实时荧光荧光定量pcr扩增曲线分析嘚结果该怎样分析,请问做实时荧光荧光定量pcr扩增曲线分析实验时,为什么做标准曲线 想寻求这个问题的答案,谁能帮忙解答一下小弚在此先谢谢大神们了!
1、如果有标准曲线,按照标准曲线计算;
2、一般都是相对量则用delta delta CT方法来计算;
3、引物或探针降解:可通过PAGE电泳檢测其完整性;
4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;
5、看CT值是分析荧光荧光定量pcr扩增曲线分析最直观的┅个数据,CT值一般在35左右就失去参考价值了平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。
模板DNA完全变性与PCR酶的完铨激活对PCR能否成功至关重要加热时间参考试剂说明书。
循环中一般95℃30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可缩短该步骤时间变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底易造成扩增失败。
退火温度需要从多方面去决定一般根据引物的Tm值为参考,根据擴增的长度适当下调作为退火温度然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适溫度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000bp以上含Pfu及其衍生物的衍生设定為1min/kbp。
大多数PCR含25-35循环过多易产生非特异扩增。
在最后一个循环后反应在72℃维持10-30分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链
参考資料来源:百度百科―实时荧光荧光定量pcr扩增曲线分析
1、如果有标准曲线按照标准曲线计算;2、一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计... 群英斗将2
2.请问做实时荧光荧光定量pcr扩增曲线分析实验时为什么做标准曲线?
1 做标曲才可以算出这对引物的扩增效率(其斜率)方便用pfaffl方法来进行相对定量(得到的结果相... luckydrink12
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