有再单独设实验，此外 还删去了“巴斯德效应”实验。 第二版的实验内容较多， 有些内容由于实验条件和学时的限制， 可作为学生日后进一步 工作的参考。因此各校可根据具体条件酌情选做。 4．第二版将实验报告分为实验结果与思考题两部分。实验结果尽量采用绘图和表格形 式，并要求在表格内用简单符号和数字填写，以使作业规范化，便于学生记录与教师批改。 5．增加了部分插图。第二版主要由范秀容、李广武、沈萍同志编写，彭珍荣同志参加编写了部分实验。 插图除沿用第一版由陈宝联同志绘制的以外， 其余大部分插图由熊定荣同志绘制， 个别 插图由刘启融同志绘制，在此一并致谢。 由于编者的水平有限， 本版的缺点和错误在所难免， 尚请各位同仁和读者提出宝贵意见。 编者 1988．6． 实验须知 普通微生物学实验课的目的是： 训练学生掌握微生物学最基本的操作技能； 了解微生物 学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、 思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公 物的良好作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到 心中有数，思路清楚。 2．认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下 每次观察的现象和结果，以便分析。 3．实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4．实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打 破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐 瞒。 5．实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉 火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。 6．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要 力求节约，用毕后仍放回原处。 7．每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有 菌液污染桌面或其他地方时，可用 3％来苏尔液或 5％石炭酸液覆盖其上半小时后擦去，如 系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须浸泡 在 3％来苏尔液中进行消毒。 8．每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点 进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连 同思考题及时汇交教师批阅。 10．离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。 Ⅰ、微生物学实验室常用的器皿 微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其 质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高 温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器 皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。 本节将对这几方面作详细介绍。 一、器皿的种类、要求与应用 1．试管（test tube） 微生物学实验室所用玻璃试管， 其管壁必须比化学实验室用的厚些， 这样在塞棉花塞时， 管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管 口的缝隙间进入试管（图Ⅰ-1，B）而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制 的试管帽（图Ⅰ-1，C），若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试 管内的水分，则需使用螺口试管（图Ⅰ-1，D），盖以螺口胶木或塑料帽。 试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号。（1）大试管（约 18×180mm）可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需 要大量菌体时用）。 （2）中试管（约 13―15×100―150mm）盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒 等的稀释和血清学试验。 （3）小试管（10―12×100mm）一般用于糖发酵试验或血清学试验，和其他需要节省材 料的试验 2．德汉氏试管（Durham tube） 观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约 6 ×36mm）（图 I-2），此小套管即为德汉氏试管，又称发酵小套管。 3．吸管（又称移液管，pipette） （1）玻璃吸管（glass pipette）微生物学实验室一般要准备 1、5、10ml 的刻度玻璃 吸管（图 I-3，A）。与化学实验室所用的不同，其刻度指示的容量往往包括管尖的液体体 积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有时称为“吹出”吸管。市售细菌学用吸管，有 的在吸管上端刻有“吹”字。 除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图Ⅰ-3，B），来吸取动 物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。 （2）活塞吸管（piston pipette）主要用来吸取微量液体，故又称微量吸液器或微量 加样器。其外形和结构如图Ⅰ-4，除塑料外壳外，主要部件有按钮、弹簧、活塞和可装卸的 吸嘴。按动按钮，通过弹簧使活塞上下活动，从而吸进和放出液体。其特点是容量固定，使 用时不用观察刻度，操作方便、迅速。国内产品一般每个活塞吸管固定一种容量，分别有 5、 10、20、25、50、100、200、500、1000μ l 等不同容量。而精制的活塞吸管每个在一定的 范围内可调节几个容积，例如在 5―25μ l 的范围内，可调节 5、10、15、20、25μ l 五个不 同的量，使用时按需要调节，但当调节固定后，每吸一次，容量仍是固定的。用毕只需调换 吸嘴或将吸嘴洗净，消毒后再行使用。 活塞吸管是国外 70 年代后半期才开始生产与应用的，近年来国内亦日益广泛应用于免 疫学和使用同位素等的科学实验中。 4．培养皿（petridish） 常用的培养皿（图Ⅰ-5），皿底直径 90mm，高 15mm。培养皿一般均为玻璃皿盖，但有 特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养基表面干燥，例如测定抗生素生物 效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。 在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种、微生物计数以 及测定抗生素、噬菌体的效价等。 5．三角烧瓶（Erlenmeyerflask）与烧杯（beaker） 三角烧瓶有 100、250、500、1000ml 等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和摇瓶发 酵等。常用的烧杯有 50、100、250、500、1000ml 等，用来配制培养基与药品。 6．注射器（injector） 一般有 1、2、5、10、20、50ml 等不同容量的注射器。注射抗原于动物体内可根据需要 使用 1、2 和 5ml 的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用 10、20、50ml 的。 微量注射器有 10、20、50、100μ l 等不同的大小。一般在免疫学或纸层析等实验中滴 加微量样品时应用。 7．载玻片（slide）与盖玻片（cover slip） 普通载玻片大小为 75×25mm，用于微生物涂片、染色，作形态观察等。盖玻片为 18× 18mm。 凹玻片是在一块厚玻片的当中有一圆形凹窝（图Ⅰ-6），作悬滴观察活细菌以及微室培 养用。 8．双层瓶（double bottle） 由内外两个玻璃瓶组成（图Ⅰ-7），内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时 使用，外层瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。9．滴瓶（dropper bottle） 用来装各种染料、生理盐水等（图Ⅰ-8）。 10．接种工具 接种工具有接种环（inoculating loop）、接种针（inocula-ting needle）、接种钩 （inoculating hook）、接种铲（inocula-ting shovel）、玻璃涂布器（glass spreader） 等（图Ⅰ-9）。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复 烧灼，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍丝的直径以 0．5mm 为 适当，环的内径约 2mm，环面应平整。接种某些不易和培养基分离的放线菌和真菌，有时用 接种钩或接种铲，其丝的直径要求粗一些，约 1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时 需用玻璃涂布器，是将玻棒弯曲或将玻棒一端烧红后压扁而成。 二、玻璃器皿的清洗方法 清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件， 因此， 玻璃器皿的清洗是实验前的一 项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾 污程度等的不同而有所不同。现分述如下： 1．新玻璃器皿的洗涤方法 新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用 2％的盐 酸或洗涤液（见本小节“3”）。浸泡后用自来水冲洗干净。 2．使用过的玻璃器皿的洗涤方法 (1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗 涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的 油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至 10 次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心 格子的木架（图Ⅰ-10）上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱烘干。 玻璃器皿经洗涤后， 若内壁的水是均匀分布成一薄层， 表示油垢完全洗净， 若挂有水珠， 则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。 装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在 2％煤酚 皂溶液（来苏尔）或 0．25％新洁尔灭消毒液内 24 小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带 病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。 盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研 用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。 (2)玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使 用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内， 免得干燥后难以冲洗干净。 量筒或标本瓶底 部应垫以脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损。待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有 棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入 吸管自动洗涤器内冲洗， 没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片刻。 必 要时再用蒸馏水淋洗。洗净后，放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。 吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有 2％煤酚皂溶液或 0．25％新洁尔灭消 毒液的量筒或标本瓶内，24 小时后方可取出冲洗。 吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。 (3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二 甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸 5―10 分钟，用软布或脱脂棉花擦试，立 即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡 0．5―2 小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水 换洗数次，待干后浸于 95％酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保 存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。 检查过活菌的载玻片或盖玻片应先在 2％煤酚皂溶液或 0． 25％新洁尔灭溶液中浸泡 24 小时，然后按上法洗涤与保存。 3．洗涤液的配制与使用 （1）洗涤液的配制洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下：浓溶液 重铬酸钠或重铬酸钾（工业用） 50g 自来水 150ml 浓硫酸（工业用） 800ml 稀溶液 重铬酸钠或重铬酸钾（工业用） 50g 自来水 850ml 浓硫酸（工业用） 100ml 配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐徐 加入浓硫酸，边加边搅动。 配好后的洗涤液应是棕红色或桔红色。贮存于有盖容器内。 （2）原理 重铬酸钠或重铬酸钾与硫酸作用后形成铬酸（chro-mic acid），酪酸的氧 化能力极强，因而此液具有极强的去污作用。 （3）使用注意事项 （a）洗涤液中的硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器皿浸泡时间太长， 会使玻璃变质，因此切忌到时忘记将器皿取出冲洗。其次，洗涤液若沾污衣服和皮肤应立即 用水洗，再用苏打水或氨液洗。如果溅在桌椅上，应立即用水洗去或湿布抹去；（b）玻璃 器皿投入前，应尽量干燥，避免洗涤液稀释；（c）此液的使用仅限于玻璃和瓷质器皿，不 适用于金属和塑料器皿；（d）有大量有机质的器皿应先行擦洗，然后再用洗涤液，这是因 为有机质过多，会加快洗涤液失效，此外，洗涤液虽为很强的去污剂，但也不是所有的污迹 都可清除；（e）盛洗涤液的容器应始终加盖，以防氧化变质；（f）洗涤液可反复使用，但 当其变为墨绿色时即已失效，不能再用。 三、空玻璃器皿的包装 1．培养皿的包装 培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以 5―8 套培养皿作一包，少于 5 套工作量太大，多 于 8 套不易操作。 包好后行于热灭菌。 如将培养皿放入铜筒内进行干热灭菌， 则不必用纸包， 铜筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图Ⅰ-11），此框架可自圆筒 内提出，以便装取培养皿。 2．吸管的包装 准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约 0．5cm 处，塞一小段约 1．5cm 长的棉花，以免 使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液体 太费力；过松，吹气时棉花会下滑。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与 报纸约呈 45 度角（图 I-12），并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报 纸， 右端多余的报纸打一小结。 如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好， 进行干热灭菌。 如果有装吸管的铜筒（图Ⅰ-13），亦可将分别包好的吸管一起 装入铜筒，进行干热灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包而直接 装入铜筒灭菌，但要求将吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用时，铜筒卧放在桌上，用 手持粗端拔出。 3．试管和三角烧瓶等的包装 试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法见实验十九），然后在棉花塞与管 口和瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热灭菌。试管塞好棉花塞 后也可一起装在铁丝篓中， 用大张报纸将一篓试管口做一次包扎， 包纸的目的在于保存期避 免灰尘侵入。 空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加 一层牛皮纸。 如果试管是盖的铝帽，则不必包纸，可直接干热灭菌。用塑料帽，则宜湿热灭菌。 Ⅱ．环境中的微生物 因为微生物是肉眼看不见的， 所以初学微生物学的学生常不知道外界环境和所有与外界 接触的身体各部位均有微生物的存在。实际上它们广泛分布于室内外的空气、水和土壤中， 桌、椅和板凳的表面，衣服以及身体的皮肤、粘膜（例如鼻腔、口腔、喉头等的粘膜）等处，因此，可以说微生物是无缝不钻，无孔不入的。在学生第一次进入微生物学实验室时，建立 起“微生物无所不在”这一概念是特别重要的，因为这样才能体会到无菌技术和环境卫生的 必要性， 才能防止外界微生物对培养物的污染， 才能防止病原性细菌或病毒通过手或衣服进 入人体而引起传染。 从周围环境和体表各部取样生长出来的微生物， 虽然大多数属正常菌群， 但当进入破损 的皮肤或传入口内或眼睛等处也会引起传染，这一方面是因为通过培养，微生物的量大；另 一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但当条件改变时也可能致病（称为条件致病 菌），因此必须详细阅读操作步骤和听从指导者的说明，特别是用过的棉签和工作完毕后的 培养物等均要放在指定的容器内， 接种环不仅在用前必须烧灼灭菌， 而且用后也应立即烧灼。 这是整个微生物学实验课程和今后进行微生物学实验时均需注意的。 下面的实验就是从实验室空气、实验台、门的旋扭（或把手）和人的头发、皮肤、洗手 前后的手指和鼻腔粘膜等处取样，接种于琼脂平板上，经培养 1―2 天后，观察并比较不同 来源的微生物生长的数量和类型。 实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查 一、目的要求 1．证明实验室环境与体表存在微生物。 2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。 3．体会无菌操作的重要性。 二、基本原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上， 在 37℃温度下培养，1―2 天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可 见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的 大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明 或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和 类型。 三、器材 肉膏蛋白胨琼脂平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或 煤气灯，记号笔（或蜡笔），废物缸。 四、操作步骤 每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配， 最后结果供全班讨论。 1．写标签 任何一个实验， 在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号， 培养皿的记号一般写 在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。用 记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无菌室空气或 头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。 2．实验室细菌检查 （1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培 养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室， 移去皿盖。一小时后盖上两个皿盖。 （2）实验台和门的旋钮 （a）用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线，如图Ⅱ-1。 （b）取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持 棉塞（或试管帽），将其取出（图Ⅱ-2，B），将管口很快地通过煤气灯（或酒精灯）的火 焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出（图Ⅱ-2，C）。 放回棉塞（或试管帽）（图Ⅱ-2，D），并将空试管放在试管架上。（c）弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞（或试管帽）并烧灼管口，将棉签 插入水中， 再提出水面， 在管壁上挤压一下以除去过多的水分， 小心将棉签取出， 烧灼管口， 放回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。 （d）取样 将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约 2 平方厘米的范围。 （e）接种 按图Ⅱ-3，A 在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉 签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下）（图Ⅱ-3，B），立即闭合皿盖。并按图Ⅱ-2，E 和 F，将原放棉签的空试管拔出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放 回试管架。 （f）划线 另取接种环在火焰上灭菌，如图Ⅱ-4，先将环端烧热（图Ⅱ-4，1），然后 将接种环提起垂直放在火焰上（图Ⅱ-4，2），以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种 环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快 地来回通过火焰数次（图Ⅱ-4，3）。 左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处 试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半 处（图Ⅱ-3，C）。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺 破琼脂。 闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接 种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，按图Ⅱ-3，D 从上向下来回划线至 1／2 处。 烧灼接种环，转动平板，按图Ⅱ-3，E，划最后 1／4，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放 回原处。 整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。 3．人体细菌的检查 （1）手指（洗手前与洗手后） （a）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每 次写标签时是必不可少的）。 （b）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。 （c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来 回移动，盖上皿盖。 （2）头发 在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼 脂平板表面，然后盖上皿盖。 （3）咳嗽 将去盖琼脂平板放在离口约 6―8cm 处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上 皿盖。 （4）鼻腔 （a）按照实验台检查法的步骤（b）和（c），取出棉签，并将其弄湿。 （b）用湿棉签在鼻腔内滚动数次。 （c）按实验台检查法的步骤（e）和（f），接种与划线，然后盖上皿盖。 4．将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放 37℃培养箱，培养 1―2 天。 5．结果记录方法 （1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后 1/4 面积内的菌 落数。不是划线的平板，也一分为四，数 1/4 面积的菌落数。 （2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果 细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典 型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。 菌落特征描写方法如下： （a）大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、 中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。 （b）颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。（c）干湿情况 干燥、湿润、粘稠。 （d）形态 圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。 （f）透明程度 透明、半透明、不透明。 （g）边缘 整齐、不整齐。 五、实验报告 1．结果 （1）将你自己的平板结果记录于下表中。（2）与其他同学所做的结果进行比较。 2．思考题 （1）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？ （2）人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类 型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？ （3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？ （4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有 什么体会？ Ⅲ．显微镜的构造、性能和使用方法 由于微生物个体细小， 因此我们必须用显微镜来研究它们的个体形态和细胞结构。 熟悉 显微镜和掌握显微镜的操作技术是研究微生物不可缺少的手段。 现代显微镜一般可以分为两大类，一类是光学显微镜，另一类是非光学显微镜。这两类 显微镜又可根据不同的情况分成若干类型，现列表如下：本部分包括普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和电子显微镜四个实验。目的 在于使同学们通过这四个实验， 对两种类型的显微镜有较全面的了解， 并重点掌握明视野普 通光学显微镜的使用。 对于电子显微镜则着重了解其工作原理， 并要求掌握制作电子显微镜 标本的基本技术。 实验二 普通光学显微镜 一、目的要求 1． 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 2． 二、显微镜的基本构造 显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图Ⅲ-1）。 1．机械装置 镜座（base）和镜臂（arm）镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固 定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。 镜筒（body tube）是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒 两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜 45°。 双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。 转换器（no sepiece）为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装 3―4 个物镜，可使每 个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。 载物台（stage）又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光 孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将 标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变 换的视野。 调焦装置 是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarse adjustment）即粗调 节器和微动螺旋（fine adjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物 体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。 2．光学系统 物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接 物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常 标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA0．30；10×；160/0．17； 16mm。其中“NA0．30”表示数值孔径（numerical aperture，简写为 NA），“10×”表示 放大倍数，“160/0．17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm 表示焦距。 目镜（ocular lens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。 镜把物镜造成的像再次放大， 不增加分辨力，上面一般标有 7×、10×、15×等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的 500―700 倍， 最大也不能超过 1000 倍的选择。 目镜 的放大倍数过大，反而影响观察效果。 聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度和 造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（iris diaphragm） 组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于 1，当使用大于 1 的聚光镜时，需在聚光镜和 载玻片之间加香柏油，否则只能达到 1．0。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推 动把手可随意调整透进光的强弱。 调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小， 可得到适当的光照 和清晰的图像。 光源（light source）较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮 开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一 面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱 时可用凹面反光镜。 滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某 一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和 清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光， 可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。 3．成像原理 普通光学显微镜的成像原理如图Ⅲ-2 所示。 三、油镜物镜的基本原理 微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40 ―45×）和油镜（1．8 mm，95―100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI （oil immer-sion） 字样表示， 它是三者中放大倍数最大的。 根据使用不同放大倍数的目镜， 可使被检物体放大
多倍。从图Ⅲ-3 中可看出油镜的焦距和工作距离（标本在 焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜 观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。 使用时， 油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气， 而是隔一层油质， 称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率 n=1．52，与玻璃相同。当光线通过 载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气， 则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这 样就减低了视野的照明度（图Ⅲ-4）。 利用油镜不但能增加照明度， 更主要的是能增加数值孔径， 因为显微镜的放大效能是由 其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半 正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示： NA＝n?sinα 式中 NA=数值孔径； n=介质折射率； α =最大入射角的半数，即镜口角的半数。 因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决 定于物镜的直径和焦距。 同时， 的理论限度为 90°， α sin90°=1， 故以空气为介质时 （n=1） ， 数值孔径不能超过 1，如以香柏油为介质时，则 n 增大，其数值孔径也随之增大。如光线入 射角为 120°，其半数的正弦为 sin60°=0．87，则： 以空气为介质时： NA=1×0．87=0．87 以水为介质时： NA=1．33×0．87=1．15 以香柏油为介质时： NA=1．52×0．87=1．32显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。 它与物镜的数值孔径成 正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力 愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的 可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实 际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。 显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示 的。式中λ =光波波长。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为 0．55μ m，假如数值孔径为 0．65 的高倍物镜， 它能辨别两点之间的距离为 0．42μ m。而在 0．42μ m 以下的两点之间的距离就分辨不出， 即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更 大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为 1．25 的油镜时，能辨别两点之间的因此，我们可以看出，假如采用放大率为 40 倍的高倍物镜（NA=0．65），和放大率为 24 倍的目镜，虽然总放大率为 960 倍，但其分辨的最小距离只有 0．42μ m。假如采用放大 率为 90 倍的油镜（NA=1．25），和放大率为 9 倍的目镜，虽然总的放大率为 810 倍，但却 能分辨出 0．22μ m 间的距离。 四、器材 显微镜，显微镜灯，香柏油，二甲苯； 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）染色玻片标本， 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）染色玻片标本。 五、操作步骤 1．观察前的准备 （1）置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约 3―4cm。镜检者姿势要端正， 一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼 均能观察。 （2）调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置 和镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。 调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线 较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线 较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查 染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降 聚光器、旋转反光镜调节光线。 2．低倍镜观察 检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。 将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物 镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约 0．5cm 处，由目镜观察，此时可适当地缩 小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物 像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到 合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。 3．高倍镜观察 将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然 后由目镜观察，并仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视 野中心，准备用油镜观察。 4．油镜观察 （1）用粗调节器将镜筒提起约 2cm，将油镜转至正下方。 （2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 （3）从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎 与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏 镜头。 （4）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升， 直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须 再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。 （5）用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。 （6）观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯 （香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌 用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。（7）将各部分还原， 反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚 光镜发生碰撞危险。 六、实验报告 1．结果 分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的状 态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。 2．思考题 （1）在使用高倍镜和油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？ （2）用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？ （3）在明视野显微镜下，观察细菌形态时，你认为用染色标本好，还是用未染色的活 标本好，为什么？ 实验三 暗视野光学显微镜 一、目的要求 1．了解暗视野显微镜的基本原理及用途。 2．学习并掌握使用暗视野显微镜观察微生物样品的基本技术。 二、基本原理 生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的， 不易看清。 暗视野显微镜的原理与来自缝 隙的一束强光通过暗室时， 可清楚地看到其中细微灰尘的现象是一样的， 即给样品照明的光 不直接穿过物镜，而是由样品上反射或折射的光进入物镜，那么，在漆黑的视野中，由于反 差增大了，使样品能够看得更清楚。因用暗视野法可以在黑暗的视野中看到光亮的菌体，故 在观察生活细菌及细菌运动时常采用此法。 暗视野显微镜的构造主要是采用一种特殊的聚光器， 在聚光器的下方中央为圆形黑盘所 遮，光仅由周缘进入，使光会聚于载玻片上，并斜照物体，物体经斜射照明后，发出反射光 可进入物镜，这样，造成显微镜视野黑暗，而其中的物体明亮。如无暗视野显微镜时，只需 将明视野显微镜上的聚光器取下， 换上暗视野聚光器即可； 也可在明视野显微镜聚光器下面 的滤光镜支架上放一片星形挡板（star diaphragm）（图Ⅲ-6）构成暗视野，这种方法适用 于低倍镜观察。 在暗视野中，由于有些活细胞其外表比死细胞明亮，所以暗视野也被用来区分死、活细 胞，此技术现已被用于各种酵母细胞的死、活鉴别。此外，暗视野显微镜对于观察娇弱的微 生物，如梅毒密螺旋体（Treponema pallidum）特别有用。 三、器材 酿酒酵母（Saccharomy-ces cerevisiae）； 暗视野显微镜，载玻片，盖玻片，无菌水。四、操作步骤 1．选厚薄在 1．0―1．2mm 的干净载玻片一块，滴上酿酒酵母悬液，加盖玻片（注意切 勿有气泡存在）。 2．将聚光镜光圈调至 1．4。 3．光源的光圈孔调至最大。 4． 在聚光器上放一大滴香柏油， 将标本置载物台上， 旋上聚光器使油与载玻片接触 （不 能有气泡发生）。 5．用低倍物镜及 7×目镜进行配光对准物体。调节聚光器的高度，首先在载玻片上出 现一个中间有一黑点的光圈，最后为一光亮的光点（图Ⅲ-7），光点愈小愈好，由此点将聚 光器上下移动时均使光点增大。 6．换上所需目镜和高倍镜，缓慢上升物镜进行调焦，至视野中心出现发光的样品。 7．在盖玻片上滴一滴香柏油，并将油镜转至应在位置调节配光，进行观察。 五、注意事项 1．进行暗视野观察时，聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满，否则照明光线于聚 光镜上面进行全面反射，达不到被检物体，从而不能得到暗视野照明。 2．在进行暗视野观察标本前，一定要进行聚光镜的中心调节和调焦，使焦点与被检物 体一致。 3．由于暗视野聚光镜的数值孔径都较大（ NA=1．2―1．4），焦点较浅，因此，过厚 被检物体无法调在聚光镜焦点处，一般载玻片厚度为 1．0mm 左右，盖玻片厚度宜在 0．16mm 以下，同时载玻片、盖玻片应很清洁，无油脂及划痕，否则都会严重地扰乱最终的像。 六、实验报告 思考题 （1）观察活细胞的个体形态，你认为用显微镜的明视野好？还是暗视野好？为什么？ （2）你所观察到的酿酒酵母，在暗视野中能否区分死、活细胞？ （3）暗视野观察时，所用的载玻片、盖玻片有何要求？为什么？ 实验四 相差显微镜 一、目的要求 1．了解相差显微镜的基本原理和用途。 2．学习掌握相差显微镜的操作技术。 二、基本原理 暗视野显微镜可以看到活细胞的外部形态， 但是看不清内部结构。 相差显微镜不仅能观 察活细胞的形态，而且还能看到细胞内部结构以及细胞分裂的连续过程。 光线通过透明物体如活细菌细胞后，由于受透明物体中密度和折射率不同的物质的影 响，部分光线变成了绕射光，光波的相位发生变化，而这种相位差不表现为明暗和颜色上的 差异，不能在显微镜视野中观察到。相差显微镜就是将经过透明物体的直射光延迟或提前， 并和绕射光产生干涉，使相位差变为振幅差。如果产生的干涉为相长干涉（图Ⅲ-8，R 组光 线），则振幅的同相量相加而变大，我们便看到较亮的部分；如果所产生的干涉为相消干涉 时（如图Ⅲ-8，S 组光线），则振幅异相量相消而变小，这部分就变得较暗。这样，变相位 差为振幅差的结果，使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，能更清晰地观 察活细胞的细微结构。 相差显微镜成像原理和装置如图Ⅲ-9 所示。 在普通光学显微镜上增加下列四种附件就成为相差显微镜： （1）环状光阑 相差显微镜的聚光镜光阑是环状光阑。 照明光线只能从环状的透明区进入聚光镜再斜射 到标本上（斜射角度远小于暗视野聚光镜）。大小不同的环状光阑成一转盘（图Ⅲ-10，A）， 安装于聚光镜下面，更换放大率不同的物镜时，要同时更换与其相应的光阑。 （2）相差物镜（镜头上标有 PC 或 PH 字样）物镜的后焦平面上装有相板， 这是相差显微镜的主要装置。 相板上和环状光阑相对应的 环状部分大多数是涂的吸收膜和推迟相位膜，其他部分完全透明。从标本上射过来的光线， 绕射光部分穿过透明区；直射光则穿过相板的环状部分，光强度减弱，相位也适当改变。一 般所用的相板推迟相位 1/4，吸收 80％的直射光，这样，就使直射光和绕射光的强度接近， 而相位差则增大或减少。 由于透明标本内部构造的折射率不同， 产生绕射光的相位就会有不 同程度的推迟，绕射光和直射光的干涉作用将相位差变成振幅差。 （3）绿色滤光片 为了获得良好的相差，最好用单色光线照明，一般选用绿色光线。 （4）合轴调整望远镜 为使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上， 必须拔出目镜， 装上特别的低倍望 远镜（图Ⅲ-10，B），使相板的暗环与环状光阑的明环合轴（图Ⅲ-11）。 三、器材 相差显微镜，1．0mm 以下载玻片，0．16-0．17mm 以下盖玻片；酿酒酵母水浸片，枯草 芽孢杆菌水浸片。 四、操作步骤 1．将酿酒酵母水浸片置载物台上，夹好。 2．转动聚光器下面的环状光阑转盘至“0”，并将光圈开到最大。 3．通过普通目镜和低倍相差物镜（如 10×）调节焦距，看清标本。 4．转动转换器，使油镜相差物镜（90×）对准标本，同时转动环状光阑转盘至 40，使 与所用的物镜相符。 5．用细调节器调节焦距，使物像清楚。 6．取下目镜，换上合轴调节望远镜，转动望远镜使聚光镜中的亮环和物镜中的暗环看 清楚。 7．转动聚光镜左右二侧的调节杆，使两环重合。 8．取下望远镜换上目镜进行观察，每更换标本或改变不同倍数的相差物镜时，都必须 依上法重新合轴调节。 9．换上枯草芽孢杆菌的水浸片进行观察（必须先进行合轴调节）。 五、实验报告 1．结果 绘出你用相差显微镜所观察到的酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的形态结构。 2．思考题 为什么说相差显微镜适于观察活细胞的细微结构？ 实验五 电子显微镜 一、目的要求 1．了解电子显微镜的工作原理。 2．学习并掌握制备电镜标本的方法。 二、基本原理 1．电子显微镜的分辨力和放大率 电子显微镜是利用电子流代替光学显微镜的光束使物体放大成像而由此得名的。 发射电 子流的电子源部分称为电子枪，电子枪由发射电子的“V”形钨丝及阳极板组成，在高真空 中，钨丝被加热到白炽程度，其尖端便发射出电子，发射出来的电子受到阳极很高的正电压 的吸引，使电子得到很大的加速度而到达样品。电压越高，电子流速度越快，波长越短，其 分辨能力也越强。一般用 50―100kV 电压时，电子波长在 0．54―0．37nm，所以电子显微 镜的分辨力极高，可达 0．2nm 左右，此分辨力比光学显微镜提高了近 1000 倍。 在电子流的通路上不能有游离的气体分子存在， 否则由于气体分子与电子的碰撞而造成 电子的偏转， 导致物像散乱不清。 因此， 电子显微镜除需要高电压外， 还需要高真空的装置。 电子显微镜的放大率是由透镜决定的， 在电子显微镜中， 透镜是由看不见的电磁场构成 的，称为电磁透镜，简称磁透镜。由电子枪发射出的电子流可以通过磁透镜的磁场吸引发生偏折而放大物体， 这与光学显微镜的光线通过玻璃透镜发生折射而放大物体的情况一样， 但 它不同于光学显微镜的是可利用多个磁透镜的组合而得到逐级放大的电子像， 所以现代电子 显微镜的成像系统由多个电磁透镜组成。而光学显微镜由于玻璃透镜本身存在有相差的缺 陷，其放大率不能通过增加透镜的数目来无止境地提高。 此外，通过改变这些电磁透镜的磁场强度也可提高放大率。磁场越强，焦距越短，放大 倍数也就越大。 所以现代电子显微镜的成像物镜大多数采用短焦距的强磁透镜， 放大倍数可 达一百万倍以上。 图Ⅲ-12 表示电子显微镜镜体剖面图。 从图上可以看到构成电子显微镜的主要部件及其 位置。 2．电子显微镜的成像原理 任何一个物体都是由原子组成的， 原子则是由原子核与轨道电子组成的。 当电子束照射 到样品上的时候， 一部分电子能从原子与原子之间的空隙中穿透过去， 其余的电子有一部分 会与原子核或原子的轨道电子发生碰撞被散射开来； 一部分电子从样品表面被反射出来； 还 有一些电子是被样品吸收以后， 样品激化而又从样品本身反射出来等。 如果把所有这些不同 类型的电子收集起来，使它们成像，便可以构成不同类型的电子显微镜（图Ⅲ―13）。这里 只着重介绍透射电子显微镜和扫描电子显微镜。 （1）透射电子显微镜 从图Ⅲ-13 可以看出透射电子显微镜收集的是透过样品的电子。在透射电子显微镜中， 物像的形成主要来自电子的散射作用与干涉作用。 散射作用分 “弹性散射” “非弹性散射” 和 两种。弹性散射指电子和原子核发生碰撞，电子基本上不损失能量，而只是改变运动方向， 这种碰撞称为弹性碰撞，这时候我们说电子发生了“弹性散射”作用。如果电子是和轨道电 子发生碰撞，电子不仅会改变原来运动的方向，而且还会损失一部分能量，这时电子便发生 了“非弹性散射”作用。 由于物体上不同部位的结构不同， 它们散射电子的能力也各不相同， 结果使透过样品的 电子束发生疏密的差别，在散射电子能力强的地方，透过去的电子数目少，因而打在荧光屏 上所发出的光就弱，显现为暗区；而散射电子能力弱的地方，透过的电子数目多，打在荧光 屏上所发出的光就强，显现为亮区，这样，便在终像上造成了有亮有暗的区域，因而出现了 反差， 人眼就可以辨别。 散射作用形成的反差造成强度上的变化，因此又称为“振幅反差”。 由于在电子显微镜中利用的是人眼看不见的电子流， 所以通常用一块荧光屏来把电子流转换 成可见的荧光，使人眼可以接受。 除了散射作用能引起反差外， 电子的干涉作用也能造成反差， 在电子发生非弹性碰撞的 时候，由于电子会失去一部分能量，因而使它前进的速度变慢，这部分速度减慢的电子会和 速度不变的电子发生干涉作用，结果造成电子相位上的变化，从而也引起反差，称为“相位 反差”。 在低倍观察时， 振幅反差是主要的反差来源， 而在高倍观察时， 也就是在辨别极小的 （如 1nm 大小）细微结构时，相位反差则起主要作用。 （2）扫描电子显微镜 与透射电子显微镜不同， 扫描电子显微镜是把从样品表面反射出来的电子收集起来并使 它们成像， 所以又称反射电子显微镜。 扫描电子显微镜的成像原理与电视或电传真照片的原 理相似，由电子枪产生的电子束经过三个磁透镜的作用，形成一个很细的电子束，称为电子 探针。电子探针经过透镜聚焦到样品表面上，按着顺序逐行逐行地通过样品，也就是对样品 扫描， 然后把从样品表面发射出来的各种电子 （二次电子、 反射电子等） 用探测器收集起来， 并转变为电流信号经放大后再送到显像管转变成图像。 扫描电子显微镜主要用来观察样品的表面结构，分辨力可达 10nm，放大范围很广，可 从 20 倍到几十万倍。透射电子显微镜的分辨力虽然很高，但是一般只能观察切成薄片后的 二维图像，扫描电子显微镜能够直接观察样品表面的立体结构，并且具有明显的真实感。许 多电子无法透过的较厚样品，只能用扫描电子显微镜才能看到。 光学显微镜、透射电子显微镜以及扫描电子显微镜的比较见图Ⅲ-14。三、器材 铜网若干个，瓷漏斗，无菌镊子，无菌滴管，大头针，载玻片，细菌计数板，普通光学 显微镜； 醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2％磷钨酸钠（pH6．5―8．0）水溶液； 大肠杆菌（大肠埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。 四、样品制备 根据电子显微镜类型的不同， 相应地也就有各种不同的样品制备技术， 本实验主要介绍 透射电子显微镜的样品制备技术。 由于电子显微镜的整个操作都需要在高真空中进行， 所以被观察的微生物标本必须是干 燥的，否则就会引起菌体细胞发生收缩变形。同时又因为电子流的穿透能力很弱，不能透过 载玻片或较厚的标本， 所以需要将标本放在由金属网作支架的火棉胶或聚乙烯甲醛薄膜上观 察，此膜又称载膜或支持膜（扫描电子显微镜可用盖玻片）。 1．制作支持膜 支持膜的厚度一般在 15nm 左右，太薄会影响它的机械支持力，太厚 又会影响成像的分辨力。支持膜可用塑料膜（如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以 用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。在常规工作条件下，用塑料膜就可以达到要求。常用的金 属网有铜网和不锈钢网。本实验以铜网火棉胶膜为例说明支持膜的制作方法。 （1）铜网的处理 铜网为圆形，直径一般是 2．3 或 3．0mm，其规格有 150、200、250 目之分，其中比较常用的是 200 目（200 个孔）。铜网在制膜前要清洗、脱水，否则会影响 膜的质量和标本照片的清晰度。 处理方法是先用醋酸戊酯浸漂若干小时后， 用蒸馏水冲洗数 次， 然后再将铜网浸漂在无水酒精中进行脱水， 最后将洗净的铜网放入瓷漏斗或小培养皿内， 漏斗下面套上乳胶管， 用止水夹控制水流。 然后缓缓向漏斗内放入无菌水， 其量为 1cm 左右， 用无菌镊子尖轻轻排除网上的气泡，并将其均匀地摆在瓷漏斗的中心区域。 若铜网经以上处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）处理 1 分钟左右，立即用无 菌蒸馏水冲洗数次，然后放入无水酒精中脱水。 （2）配制火棉胶 将 1．5g 火棉胶溶于 100ml 醋酸戊酯中。 （3）制膜 用无菌滴管取上述火棉胶液滴在瓷漏斗的水面上，待醋酸戊酯蒸发，火棉胶 则由于水的表面张力随即在水面上形成一层薄膜（勿振动），用镊子将它除掉，如此操作两 次以清除水面上的杂质。 然后再适量滴一滴火棉胶液以形成支持膜 （火棉胶液滴的多少与膜 的厚薄关系很大，要适量控制）。松开止水夹，缓缓放掉漏斗中的水，使膜自然下沉，并紧 贴在铜网上，在此过程中切勿使膜皱折。最后在瓷漏斗上覆盖一洁净的纸，让膜自然干燥。 将干燥后的膜用大头针的针尖在铜网周围划破， 再用无菌镊子小心地将铜网膜移到载玻 片上， 置普通光学显微镜下用低倍镜检查， 挑选无皱折、 完整无缺、 厚薄均匀的铜网膜备用。 2．制片 有许多种制片方法，如直接贴印法、滴液法、负染色法和超薄切片法等。本实验介绍负 染色法， 此法常用来观察病毒粒子、 高分子和细菌等。 所谓负染色法是将样品用电子密度高， 本身不显示结构且与样品几乎不反应的物质（如磷钨酸钠或磷钨酸钾）来包围样品，即不是 被样品成分所吸附而是沉积到样品四周。 如果样品具有表面结构， 这种物质还能穿透进表面 上凹陷的部分，这样，在有染液的重金属元素沉积的地方，散射电子的能力强，因而样品四 周表现为暗区；在有样品的地方散射电子的能力弱，因而表现为亮区。这样便能把样品的外 形与表面结构清楚地衬托出来。具体操作如下： （1）将适量无菌水加入生长良好的大肠杆菌斜面内，用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬液。 用无菌滤纸过滤，并调整滤液中的细胞浓度为每毫升 108―109 个。 （2）取等量的上述菌悬液与等量的 2％的磷钨酸钠水溶液（pH6．5―8．0）混合，制 成混合菌悬液。 （3）用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。 （4）经 3―5 分钟后，用滤纸吸去余水，待样品干燥后，先置低倍光学显微镜下检查， 挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网置电子显微镜观察。为了保持形状，常用戊二醛、甲醛、饿酸蒸汽等试剂小心固定后再进行染色。其方法是 将无菌水制备好的菌悬液经过滤，然后向滤液中加几滴固定液（如 0．15％的戊二醛磷酸缓 冲液，pH7．2），经这样预先稍加固定后，离心，收集菌体，制成菌悬液，再加几滴新鲜的 戊二醛，在室温或 4℃冰箱内固定一夜，次日离心，收集菌体，再用无菌水制成菌悬液，并 调整细胞浓度为每毫升 108―109 个，然后按上述方法染色。 五、实验报告 思考题 （1）比较透射电子显微镜与普通光学显微镜的主要异同点。 （2）利用透射电子显微镜来观察的样品为什么要放在金属网作为支架的火棉胶膜（或 其他膜）上？而扫描电子显微镜则可以将样品固定在盖玻片上？ （3）在用负染色法制片时，磷钨酸钠起什么作用？ Ⅳ．微生物的染色与形态结构观察 虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构， 但一般实验室常用的是普通 光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸 收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背 景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可 借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态， 亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜 明对比， 这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构， 而且还可以通过 不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微 生物形态结构的重要手段。 本部分实验着重于细菌的染色观察， 同时也针对放线菌、 酵母菌和丝状真菌的形态特点 进行相应的实验。 目的在于使同学们在掌握细菌染色技术的基础上， 了解各种其他的染色制 片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。 实验六 细菌的单染色法 一、目的要求 1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。 2．巩固显微镜的使用方法。 二、基本原理 所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。 此法操作简便， 适用于菌体 一般形态的观察。 在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。 碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细 菌结合而使细菌着色。 例如， （亚甲蓝） 美蓝 实际上是氯化亚甲蓝盐 （methylenebluechloride， 缩写为 MBC），它可被电离成正、负离子： MBC→methylene blue++chloride带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫 （crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。 细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比， 使易于在显微镜下进行观察。 三、器材 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸，生理盐水； 吕氏碱性美蓝染色液，石炭酸复红染色液； 金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌。 四、操作步骤 1．涂片 取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作（图Ⅳ -1，具体操作参照实验一），分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中 （每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。 2．干燥 于室温中自然干燥。3．固定 涂片面向上，于火焰上通过 2―3 次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并 使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。 4．染色 放标本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而 定。吕氏碱性美蓝染色液约染 2―3 分钟，石炭酸复红染色液约染 1―2 分钟。 5．水洗 染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜 过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹 干，待完全干燥后才可置油镜下观察。 6．镜检 按实验二操作程序进行显微镜观察。 五、实验报告 1．结果 绘出你所观察到的经单染色的两种细菌形态图。 2．思考题 （1）根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？ （2）制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？ 实验七 革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医师 Gram 创立的。 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类： 染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称 为革兰氏阴性细菌，用 G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成 分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的， 在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使 结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞 壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性 增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色， 因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）； 脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细 菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料 固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行 脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95％的酒 精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色 的细胞染上不同于初染液的颜色， 而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色， 从而将细胞区分 成 G+和 G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌； 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 1．涂片将培养 14―16 小时的枯草芽孢杆菌和培养 24 小时的大肠杆菌分别作涂片（注 意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰 1―2 次即可，不可过热，以载玻 片不烫手为宜。 2．染色 （1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。（3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 不出现紫色时为止，约 20―30 秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染 用番红液染 1―2 分钟，水洗。 （5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散 开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 如脱色过度， 则阳性菌可被误染为阴性 菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养 时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 图Ⅳ-2 示革兰氏染色过程。 五、实验报告 1．结果 在你所作的革兰氏染色制片中， 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴 性菌还是革兰氏阳性菌？ 2．思考题 （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？ （2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？ 实验八 细菌芽孢染色法 一、目的要求 学习并掌握芽孢染色法。 二、基本原理 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着 色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因 此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在 加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料 可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如 黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。 三、器材 枯草芽孢杆菌， 蜡状芽孢杆菌 （Bacillus cereus）生孢梭菌 ， （Clostridium sporogenes） ； 孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液等。 四、操作步骤 方法 1、 （1）将培养 24 小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。 （2）滴加 3―5 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 （3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必 要时可添加少许染液。 加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 4―5 分钟。 这一步也可不加热， 改用饱和的孔雀绿水溶液（约 7．6％）染 10 分钟。 （4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。 （5）用番红水溶液复染 1 分钟，水洗。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。 方法 2、 （1）取二支洁净的小试管，分别加入 0．2ml 无菌水，再往一管中加入 1―2 接种环的 蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入 1―2 接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成 浓厚的菌悬液。 （2）在菌悬液中分别加入 0．2ml 苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热 3―5 分钟。（3）用接种环分别取上述混合液 2―3 环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍 倾斜于烧杯上，用 95％乙醇冲洗至无红色液流出。 （4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。 （5）取 1―2 接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然干燥后，油镜观察，在 淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。 五、实验报告 1．结果 绘图表示你观察到的两种芽孢杆菌的芽孢在形状、大小、着生位置上有什么不同？ 2．思考题 实验九 荚膜染色法 一、目的要求 学习并掌握荚膜染色的基本方法。 二、基本原理 荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易被染色，故 常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄，易 变形，因此，制片时一般不用热固定。 三、器材 圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）； 荚膜染色液，纯甲醇等。 四、操作步骤 1． 在载玻片一端滴一滴无菌水， 取少许培养了 72 小时的圆褐固氮菌在水滴中制成悬液。 取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片， 将推片一端平整的边缘与菌悬液以 30 度角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的 一层，风干。 2．用纯甲醇固定 1 分钟。 3．加番红液数滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染 30 秒钟，以细水流适当冲洗，吸干后 油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。 五、实验报告 1．结果 绘图说明圆褐固氮菌菌体及荚膜的形状。 2．思考题 为什么在荚膜染色中一般不用热固定，而用纯甲醇进行固定？ 为什么在孔雀绿染色液加热染色中，要待玻片冷却后才能用水冲洗？ 实验十 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察 一、目的要求 1．学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。 2．学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 二、基本原理 鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为 0．01―0．02μ m， 在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是 借媒染剂和染色剂的沉淀作用， 使染料堆积在鞭毛上， 以加粗鞭毛的直径， 同时使鞭毛着色， 在普通光学显微镜下能够看到。 在显微镜下观察细菌的运动性， 也可以初步判断细菌是否有鞭毛。 通常使用压滴法或悬 滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围 的液体就难以辨别。 三、器材 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），假单胞菌（Pseudomonas sp．），金黄 色葡萄球菌；鞭毛染色液，万分之一的美蓝水溶液，凡士林，无菌水，载玻片，凹玻片，盖玻片等。 四、操作步骤 1．鞭毛染色 (1)菌种用新培养的菌种为宜，如所用菌种已长期未移种，则用新制备的斜面连续移种 2―3 次后再使用。 最好是将经活化的菌种接种到新制备的琼脂斜面或半固体培养基平皿上， 培养 10 小时左右，备用。 (2)制片 在载玻片的一端滴一滴蒸馏水， 用接种环挑取少许备用的菌苔， 最好从菌落的 边缘取菌苔，注意不要挑上培养基，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液 随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。 (3)染色 涂片干燥后滴加 A 液染 3―5 分钟，用蒸馏水冲洗，或将残水沥干或用 B 液冲 去残水（注意：一定要充分洗净 A 液后再加 B 液，否则背景很脏）。洗净 A 液滴加 B 液后， 将玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，一般染 30―60 秒钟。然后用蒸馏水冲洗， 自然干燥。 (4)镜检 镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染 出鞭毛。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 细菌鞭毛染色要求非常小心细致，染色成功的关键主要决定于：(a)菌种活化的情况， 即要连续移种几次；(b)菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；(c)新鲜的染 色液；(d)载玻片要求干净无油污。鞭毛染色所用载玻片的清洗方法如下： 选择光滑无伤痕的玻片。先用洗衣粉煮沸，洗衣粉最好在洗玻片前加蒸馏水煮沸，用滤 纸过滤去渣。 为了避免玻片彼此磨损， 最好把载玻片放在特制的架上煮， 煮毕稍冷却后取出， 用清水洗净，再放入浓洗液中浸泡 24 小时左右，取出用清水冲洗残酸，最后用蒸馏水洗净， 沥干水并放于 95％乙醇中脱水，取出玻片，用火焰烧去酒精，立即使用。如不立刻使用， 可存放于干净的盒中或 50％乙醇中短期存放。由于空气中常常漂浮油污，最好立即使用。 在洗净的玻片上滴上水滴后应能均匀散开。 2．运动性观察 (1)压滴法 (a)分别将 5ml 无菌水倒入苏云金芽孢杆菌、假单胞菌和金黄色葡萄球菌的斜面培养物 内，制成菌悬液。各取出 1ml 菌液稀释至肉眼看不到混浊为止。 (b)各取 2―3 环三种稀释菌液， 分别放在三片清洁的载玻片中央， 再各放一环万分之一 的美蓝水溶液混匀。 (c)用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注 意不要产生气泡。按此法分别将盖玻片覆盖于三种菌液上。 (d)先以低倍镜找到标本，再用高倍镜观察，观察时光线要调得暗些。 (2)悬滴法 (a)