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5味中药对体外培养原代人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响
&&&&&&&&&　　近日，中国医科大学附属第一医院中心实验室研究人员发表论文，旨在利用原代培养的人外阴正常皮肤成纤维细胞，观察中药对人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响。研究指出，成功建立了体外人外阴皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定方法；特定浓度范围内的莪术、黄芪、丹参、川穹和当归能够抑制人外阴皮肤成纤维细胞的体外增殖。该文发表在2014年第09期《中国医科大学学报》杂志上。 　　胰蛋白酶消化、分离及培养人外阴皮肤成纤维
　　近日，中国医科大学附属第一医院中心实验室研究人员发表论文，旨在利用原代培养的人外阴正常皮肤，观察对人外阴皮肤成纤维的影响。研究指出，成功建立了体外人外阴皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定方法；特定浓度范围内的莪术、黄芪、丹参、川穹和当归能够抑制人外阴皮肤成纤维细胞的体外增殖。该文发表在2014年第09期《中国医科大学学报》杂志上。
　　胰蛋白酶消化、分离及培养人外阴皮肤成纤维细胞；倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态；HE染色观察细胞爬片下的形态及着色；免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白；测定细胞生长曲线；MTT法测定莪术、黄芪、丹参、川穹及当归5种中药作用后细胞增殖能力。
　　生长曲线测定结果显示：传6代内以及传6代内复苏人外阴皮肤成纤维细胞增殖能力均很强。MTT检测结果显示：5种药物在特定浓度范围内均能抑制人外阴皮肤成纤维细胞的增殖。分别作用于人外阴皮肤成纤维细胞72&h后，莪术5、10、100&mg/L浓度组，黄芪500、1&000&mg/L浓度组，丹参1&000&mg/L浓度组，川穹500、1&000&mg/L浓度组，当归100、500、1&000&mg/L浓度组均显示抑制增殖作用，与对照组比较差异有统计学意义（P&0.05），其中莪术和川穹的抑制强度呈剂量依赖性。
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人包皮成纤维细胞体外诱导重编程为多能干细胞的基础研究
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体外培养人创面肉芽组织成纤维细胞生物学特性研究
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体外不同动态力学应变对人牙周膜成纤维细胞增殖和功能活性
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: &&&&DOI: 10.3969/j.issn.14.10.012
脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells
人脐带间充质干细胞体外诱导分化为成纤维细胞
杨& 一，罗& 新，蒋学风，帅翰林，宋& 泓，张敬丽，蓝建发
暨南大学附属第一医院妇产科，广东省广州市& 510630
Human umbilical cord mesenchymal stem cells are induced in vitro to differentiate into fibroblasts
Yang Yi, Luo Xin, Jiang Xue-feng, Shuai Han-lin, Song Hong, Zhang Jing-li, Lan Jian-fa
Department of Gynecology and Obstetrics, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
参考文献(0)
近年来随着组织工程学的兴起，寻找新的用于组织构建的种子细胞成为众多学者研究的重点。从发生学的角度来看，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。由于伦理问题的制约，胚胎干细胞较少用于临床应用中。成体干细胞包括间充质干细胞、肌源性干细胞、造血干细胞、神经干细胞等，间充质干细胞由于其含量丰富研究更为广泛。
间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化能力的成体干细胞，在体内和体外各种不同诱导条件下，间充质干细胞具有分化为成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞等中胚层和神经外胚层组织细胞的能力[1-6] 。随着再生医学和组织工程技术的迅速发展，关于干细胞的研究成为自然科学研究中最引人关注的领域。国内外已有大量研究表明间充质干细胞移植治疗能改善受损器官的功能，症状可得到一定程度的改善并有可能得到完全治愈[7-11] 。已经报道的含有干细胞的成体组织有：脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏、脂肪等[12-15] 。骨髓间充质干细胞最早发现于20世纪70年代末[16-17] ，一度成为实验研究和临床应用中间充质干细胞的主要来源，目前其仍然是最常用的种子细胞，但由于骨髓间充质干细胞的获取是有创的，在骨髓中的含量低[18] ，病毒感染率高[19] ，而且随着年龄的增长增殖分化能力逐渐下降，其临床应用受到一定的限制。
脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，内含结缔组织和血管，由羊膜包被着脐动脉和脐静脉以及周围富含黏多糖的糖蛋白组成[20] 。人脐带间充质干细胞由中胚层发育而来，存在于脐带沃顿氏胶和血管周围组织中。分娩后的脐带一直被当做医疗废弃物丢弃，近年来由于再生医学的迅猛发展，人脐带间充质干细胞得到广泛的关注。由于人脐带间充质干细胞来源广泛、免疫原性低、可塑性强、无伦理学争议，在组织工程及再生医学中有广泛的应用前景。
有研究表明间接共培养法可促进骨髓间充质干细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维，成功使之诱导分化为成纤维细胞[21-23] 。但是对于人脐带间充质干细胞向成纤维细胞的诱导的研究及应用较少，实验旨在用贴壁法培养人脐带间充质干细胞，培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子诱导人脐带间充质干细胞为成纤维细胞，为组织工程中人脐带间充质干细胞替代韧带成纤维细胞提供理论依据。
杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
全文链接：
设计：细胞学体外对比观察。
时间及地点：于月在暨南大学生物医药基地完成。
脐带来源：正常足月剖宫产健康新生儿脐带组织(近新生儿侧)，取自暨南大学附属第一医院手术室，经产妇及其家属知情同意，实验经医院伦理委员会批准。脐带采集之前产妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体等检测。采集后4 ℃保存，4 h内完成实验。
主要试剂配制：
DMEM/F12(Dulbecco&s Modified Eagle Media: Nutrient Mixture F-12)培养基：DMEM/F12(Gibco) 12.8 g 粉剂溶于1 L三蒸水中，加入1.2 g NaHCO3，调节 pH值至7.0-7.4，过滤除菌，4 ℃分瓶保存。
胰蛋白酶消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02% 乙二胺四乙酸按 1∶1 例配制。
磷酸盐缓冲溶液( phosphate buffer solution，PBS)：过滤除菌，常温分瓶保存。
细胞冻存液：由50% DMEM、体积分数40%胎牛血清和体积分数10%二甲基亚砜配制。
实验方法：
贴壁法培养脐带间充质干细胞：获取健康足月剖腹产新生儿脐带标本5-10 cm，用D-Hank&s液将标本清洗干净并去除脐动静脉，将脐带组织剪成 1.0-2.0 mm3的小块，组织碎块置于200目筛网，D-Hank&s液冲洗过滤，将组织块以适当密度接种于六孔板，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于细胞培养箱内培养，1周后每3 d补加少量含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。当倒置显微镜下观察组织块周围呈集落生长的成纤维状细胞密度达70%-80%时，去除组织块，添加1 mL培养基继续培养。2 d后将6孔板中的细胞消化传代至T25中，继续培养。当T25中的细胞生长至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%乙二胺四乙酸)将细胞以1∶2或1∶3传代继续培养。
鉴定脐带间充质干细胞表面标志物：取生长状态良好的第3代细胞，0.25%胰蛋白酶(含0.02%乙二胺四乙酸)消化细胞，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，去上清，用PBS洗涤后重复再次离心、重悬。然后用体积分数 95%乙醇固定，分别加入FITC标记的单抗CD29、CD31、CD40、CD44、CD45、CD90、CD105和 HLA-DR，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。
鉴定脐带间充质干细胞生长周期：取生长状态良好的第3代细胞，经胰酶消化细胞后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1&109 L-1，加入预冷的体积分数70%乙醇固定，上机前离心去上清液，加入RNA酶去除RNA，加入碘化丙啶4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。
测定脐带间充质干细胞生长曲线：取生长状态良好的第3代细胞，经胰酶消化细胞后制成单细胞悬液，调整细胞密度为2&103/孔铺至96孔板中，每天取3孔细胞用CCK8检测活细胞数，连续培养7 d。以培养时间为横轴，450 nm处吸光度值为纵轴，绘制生长曲线。
脐带间充质干细胞向成脂细胞分化：取第3代细胞接种于6孔板中，用完全培养基培养细胞至80%-90%融合时，实验组加入成脂细胞诱导液(含体积分数10%胎牛血清，&10 mg/L胰岛素，1 &mol/L地塞米松，0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，100 U/mL青霉素，100 U/L链霉素的LG-DMEM培养液)，对照组加入正常完全培养基。每3 d全量换液1次，连续诱导21 d，油红O染液染色鉴定。
脐带间充质干细胞向成骨细胞分化：取第3代细胞接种于孔板中，用完全培养基培养细胞至80%-90%融合时，实验组加入成骨细胞诱导液(含体积分数10%胎牛血清，&100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L &-甘油磷酸钠，&0.2 mmol/L维生素C，100 U/mL青霉素，100 U/L链霉素的DMEM/F12培养液)，对照组加入正常完全培养基。每3 d全量换液1次，连续诱导28 d，茜素红染液染色鉴定。
脐带间充质干细胞定向诱导成纤维细胞及Ⅰ型胶原的表达：在6孔板板底放置一20 mm&20 mm大小的盖玻片，取生长状态良好的第 3 代细胞，经胰酶消化细胞后制成单细胞悬液接种在6孔板中，24 h后换液分为2组即实验组和对照组，对照组加入正常培养基(LG-DMEM含体积分数10%的胎牛血清)，观察组加入条件培养基(LG-DMEM含体积分数10%胎牛血清、10 &g/L碱性成纤维细胞生长因子、1 mmol/L磷酸维生素C、0.04 mmo/L脯氨酸)进行细胞诱导，3 d后分别对两组细胞进行形态学观察。
免疫细胞化学检测Ⅰ型胶原的表达：实验组及对照组均分别滴加一抗(Ⅰ型胶原蛋白抗体)，按照免疫细胞化学过氧化物酶标记的链霉素抗生物素-过氧化酶连接(SP)法步骤进行操作，所有染色图片均在相同条件下进行。
主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面标志物，诱导细胞向成脂、成骨和成纤维细胞分化，免疫组织化学检测Ⅰ型胶原的表达。
杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
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盆底支持组织主要由韧带、肌肉和筋膜组成，相互作用维持盆腔脏器的正常位置[24] 。其中韧带起着非常重要的作用，但韧带损伤后自我修复能力较差[25] 。韧带成纤维细胞在体外增殖相对较慢，在多次传代后丧失其增殖能力。根据来源不同干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，随着科研水平的不断提高，成体干细胞的培养分化技术逐渐成熟，众多学者将干细胞用于疾病的治疗方面取得了很大的进展。近年来随着组织工程学的进展，干细胞为结缔组织损伤疾病的治疗提供了新的治疗途径。
3.1& 脐带间充质干细胞的生物学特性&&&& 实验通过贴壁法从脐带中分离出间充质干细胞，纯度高，方法可靠，细胞贴壁生长，传至第3代即可得到纯化脐带间充质干细胞。流式细胞仪检测脐带间充质干细胞不表达造血细胞相关抗原CD45、内皮细胞相关抗原CD31；强表达CD29、CD105、CD44、CD90，表明它们是区别于造血细胞的另一类干细胞。同时，它们极低表达于移植物抗宿主病相关因子 HLA-DR、CD40，说明其免疫原性极低，可能适于不同个体之间的移植，这些特性都满足国际细胞协会提出的人类间充质干细胞的最低标准[26] 。
细胞在体内时处于稳定的环境中，但是在体外培养的条件下，让细胞在特定时间、地点、向特定细胞分化就需要特定的微环境[27-28] 。由于没有鉴定脐带间充质干细胞的特异性指标，在体外特定的诱导条件下，脐带间充质干细胞可向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉等多种组织细胞分化的多向分化潜能被认为是最有力的证据[29] ，且细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。实验分离的细胞可在特定的诱导条件下分化为脂肪细胞和骨细胞，证明了该细胞是具有多向分化能力的间充质干细胞。
3.2& 人脐带间充质干细胞定向诱导为成纤维细胞合成Ⅰ型胶原的临床意义&&& 胶原蛋白主要由成纤维细胞或与其来源类似的细胞如成骨细胞等合成，Ⅰ型胶原主要来源于皮肤、骨、角膜、肌腱等。韧带成纤维细胞缺乏特异性的标记性蛋白，但细胞基质中Ⅰ型胶原的表达量是韧带成纤维细胞的重要标志[23] 。
Lee等[30]在培养基中加入结缔组织生长因子使骨髓脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。Liu等[31]将间充质干细胞定植到相互交错的支架材料上，细胞可向韧带样成纤维细胞分化，并且表达韧带相关如Ⅰ型、Ⅲ型胶原 、Tenascin-C等基因。杜尧等[32]的研究表明碱性成纤维细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞分化为成纤维细胞，并且与静脉来源的细胞在细胞形态、合成胶原能力方面无显著统计学差异，即都能在韧带组织上种植并生长。
在治疗女性盆底功能障碍性疾病的临床实践中，实用人工合成网片行&刚性&悬吊常常不尽人意，为避免和减少由于使用人工合成材料导致的侵蚀、排斥、暴露及材料和瘢痕组织的缩变、僵硬等并发症，合理而适当选用合成材料替代盆底薄弱的组织结构，通过固定缺陷部位的支持组织来支撑增生组织的力学构架，加强缺陷组织的承张力度并维持重建盆底的刚度弹性尤为重要。研究表明胶原的代谢异常可能是女性盆底功能障碍性疾病发生的一个原因[33-34] ，实验从细胞水平上观察到脐带间充质干细胞能在外源性细胞因子的作用下诱导为成纤维细胞，并能促进其自身合成胶原能力的增强，对盆底韧带组织的修复作用增强。有动物实验表明，间充质干细胞可在宿主体内存活并修复尿道周围的损伤组织[35-39] 。脐带间充质干细胞向成纤维细胞的诱导为韧带组织工程学种子细胞的选择提供依据，为女性盆底功能障碍性疾病的再生医学治疗技术提供全新的思路，为临床应用干细胞治疗女性盆底功能障碍性疾病奠定了实验基础。
杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
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赵庆华等2011年研究人脐带华尔通胶来源间充质干细胞的特性及向软骨细胞、骨细胞的分化能力。取人的正常分娩或剖腹产胎儿的脐带,酶消化法从Wharton胶中分离干细胞,应用复合胶原酶NB4、dispaseⅡ和透明质酸的组合混合酶消化,检测人脐带来源的间充质干细胞表面标记;分别应用成软骨诱导液、成骨诱导液诱导人脐带来源的间充质干细胞向软骨细胞、骨细胞分化，用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定。结果显示人脐带分离培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,这类细胞间充质干细胞的表面标记CD44、CD105、CD90和D73呈现高表达,而不表达CD45、CD34、CD14、CD19及HLA-DR。向软骨细胞、骨细胞诱导结果提示P3代细胞有向终末软骨细胞、骨细胞分化能力,具有干细胞的特性。人脐带华尔通胶含有丰富的间充质干细胞,易于培养扩增，人脐带来源的间充质干细胞能分化为软骨细胞、骨细胞。
杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
全文链接：
研究亮点: 1 脐带间充质干细胞具有多向分化能力，但其向成纤维细胞分化的研究较少。
2 实验从细胞水平上观察到脐带间充质干细胞能在外源性细胞因子的作用下诱导为成纤维细胞，并能促进其自身合成胶原能力的增强，希望实验结果能为韧带组织工程学种子细胞的选择提供依据。
基金资助：
国家自然科学基金面上项目()；广东省科技厅科研基金项目(4)；广东省自然科学基金博士科研启动项目(粤科基办字[90)；广东省医学科研基金立项课题(粤卫[2008] 84号A2008364)；广东省医学科研基金项目(粤卫[2007]97号A2007338)
杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
全文链接：
Abstract：BACKGROUND: The umbilical cord mesenchymal stem cells possess multipotent differentiation capacity, but less research focus on its differentiation into fibroblasts.
OBJECTIVE: To investigate the capacity of human umbilical cord mesenchymal stem cells differentiating into fibroblasts.
METHODS: Using adherent method, human umbilical cord mesenchymal stem cells were isolated, and flow cytometric analysis of the surface antigen was performed. Passage 3 cells were selected for osteogenic and adipogenic differentiation, and cells differentiated into fibroblasts under the induction of basic fibroblast growth factor.
RESULTS AND CONCLUSION: Adherent stem cells were stably isolated from the umbilical cord. Human umbilical cord mesenchymal stem cells lowly expressed CD31, CD45, CD40, HLA-DR, but strongly expressed CD29, CD90, CD44, CD105. Oil red O staining showed red droplets were full of the cytoplasm after
alizarin red staining showed red calcium nodules after osteogenic induction. After induced by basic fibroblast growth factor, the type I collagen expression was significantly higher than that in the control group. These findings indicate that the adherent human umbilical cord mesenchymal stem cells are reliably isola basic fibroblast growth factor can induce differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into fibroblasts.
杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
全文链接：
Key words：
中图分类号:&
基金资助: 国家自然科学基金面上项目()；广东省科技厅科研基金项目(4)；广东省自然科学基金博士科研启动项目(粤科基办字[90)；广东省医学科研基金立项课题(粤卫[2008] 84号A2008364)；广东省医学科研基金项目(粤卫[2007]97号A2007338)
罗新，博士，主任医师，教授，暨南大学附属第一医院妇产科，广东省广州市
作者简介: 杨一，女，1987年生，湖北省咸宁市人，汉族，暨南大学在读硕士，主要从事妇科泌尿与盆底重建外科方面的研究。
引用本文: &&
新,蒋学风等. 人脐带间充质干细胞体外诱导分化为成纤维细胞[J]. 中国组织工程研究, ): .
Yang Yi,Luo Xin,Jiang Xue-feng et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells are induced in vitro to differentiate into fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, ): .
2.1&脐带间充质干细胞的分离、传代培养结果&& 贴壁法培养的原代细胞7-12 d后可见少量细胞爬出(图1A)，3周左右细胞达80%融合，将细胞消化至T25中继续培养。随着传代次数的增加，细胞渐渐得到纯化，形态较均一。传代至P3时，细胞以长梭形为主，呈成纤维样、漩涡状、放射状贴壁生长(图1B)，且增殖速度明显加快，三四天可传代1次。
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2.2&脐带间充质干细胞的鉴定结果&& 间充质干细胞能表达多种细胞表面标志，但并没有特异性的表面标志物，目前没有统一标准。研究表明，间充质干细胞表面标记物阳性表达的有CD29、CD90、CD44、CD105、CD59等，造血细胞表面标记CD31和CD45和免疫排斥相关标记HLA-DR、CD40等均表达阴性。实验所得细胞经流式细胞仪检测显示结果与文献报道一样(图2)。
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2.3&脐带间充质干细胞的生长周期和曲线& &细胞生长周期显示细胞大部分处于静止期和DNA合成前期(G0-G1期)，少数处于DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)，说明细胞增殖能力很强(图3A)。通过绘制细胞生长曲线，发现细胞生长曲线大致呈&S&形，传代培养细胞1-3 d生长较缓慢，对数生长期为3-5 d，之后进入平台期，横坐标为细胞培养时间(d)，纵坐标为细胞吸光度值(A450 nm，图3B)。
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2.4&细胞向成骨和脂肪细胞诱导的形态变化及其功能&&& 脐带间充质干细胞在成脂细胞诱导液中随着时间的延长，细胞形态逐渐变成短梭形，连续诱导21 d后油红O染色显示胞浆中充满红色的油滴(图4A)，对照组未见明显脂滴形成。脐带间充质干细胞在成脂细胞诱导液中细胞逐渐变成多边形，可见细胞部分呈聚集生长。连续诱导28 d后行茜素红染色，可在细胞密集区见红色的钙结节(图4B)，对照组细胞未见钙结节。
2.5&定向诱导为成纤维细胞并合成Ⅰ型胶原免疫组织化学染色结果& &实验中诱导组在培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子连续培养3 d后行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色，成纤维细胞诱导组的大部分细胞染色阳性，对照组阴性表达(图4C，D)。
930 ? 650: true); max-width: 930">
没有本文参考文献
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