1.一组子宫内膜分泌期不同时间点的标志分子，其特征在于，标志分子包括差异表达蛋白和磷酸化修饰位点，具体如下：

(1)lh_5与lh_2两组内膜间的差异表达蛋白和磷酸化修饰位点

2)差异磷酸化修饰位点

(2)lh_7与lh_5两组内膜间的差异表达蛋白和磷酸化修饰位点

2)差异磷酸化修饰位点

(3)lh_9与lh_7两组内膜间的差异表达蛋白和磷酸化修饰位点

2)差异磷酸化修饰位点

(4)lh_10与lh_9两组内膜间的差异表达蛋白和磷酸化修饰位点

2)差异磷酸化修饰位点

(5)lh_12与lh_10两组内膜间的差异表达蛋白和磷酸化修饰位点

2)、差异磷酸化修饰位点

2.一种如权利要求1所述的标志分子的筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)蛋白质谱所用样本的制备和上机

将样品从冷冻取出，称取适量组织样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末,各组分别加入裂解缓冲液进行超声裂解，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，然后进行蛋白浓度测定；

将步骤1)中各样品蛋白取等量进行酶解，用裂解液将体积调整至一致，缓慢加入tca，涡旋混匀，离心并弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀，晾干沉淀后加入teab，超声打散沉淀，加入胰蛋白酶，酶解过夜，加入二硫苏糖醇(dtt)使其终浓度为2-8mm，50-60℃还原20-40min，之后加入碘乙酰胺(iaa)使其终浓度为5-20mm，室温避光孵育；

3)针对磷酸化修饰蛋白组学，进行修饰富集

将步骤2)获得的肽段溶解在富集缓冲液的溶液中，转移上清液至提前洗涤好的imac材料中，放置于旋转摇床上温和摇晃孵育，孵育结束后依次使用缓冲溶液50％乙腈/0.5％乙酸和30％乙腈/0.1％三氟乙酸洗涤材料1-5次，最后使用氨水洗脱磷酸肽，收集洗脱液并真空冷冻抽干，抽干后除盐，真空冷冻抽干后供液质联用分析；

4)液相色谱-质谱联用分析

将步骤3)制得的肽段用液相色谱流动相a相溶解后使用nanoelute超高效液相系统进行分离；

检索二级质谱数据并设置检索参数；

(2)生物信息学分析，使用kegg通路数据库对基因和蛋白通路进行注释。

3.一种如权利要求2所述的标志分子，其特征在于，具体如下：

步骤(1)-1)中裂解液包含1％tritonx-100，1％蛋白酶抑制剂，1％磷酸酶抑制剂；

步骤(1)-1)中所述样品与裂解液的体积比为1:4；

步骤(1)-2)中所述加入胰蛋白酶的比例为1：50；

步骤(1)-2)中所述二硫苏糖醇(dtt)的终浓度为5mm；

步骤(1)-2)中所述的还原条件为：56℃还原30min；

步骤(1)-2)中所述的室温避光孵育的时间为15分钟；

步骤(1)-3)中所述的富集缓冲液的溶液具体为50％乙腈/0.5％乙酸；

步骤(1)-3)中所述的氨水浓度(质量百分比)为10％；

步骤(1)-4)中所述的流动相a为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液，流动相b为含0.1％甲酸和100％乙腈溶液；

步骤(1)-4)中所述的肽段经由超高效液相系统分离后被注入capillary离子源中进行电离然后进tims-tofpro质谱进行分析，离子源电压设置为2.0kv，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的tof进行检测和分析，二级质谱扫描范围设置为100-1700，数据采集模式使用平行累积串行碎裂(pasef)模式，一张一级质谱采集后进行10次pasef模式采集母离子电荷数在0-5范围内的二级谱图，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30s秒避免母离子的重复扫描；

步骤(1)-5)中所述的设置检索参数，用二级质谱数据使用maxquant1.6.6.0进行检索，检索参数设置：数据库为homo_sapiens_条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(fdr)，并且在数据库中加入常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；

酶切方式设置为trypsin/p；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；firstsearch和mainsearch的一级母离子质量误差容忍度分别设为20.0ppm和20ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为20.0ppm；

步骤(2)所述的对基因和蛋白通路进行注释，具体使用kegg在线服务工具kaas对提交的基因和蛋白进行注释，之后通过keggmapper将注释过的基因和蛋白匹配入数据库中相应的通路中；kegg数据库被用于通路的富集分析；费歇尔精确双端检验方法被用于检验差异表达基因和蛋白，通路富集检验p-value值小于0.05被认为是显著的，最后根据kegg网站通路层级分类方法将这些通路进行分类。

本发明公开了人子宫内膜组织分泌期不同时间点(包括分泌早、中和晚期：LH_2、LH_5、LH_7、LH_9、LH10和LH_12，注射hCG当日计为LH_0)的蛋白提取和处理过程，并进行蛋白质谱和磷酸化修饰质谱，获得分泌期不同时间点的分子表达模式，该分子表达模式可为进一步了解人子宫内膜组织分泌期动态变化提供依据，并有利于子宫内膜植入窗口期的判断和指导辅助生殖技术中的胚胎移植时间。

技术研发人员：颜桂军;孙海翔;刘洋;曹志文;李东
受保护的技术使用者：南京鼓楼医院

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1、第四讲 常系数线性微分方程组的解法（4课时）一、 目的与要求：理解常系数线性微分方程组的特征方程式，特征根，特征向量的概念，掌握常系数线性微分方程 组的基本解组的求法.二、重点：常系数线性微分方程组的基本解组的求法.三、难点：常系数线性微分方程组的特征方程式，特征根，特征向量的概念.四、教学方法：讲练结合法、启发式与提问式相结合教学法 .五、教学手段：传统板书与多媒体课件辅助教学相结合 .六、教学过程：1新课引入由定理3.6我们已知道，求线性齐次方程组（3.8）的通解问题，归结到求其基本解组.但是对于一般的方程组（3.8）, 如何求生基本解组，至今尚无一般方法.然而对于常系数线 性齐次方程组A

2、YdYdx(3.20)其中a是n n实常数矩阵，借助于线性代数中的约当 (Jordan) 标准型理论或矩阵指数，可以使这一问题得到彻底解决.本节将介绍前一种方法，因为它比较直观 .由线性代数知识可知， 对于任一 n n矩阵A,恒存在非奇 异的n n矩阵T ,使矩阵T 1AT成为约当标准型.为此，对 方程组(3.20)引入非奇异线性变换Y TZ(3.21)其中

4、，它恰好是矩阵A关于特征根i的特 征向量，并且由线性方程组(A iE)Ti 0所确定.容易看由， Yi(x),Y2(x),|“,Yn(x)构成(3.20)的一个基本解组，因为它们的朗斯 基行列式W(x)在x 0时为W(0) detT 0.于是我们得到定理3.11如果方程组(3.20)的系数阵A的n个特征根1, 2,|,

6、特征根从上一讲我们已经知道，求解方程组dYdxAY（3.20）归结为求矩阵A的特征根和对应的特征向量问题.现在考虑复根情形.因为 A是实的矩阵，所以复特征根是共辗由 现的，设 1,2i 是一对共辗根，由定理 3.11,对应解是Y（x） e 1xT1,

13、问题，归结到求这 些特征根所对应的特征向量.然而，当矩阵A的特征方程有 重根时，定理3.11不一定完全适用，这是因为，若i是a的 K重特征根，则由齐次线性方程组（A iE）Ti 0所决定的线性无关特征向量的个数i,一般将小于或等于特征根i的重数ki.若i = ki,那么矩阵A对应的约当标准型将呈 现对角阵，其求解方法与 3.5.1情形相同.若iVK,由线性代 数的知识，此时也可以求生 ki个线性无关的特征向量，通常 称为广义特征向量，以这些特征向量作为满秩矩阵T的列向量，可将矩阵A化成若当标准型J1_ _1 _T1ATJm其中未标由符号的部分均为零无素，而01 (i 1,2,HI，m)i是ki

14、阶约当块，kl k2 HI km n, 1, 2,|, m是(3.20)的特征根, 它们当中可能有的彼此相同.J1J 2于是，在变换(3.21)下方程组(3.20)化成JmdZ dx(3.(25)m个可以求解的小方程根据(3.25)的形式，它可以分解成为 组.为了说清楚这个问题，我们通过一个具体重根的例子， 说明在重根情形下方程组(3.20)的基本解组所应具有的结

19、)的二重根，它所对应的(3.26)的两个线性无关解应是如下形式(R3 R4x)e2x其中R3，R4也都是五维常向量.最后，我们还应指由，对于方程组 (3.20),若i是A的一 个ki重特征根，则i所对应的若当块可能不是一块而是几块，但是它们每一块的阶数都小于或等于ki,而且这些阶数的和恰好等于ki.这样，由以上分析我们得到ix定理3.14 设1, 2,|,

20、(i1,2,|,ki)的每一个分量为x的次数不高于ki 1的多项式.取遍所有的i(i 1,2,|,m)就得到(3.20)的基本解组.上面的定理既告诉了我们当A的特征根有重根时，线性方程组(3.20)的基本解组的形式，同时也告诉了我们一种求解方 法，但这种求解方法是很繁的.在实际求解时，常用下面的待 定系数法求解.为此，我们需要线性代数中的一个重要结论 .引理3.1

23、，其余都相同.(3.35)与(3.34)同解的证明请见教材.这样，在方程组(3.31)中，首先由最下面的方程解由 R。, 再依次利用矩阵乘法求生 R1,R2,|,Rkj 1.由引理3.1得知，线性 空间V可分解成相应不变子空间的直和，取遍所有的j(j i2|,m),就可以由(3.34)最下面的方程求生n个线性无 关常向量，再由(3.31)逐次求生其余常向量，就得到 (3.20)的 n个解.记这n个解构成的解矩阵为 Y(x),显然，Y(0)是由(3.34) 最下面的方程求生的 n个线性无关常向量构成，由引理 3.1 的2)矩阵Y(0)中的各列构成了 n维线性空间V的一组基，因 此detY(0)

-x 2x1C1C2C31 .常系数线性微分方程组的解法归结为求生系数阵特征根和特征向量。2 .复特征根对应实变量复值解，要掌握把复值解实值化.3 .特征根有重根时，利用待定系数法求解.P 223补充练习P 223例

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